全 文 ：《食品工业》2014 年第35卷第 4 期 87
器厂；UV-2102C/PC/PCS 型紫外分光光度计：上海尤
尼柯仪器有限公司；HH-6 型数显恒温水浴锅：江苏
荣华仪器制造有限公司；数显101-2B 型电热鼓风干
燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；S-25 型精密pH
计：上海智光仪器仪表有限公司；日本岛津AUY-220
型分析天平：上海圣科设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 PPO粗酶液的提取
参考Matuschek等方法[3]，略有改动。雪莲果清
洗、去皮、切块，准确称取3 g，迅速加入6 mL 0.05
mol/L pH为6.4（含5%聚乙烯吡咯烷酮）的磷酸盐缓
冲液，冰浴研磨至糊状，温度4 ℃，10 000 r/min离心
20 min，取上清液作为酶提取液，于具塞试管中，冰
浴保存待用。
1.3.2 PPO活性的测定
吸取4.8 mL 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.4）与
0.05 mol/L邻苯二酚1 mL于试管中，混匀，于20 ℃下
保温10 min，迅速加入0.2 mL PPO 提取液，空白加0.2
mL磷酸盐缓冲液。充分混匀，于波长420 nm处测定吸
光度（OD）在3 min内的变化，每秒记录1次。酶活力
单位（U）定义：在上述试验条件下，每分钟内引起
OD值改变0.001所需的酶量为1个酶活性单位。
1.3.3 PPO酶学特性
雪莲果多酚氧化酶特性及非硫护色工艺研究
赵亚，石启龙*
山东理工大学农业工程与食品科学学院（淄博 255049）
摘 要 研究温度、pH、底物浓度对雪莲果多酚氧化酶 (PPO) 特性的影响, 通过单因素试验和正交试验确定雪莲
果非硫护色剂配比。结果表明, 使雪莲果PPO活性失活最适pH为6.4, 温度为20 ℃, 底物浓度为0.05 mol/L, 90 ℃热处
理240 s。抗坏血酸、半胱氨酸、亚硫酸钠、柠檬酸、EDTA-2Na、氯化钠对PPO的抑制作用依次减弱。雪莲果最
佳非硫护色剂组成及质量分数为: 抗坏血酸0.08%、半胱氨酸0.025%。
关键词 雪莲果; 多酚氧化酶; 非硫护色
Study on the Properties of Polyphenol Oxidase and Non-sulfur
Anti-browning of Yacon
Zhao Ya, Shi Qi-long*
School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology (Zibo 255049)
Abstract Effect of temperature, pH value and substrate concentration on the properties of polyphenol oxidase (PPO)
extracted from yacon were investigated. The non-sulfur anti-browning and their mass fraction were also obtained by single
factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal temperature, pH and substrate concentration were 20
℃, 6.4 and 0.05 mol/L, respectively. The PPO activity could be inactived at temperature of 90 ℃ for 240 s. The sequences of
inhibitation effect of reagents on PPO were ascobic acid>cysteine>sodium sulfi te>critic acid>EDTA-2Na>sodium chloride.
The optimal non-sulfur anti-brwoning reagents and mass fraction were ascobic acid 0.08% and cysteine 0.025%.
Keywords yacon; polyphenol oxidase; non-sulfur anti-browning
雪莲果（Smallanthus sonchifolius，Yacon）又名
雪莲薯、亚贡，原产于安第斯山脉。雪莲果富含20多
种人体必需的氨基酸，丰富的矿物质、糖类和大量可
溶性纤维，而且雪莲果含有功能性成分低聚果糖，具
有降低血脂、血糖、血压和清理肠胃等保健功能[1]。
雪莲果加工及贮藏过程中极易发生酶促褐变，多酚氧
化酶（PPO）是导致果蔬酶促褐变的关键酶类，然
而目前食品领域护色多采用亚硫酸盐，对人体健康
极为不利[2]。基于此，研究了雪莲果的多酚氧化酶特
性，并对几种常见的非硫护色剂进行了筛选，得到雪
莲果非硫护色的最优试剂组合，研究结果对雪莲果加
工及贮藏过程中酶促褐变的抑制具有重要的理论参考
价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雪莲果（市售）。
抗坏血酸、L-半胱氨酸、邻苯二酚、EDTA-
2Na、亚硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢-2Na、聚乙烯
吡咯烷酮均为分析纯（AR）；柠檬酸、氯化钠均为
食品级。
1.2 仪器与设备
TGL-16G 型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪
*通讯作者；基金项目：山东理工大学青年教师发展支持计划项目
工艺技术
《食品工业》2014 年第35卷第 4 期 88
1) pH对PPO活性的影响
配置一组0.05 mol/L梯度的pH 5.2～7.8磷酸盐缓冲
液，分别吸取不同梯度磷酸缓冲液溶液4.8 mL于试管
中，加0.05 mol/L的邻苯二酚溶液1 mL，于20 ℃保温
10 min，波长420 nm测定OD值，得出不同pH条件下
PPO活性的变化值。制定PPO活性和pH关系曲线，确
定最适pH。
2) 温度对PPO活性的影响
吸取4.8 mL 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.4）与
0.05 mol/L邻苯二酚1 mL于试管中，混匀，于不同温
度15 ℃~70 ℃（间隔5 ℃）下保温10 min，于波长420
nm测定OD值。制定PPO活性和温度的关系曲线，确
定最适温度。
3) PPO的耐热稳定性
酶液于90 ℃恒温处理初始，30 s，60 s，90 s，
120 s，150 s，180 s，240 s后，立即置于冰浴中冷
却，于波长420 nm下测定PPO的残余酶活性。制定
PPO残余活性和恒温处理时间的关系曲线，确定最佳
钝化时间。
4) 底物浓度对PPO活性影响
吸取4.8mL磷酸盐缓冲液（pH 6.4），分别加入
不同浓度0.01 moL/L，0.02 moL/L，0.03 moL/L，0.04
moL/L，0.05 moL/L，0.06 moL/L，0.07 moL/L，0.08
moL/L，0.09 moL/L的邻苯二酚溶液1 mL，20 ℃保温
10 min于波长420 nm下测定OD值，制定不同浓度底物
和PPO活性的关系曲线。确定最佳底物浓度。
1.3.4 雪莲果非硫护色剂筛选
1) 单因素试验
选用柠檬酸、EDTA-2Na、抗坏血酸、氯化钠和
半胱氨酸等5种护色剂进行单因素试验，以亚硫酸钠
为对照。护色剂及其质量分数如表1所示。取pH为6.4
的磷酸盐缓冲液4.8 mL，分别加入上述不同浓度的护
色剂1 mL，0.2 mL酶提取液，空白用0.2 mL磷酸盐缓
冲液，20 ℃恒温10 min，加入1 mL邻苯二酚溶液，混
匀，立即在420 nm波长下测定OD值。酶活性定义同
1.3.2。
表1 护色剂及其质量分数
护色剂 质量分数 /%
氯化钠 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
柠檬酸 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
EDTA-2Na 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
抗坏血酸 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
L- 半胱氨酸 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
亚硫酸钠 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
2) 正交试验
以抗坏血酸、半胱氨酸为因素，以PPO抑制率为
指标，采用L9(34)正交试验确定非硫护色剂最优组合，
正交试验因素与水平见表2。
表2 正交试验因素与水平
水平 因素A抗坏血酸 / % B 半胱氨酸 / %
1 0.06 0.015
2 0.07 0.020
3 0.08 0.025
PPO抑制率计算见式（1）。
抑制率=（A0-A1）/A0×100% （1）
式中，A0-未添加抑制剂时酶活性；A1-添加抑制
剂时酶活性。
2 结果与分析
2.1 PPO酶学特性
2.1.1 pH对PPO活性的影响
不同pH对雪莲果PPO活性的影响如图1所示。可
以看出，雪莲果PPO的最适pH范围为6.0～6.8，而在
pH 6.4时，酶活性最高。当pH＜6.0或pH＞6.8时，
PPO活性下降，可能原因是：强酸和强碱条件下，底
物分子和酶分子中某些集团（如Cu2+）解离，从而改
变酶分子活性部位的构象和酶于底物形成络合物的浓
度，从而影响酶的活性[4]。研究结果与王琼波等[5]的
研究结论相同，一些学者对茶鲜叶[6]、蜜柚[7]、蟹味
菇[8]、金针菇[9]等的PPO最适pH进行了研究，得到了相
似的结论。史云东等[10]则认为，雪莲果PPO最适pH为
5.8且在pH为6.6时存在同工酶。雪莲果的化学成分、
PPO提取以及PPO活性的测定方法等可能是导致结论
不同的原因。
图1 pH对雪莲果PPO活性的影响
2.1.2 温度对PPO活性的影响
温度对雪莲果PPO活性影响如图2所示。可以
看出，雪莲果PPO最适温度为2 0 ℃，酶活330.00
U·（g·min）-1FW，随着温度的升高酶活性逐渐降
低，温度达到50 ℃时酶活仅为46.67 U·（g·min）-1FW，
温度达到70 ℃时酶基本上失活，因此在果蔬加工中
可采用高温钝化雪莲果PPO的活力。研究结果和史云东
等[10]得出的雪莲果PPO最适温度一致。此外，鸡腿
菇[11]、菊芋[12]、冬瓜[13]、紫甘薯[14]、莲藕[15]、宣木瓜[16]
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等的PPO最适温度也为20 ℃。
图2 温度对雪莲果PPO活性的影响
2.1.3 PPO热稳定性
温度90 ℃下，测定不同处理时间雪莲果PPO的残
留活性，确定90 ℃条件下PPO钝化时间，结果如图3
所示。可以看出，随着加热时间的延长，雪莲果PPO
活性逐渐降低，加热90 s时PPO活性为初始的47%，
150 s时PPO活性仅为初始的17%，240 s时PPO活性几
乎为0，说明雪莲果PPO是一种热敏性酶，受温度影
响较大，其热稳定性较差。雪莲果加工时可采用90
℃，240 s处理有效抑制褐变。
图3 雪莲果PPO的热稳定性
2.1.4 底物浓度对PPO活性的影响
以不同浓度的邻苯二酚溶液为底物，研究底物浓
度对PPO活性的影响结果如图4所示。由图可知，当
底物浓度小于0.05 mol/L时，PPO活性随浓度的升高是
逐渐增大的。当底物浓度达到0.05 mol/L时，酶活性
最大，所以试验选择0.05 mol/L的邻苯二酚溶液为底
物浓度。
图4 底物浓度对雪莲果PPO活力的影响
2.2 雪莲果非硫护色剂筛选单因素试验
抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、柠檬酸、
EDTA-2Na和氯化钠等酶活抑制剂对PPO活性影响
如图5~图9所示。可以看出，EDTA-2Na、氯化钠
和柠檬酸对雪莲果PPO有一定的抑制效果，但相
对于亚硫酸钠抑制效果较差。随着质量分数的加
大，EDTA-2Na在质量分数为0.04%时酶活性下降50
U·（g·min）-1FW，氯化钠在质量分数为3%时酶
活性下降仅14 U·（g·min）-1FW，柠檬酸在质量分
数为1.1%时酶活性下降64 U·（g·min）-1FW。史云
东等[10]研究发现0.6 mmol/L柠檬酸能有效抑制PPO的活
性，但抑制效果低于亚硫酸钠；王琼波等[5]研 究发现
柠檬酸对雪莲果的PPO活性有显著抑制作用，氯化钠
对PPO活性抑制不明显。抗坏血酸和L-半胱氨酸抑制
效果高于亚硫酸钠。随着质量分数的加大，PPO活性
逐渐下降，当抗坏血酸和L-半胱氨酸的质量分数达
到0.1%和0.035%时，酶活性基本受到抑制。考虑到
雪莲果中的氨基酸和抗坏血酸易发生非酶褐变；再
者，高温加热引起抗坏血酸氧化形成的酮化合物与
胺化合物发生非酶褐变[16]。因此，要准确掌握加入
抗坏血酸的添加量，以免实际加工应用时护色作用
变为增褐反应而影响护色效果。目前，果蔬加工制
作中提倡多种抑制剂结合抑制酶促褐变，因此需要
进一步研究多种抑制剂对雪莲果的抑制效果，以期
发现更有效的抑制剂发挥多因素协同作用优化防褐
效果。
图5 EDTA-2Na、L-半胱氨酸对PPO活力的影响
图6 抗坏血酸对PPO活性的影响
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《食品工业》2014 年第35卷第 4 期 90
图7 氯化钠对PPO活性的影响
图8 柠檬酸对PPO活性的影响
图9 亚硫酸钠对PPO活性的影响
2.3 非硫护色筛选的正交试验
非硫护色剂筛选的正交试验安排及结果见表3。
可以看出，影响PPO抑制率的因素主次顺序为：
B、A，即半胱氨酸、抗坏血酸。综合分析并通过试
验验证，得到雪莲果非硫护色剂最佳组合A3B3，即抗
坏血酸质量分数为0.08%，半胱氨酸为0.025%。
表3 正交试验方案及结果
试验号 因素 抑制率 /%A抗坏血酸 / % B 半胱氨酸 / %
1 1 1 86.59
2 1 2 93.90
3 1 3 93.90
4 2 1 78.05
5 2 2 91.46
6 2 3 93.90
7 3 1 92.68
8 3 2 95.12
9 3 3 98.78
k1 91.46 85.77
k2 87.80 93.50
k3 95.53 95.53
R 7.73 9.76
3 结论
1) 使雪莲果PPO活性失活最适底物浓度为0.05
mol/L，pH为6.4，温度为20 ℃，90 ℃热处理240 s，
酶活性基本丧失。
2) 对雪莲果PPO抑制效果由高到低的试剂为：
抗坏血酸、半胱氨酸、亚硫酸钠、柠檬酸、EDTA-
2Na、氯化钠。
3) 雪莲果非硫复合护色最佳组合为：抗坏血酸质
量分数为0.08%，半胱氨酸为0.025%。
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