全 文 ：【收稿日期】2011-12-06
【基金项目】浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室
2010 年开放基金项目( J2010010)
【作者简介】应俊( 1982-) ，女，实验师，从事生物化学与分子生
物学研究，Email: 55009229@ qq． com;李佩珍，通讯
作者，硕士，实验师，从事分子生物学研究，Email:
lpz0522@ 126． com
文章编号: 1005-376X( 2012) 04-0298-04 【论 著】
龙须菜藻红蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究
应俊1，任凭1，邵海刚2，李侠3，应俊林4，张洪勤1，姚蔚1，潘若望3，李佩珍1
( 1．温州医学院 生物实学验教学中心，浙江 温州 325000; 2．温州医学院检验医学院，浙江 温州 325000; 3．
中国人民解放军第 118 医院，浙江 温州 325000; 4．温州大学化学与材料工程学院，浙江 温州 325000)
【摘 要】目的 研究藻红蛋白不同亚基对人直肠癌 SW-480 细胞的抑制作用。方法 通过盐析和 DEAE-Sepha-
rose FF柱层析从龙须菜中获得高纯度藻红蛋白，然后通过脲变性、CM-Sepharose F F阳离子交换层析与透析复性，获得
具活性的 PE亚基，采用 MTT法检测藻红蛋白亚基对 SW-480 细胞的生长抑制作用，流式细胞仪检测藻红蛋白亚基对
SW-480 细胞凋亡的影响。结果 PE亚基对 SW-480 有较强的生长抑制作用，其中以 β 亚基最为显著，当 β 亚基剂量
为 20 μg /mL，作用时间 48 h时，其对 SW-480 细胞的抑制率达 72． 64%。结论 藻红蛋白及其亚基对 SW-480 细胞株
的生长具有较强的抑制作用，β亚基效果最好，预示其具有一定的抗肿瘤潜力。
【关键词】柱层析;藻红蛋白;亚基;直肠癌细胞株 SW-480;细胞凋亡
【中图分类号】R71 【文献标识码】A
Isolation of PE subunits from Gracilaria lemaneiformis and its inhibitory effect on SW-
480 cell line
YING Jun1，REN Pin1，SHAO Hai-gang2，LI Xia3，YING Jun-lin4，ZHANG Hong-qing1，
YAO Wei1，PAN Ruo-wang2，LI Pei-zhen1
( 1． Central Laboratory of Biology，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China; 2． School of Medical
Lab Laboratory Science，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China; 3． 118 Hospital of PLA，
Wenzhou 325000，China; 4． College of Chemistry and Materials Engineering，Wenzhou 325000，China)
【Abstract】 Objective To investigate the induction of apoptosis by phycoerythrin subunits to SW-480 cells in human
rectal cancer． Method A high efficiency and relatively convenient purification system with DEAE-Sepharose FF chromatogram
was devised in the research，and pure PE was obtained． After denaturing the purified PE by urea，the subunits were isolated by
cation exchange chromatography by using CM-sepharose FF，then the subunits were renatured separately． MTT method was
used to assay the inhibitation of PE subunits to SW-480 cells; Flow cytometry was used to test the apoptosis of SW-480 cells．
Result The inhibition of PE subunits to SW-480 cells were obvious． When the dose of β subunits was 20 μg /mL，and the re-
action time was 48 h，the inhibition rate was 72． 64% ． Conclusion The inhibition of PE subunits to SW-480 cells is obvious;
the β subunits is the most potent anti-cancer fragment under the same concentration condition in vitro．
【Key words】 Chromatography; Subunits; Phycoerythrin; SW-480 cells; Cell apoptosis
龙 须 菜 ( Gracilaria lemaneiformis Weber-van
Bosse) 是江蓠属红藻，在我国已经成为继海带和紫菜
之后的第三大重要养殖藻种，资源十分丰富。藻红蛋
白( phycoerythrin，PE) 是大量存在于龙须菜等红藻中
的一种捕光色素蛋白，被广泛地应用于食品、化工产
品和荧光免疫技术等方面，作为新型荧光探针和光敏
剂用于生化检测和光动力学治疗癌症在国内外已得
到广泛关注［1，2］，但是，对藻红蛋白亚基的分离少见
报道。本研究采用离子交换层析技术从龙须菜中分
离出藻红蛋白，获得组成其的三个亚基 α、β 和 γ，结
合 MTT法和流式细胞仪检测不同亚型藻红蛋白诱导
人直肠癌 SW-480 细胞的凋亡差异，以期为龙须菜藻
红蛋白亚基的研究开发提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 细胞株 人结肠癌细胞 SW-480 购于中科院上
海细胞库。于 37 ℃ 5% CO2 培养箱中用含 10%小
牛血清的 DMEM培养基培养。2 ～ 3 d传代 1 次。
1． 2 试剂 龙须菜藻红蛋白亚基由本实验室用新鲜
龙须菜经纯化制得。DMEM 液体培养基、胰酶为美
国 GIBCO公司产品。胎牛血清为杭州四季青生物科
技有限公司生产。四甲基偶氮唑盐 ( MTT) 为 Sigma
892 Chinese Journal of Microecology，Apr． 2012，Vol 24 No． 4
DOI:10.13381/j.cnki.cjm.2012.04.031
公司产品; Anniex V /PI染色试剂盒为联科生物产品。
细胞培养板为 Costar公司生产。
1． 3 方法
1． 3． 1 藻红蛋白的分离纯化 新鲜龙须菜清洗后切
碎，加入液氮反复研磨约 10 min，将研磨后的粉末溶
于 0． 01 mol /L 磷酸盐缓冲液中，离心取粉红色上清
液作为藻红蛋白提取液。于粗提液中加入固体硫酸
铵至饱和度分别为 20%和 60%，离心去上清，沉淀用
磷酸盐缓冲液溶解，透析除盐后，DEAE-Sepharose
Fast Flow柱层析［3］，得到 A565 /A280 ＞ 4． 5 的高纯度藻
红蛋白。
1． 3． 2 藻红蛋白亚基的分离 将纯化的藻红蛋白用
0． 02 mol /L乙酸铵缓冲液( 含 8 mol /L脲，10 mmol /L
巯基乙醇，pH 4． 5) 透析 12 h，作变性处理，离心后取
少量样品做 400 ～ 700 nm可见分光光谱分析，以确认
样品是否变性完全。将变性样品上样于 CM-Sepha-
rose FF柱进行离子交换层析，层析柱用含 8 mol /L脲
和 10 mmol /L巯基乙醇的 0． 02 mol /L乙酸铵缓冲液
预平衡，离子强度梯度洗脱，洗脱液为 0 ～ 0． 4 mol /L
的 NaCl［4］。根据洗脱峰收集样品，对确认得各组分
分别立即用乙酸铵缓冲液透析的方法进行复性。
1． 3． 3 藻红蛋白及其亚基对人结肠癌细胞 SW-480
生长的影响
1． 3． 3． 1 结肠癌细胞 SW-480 的培养 用含有 10%
的热灭活新生牛血清的 DMEM培养基，37 ℃、饱和湿
度、5% CO2 的培养箱中培养至对数生长期后用于实
验。
1． 3． 3． 2 MTT法测定藻红蛋白亚基对 SW-480 细胞
凋亡的影响 取长至 7 ～ 8 成满的细胞消化离心，制
成悬液，每孔 100 μL 接种于 96 孔板，每孔细胞数
10 000个左右。培养 24 h 后加入不同浓度的 20 μL
的 PE、α亚基、β亚基和 γ亚基以获得所需的终浓度
梯度，每个浓度做 5 个复孔，并设不加药物的阴性对
照。分别以不同的时间梯度进行培养后，加入 MTT
溶液，继续孵育 4 h 后，去除上清液，加入 DMSO 150
μL，避光振荡 10 min。用酶标仪于 490 nm 处测各孔
吸光度值( A) 。统计数据后计算各不同浓度药物对
细胞抑制率 ( R ) 和半效抑制浓度 ( IC50) ［5］。R =
［( 1 －实验组 A值) /对照组 A值］× 100%。
1． 3． 3． 3 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集经过不同
时间( 24 h、48 h) ，不同浓度 PE、α 亚基、β 亚基和 γ
亚基处理后的 SW-480 细胞，1 000 r /min 离心 5 min
去上清，用 400 μL PBS重悬洗涤 2 次，离心后用 An-
nexin V-FITC /PI 双荧光染色 10 min，用流式细胞仪
检测各组细胞凋亡情况。
1． 4 数据处理 用 SPSS 13． 0 统计软件，统计数据
采用均数 ±标准差( x ± s) ，组间差别采用方差分析，
P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 藻红蛋白亚基的分离 CM-Sepharose FF 柱层
析可见三个明显的蛋白收集峰，如图 1 所示。其中先
出峰的是 β亚基，接着是 α 亚基，最后是 γ 亚基，在
SDS-PAGE电泳结果显示( 见图 2) 为一条带，亚基分
离成功。
2． 2 藻红蛋白及其亚基的光谱性质 纯化的藻红蛋
白的吸收光谱( 图 3) 可见有三个明显的吸收峰，分别
位于 498、540、566 nm，而且 498 nm 的吸收峰低于
540 nm和 566 nm的吸收峰，为三峰型 I 型 R-藻红蛋
白。复性后 α 亚基最大吸收峰为 566 nm; β 亚基最
大吸收峰为 540 nm，γ 亚基最大吸收峰为 498 nm。
由图证明亚基的复性已经比较成功。
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67
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4,
8
图 1 藻红蛋白亚基的 CM-Sepharose FF柱层析分离
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22+.
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-0+0
5 - . / 0
M:蛋白标准 SM0431; 1:纯化的 PE; 2: α亚基; 3: β亚基; 4: γ亚基。
图 2 藻红蛋白及亚基的 SDS-PAGE
2． 3 MTT法检测藻红蛋白亚基对 SW-480 细胞生长
的影响 MTT 法测定藻红蛋白亚基对 SW-480 细胞
生长的抑制作用结果如表 1，不同亚基对细胞生长的
抑制作用差异显著。γ亚基对细胞的抑制作用最弱，
20 μg /mL浓度的 γ 亚基处理该细胞 48 h 抑制率仅
为 9． 43% ;与相同浓度的 α亚基和 γ亚基相比，β 亚
基对该细胞具有更显著的杀伤效果，具有良好的时间
关系。20 μg /mL浓度的 β 亚基处理该细胞 24 h 抑
992中国微生态学杂志 2012 年 4 月第 24 卷第 4 期
制率为 52． 81%，处理该细胞 48 h 后，抑制率达到
72． 64%，提示 β亚基作为抗肿瘤药物的良好潜力。
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图 3 藻红蛋白亚基的可见光光谱
2． 4 流式细胞仪测定藻红蛋白亚基对 SW-480 细胞
凋亡率的影响 流式细胞仪检测不同亚基的藻红蛋
白在相同浓度下对 SW-480 细胞作用 48 h的凋亡率，
其中明显可见，β亚基处理过的细胞，凋亡率最高( 见
图 4) 。
3 讨论
PE是大量存在于龙须菜中的一种捕光色素蛋
白，是由 α、β、γ 三个亚基组成的多聚体( αβ) 6γ，三
个亚基的分子量分别为18200( α)、19050( β)、33800( γ)。
藻红蛋白亚基与藻红蛋白性质相近，但是亚基分子量
小，更容易直达病灶，与细胞发生作用。本研究通过
脲变性、CM-Sepharose F F 阳离子交换层析与透析复
性得到电泳单一条带的亚基，得到的亚基保持了藻红
蛋白原有的光谱学性质，三者可见区吸收峰在 550 nm
附近，这证明了此方法分离 PE亚基行之有效。
藻红蛋白由于其优良的光学活性，成为开发藻胆
蛋白光敏剂中研究的热点，无论是光动力学方向还是
体内外直接作用于肿瘤细胞株，藻红蛋白在抗肿瘤方
面都有着极佳的前景［6］。李冠武等［7］研究认为藻红
蛋白具有抗肿瘤效应，其机制可能是藻红蛋白在体外
能将光能传递给周围环境中的氧分子，产生如单线态
氧等活性氧组分，它介导的光动力反应能够有效的抑
制肿瘤细胞 DNA合成并杀伤癌细胞［8］。亚基的分子
量小，更容易与细胞表面受体结合，与细胞发生作用，
因此亚基具有更好的抗癌效果。本研究首次选用藻
红蛋白亚基作为抗肿瘤细胞的光敏剂，不但可以避免
血卟啉衍生物等光敏剂具有的皮肤光毒性的缺陷，而
且还能够克服植物性来源的藻胆蛋白大分子易在动
物体内产生抗体的的不利因素。本研究结果显示藻
红蛋白 β 亚基在体外试验中能明显抑制 SW-480 细
胞的生长，具有较强的光动力杀伤效果，在作为光敏
剂抗肿瘤方面有着良好的应用前景。
藻红蛋白 β 亚基对 SW-480 肿瘤细胞有明显的
抑制作用，虽然其具体的机制还有待进一步验证，但
用藻红蛋白作为肿瘤光动力治疗的光敏剂，资源丰
富，价格便宜，具有重要的经济价值和应用前景，加大
对其研究和开发的力度，将对开发海洋药物新资源，
造福于人类，有着重要的意义。
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003 Chinese Journal of Microecology，Apr． 2012，Vol 24 No． 4
表 1 PE及不同亚基在相同浓度下对 SW-480 细胞的抑制作用比较
样品浓度( 20 μg /mL)
24 h 48 h
A490值 抑制率( % ) A490值 抑制率( % )
γ亚基组 0． 93 ± 0． 01a 6． 73 0． 89 ± 0． 15b 9． 43
PE组 0． 74 ± 0． 06a 23． 65 0． 68 ± 0． 07b 29． 64
α亚基组 0． 58 ± 0． 08a 40． 38 0． 41 ± 0． 03b 55． 66
β亚基组 0． 45 ± 0． 07a 52． 81 0． 23 ± 0． 05b 72． 64
空白对照组 1． 04 ± 0． 04 - 1． 06 ± 0． 12 -
注:与空白组比较，aP ＜ 0． 05; bP ＜ 0． 01。
8- 8.
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+2
图 4 流式细胞仪测定藻红蛋白亚基对 SW-480 细胞凋亡率的影响
103中国微生态学杂志 2012 年 4 月第 24 卷第 4 期