全 文 ：粮油食品 粮油食品科技 第 19 卷 2011 年 第 2 期
雪莲果多酚氧化酶
活性及褐变控制的研究
史云东1，贾琳1，李祥2，李淑英1，申太波1
(1．玉溪师范学院资源环境学院，云南 玉溪 653100;
2．陕西科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710021)
摘 要:以雪莲果为原料，采用丙酮酸缓冲液提取、硫酸铵提纯法，得到一种活性较高的多酚氧化
酶，并对其活性进行了研究。研究发现:环境温度、介质 pH值、抑制剂和底物浓度对多酚氧化酶的
活性有一定的影响，反映了多酚氧化酶对反应介质的依赖关系，提出在雪莲果加工过程中，可通过
钝化酶活性、抑制酶促反应、驱氧处理和复合抑制等途径控制雪莲果酶促褐变。
关键词:雪莲果;多酚氧化酶;活性;褐变;抑制剂
中图分类号:TS 201． 1 文献标识码:A 文章编号:1007 － 7561(2011)02 － 0046 － 04
Study on activity of polyphenol oxidase of
smallanthus sonchifolius and browing control
SHI Yun － dong1，JIA Lin1，LI Xiang2，Li Shu － ying1，SHEN Tai － bo1
(1． College of Resource and Environment，Yuxi Normal University，Yuxi Yunan 653100;
2． College of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi University of Science ＆ Technology，
Xi＇an Shaanxi 710021)
Abstract:A kind of active polyphenol oxidase was obtained from smallanthus sonchifolius by extraction
and purification． The activity was studied． The result showed that the environmental temperature，pH of
the medium，the inhibitor and the concentration of substrate had some impact on the activity of polyphe-
nol oxidase，which meant that polyphenol oxidase was dependent on reaction medium． The enzymatic
browning can be controlled by passivating the enzyme activity，restraining the enzymatic reaction，dis-
placement of oxygen treatment and so on during process．
Key words:smallanthus sonchifolius;polyphenol oxidase;activity;browning;inhibitor
收稿日期:2010 － 11 － 26
基金项目:云南省自然科学基金项目:茶籽中生物活性物质的提取研
究(编号 2005B0079M) ;陕西省重点实验室项目;咸阳市
科技专项(XK0805 － 2)
作者简介:史云东(1974 －) ，男，云南玉溪人，讲师．
雪莲果，学名菊薯(Smallanthus Sonchifolius) ，原
产南美洲安第斯山脉。雪莲果是菊科多年生草本植
物。植株貌似菊芋，可生长到 2 ～ 3 m高。雪莲果的
食用部分为块根，外形像蕃薯。雪莲果富含果寡糖
(又称为低聚果糖，占干物质的 60% ～ 70%) ，以及
钙、镁、铁、锌、钾和硒等元素［1］。碳水化合物含量
虽高，但不为人体吸收，因此，很适合糖尿病人及减
肥者食用［2］。
雪莲果中含有多酚氧化酶，在加工过程中极易
催化单宁等反应生成褐色产物，降低制品的外观品
质。文章从雪莲果中多酚氧化酶的活性研究出发，
探讨了环境条件对多酚氧化酶的影响，提出了抑制
雪莲果制品褐变的途径，为雪莲果加工提供了理论
依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
雪莲果:市售;丙酮、磷酸盐缓冲液、磷酸盐 －柠
檬酸缓冲液、邻苯二酚、硫酸铵、聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)、柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠，均购于昆明
化学试剂公司。
HC －3018R型高速冷冻离心机:科大创新股份
有限公司中佳分公司:721 型可见光分光光度计:上
海菁华科技仪器有限公司;TH － 86 － 340 － L 型超
低温电冰箱:北京天地精仪有限公司;BCD － 205F
型电冰箱:伊莱克斯公司;AR1140 型电子天平:梅
特勒—托利多仪器上海有限公司制造;恒温水浴锅:
金坛市大地自动化仪器厂;S1 － A4 型 pH 计:上海
菁华科技仪器有限公司。
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粮油食品科技 第 19 卷 2011 年 第 2 期 粮油食品
1． 2 试验方法
1． 2． 1 多酚氧化酶的制备及纯化
取 100 g 新鲜雪莲果用榨汁机捣碎后，加入 10
g PVP再加入 4 倍体积的冰丙酮在 － 20 ℃冷冻过夜
提取，室温解冻后再用布氏漏斗抽滤，得到的残渣用
冰丙酮反复冲洗(直到出现白色粉末)。将所得的
丙酮粉于低温下保藏(以上操作均在冰浴上进行)。
取 1 g丙酮粉加入 pH为 5． 5 的磷酸盐 －柠檬酸缓
冲液搅拌 10 min，再用冷冻离心机离心 20 min
(4000 r /min) ，过滤得滤液即为粗酶液(低温下保藏
备用)［3 － 4］。
在多酚氧化酶粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度
达到 30%进行沉淀，然后在高速冷冻离心机中 4 ℃
下以 7500 r /min离心 20 min，沉淀，用不同 pH值的
0． 05 mol /L磷酸盐缓冲溶液溶解，再根据溶液体积
加入硫酸铵使其饱和度达 50%，再次在高速冷冻离
心机中 4 ℃下以 7500 r /min 离心 20 min;然后再根
据溶液体积加入硫酸铵使其饱和度达到 80%，进行
同样的处理。
1． 2． 2 多酚氧化酶活性的测定
取 0． 2%的邻苯二酚溶液(用 0． 2 mol /L、pH 7． 4
磷酸缓冲液配制)5 mL 于具塞试管中，并在 25 ℃下
保温 10 min，加入备测酶液 0． 5 mL，混匀后倒入 1 cm
的比色皿中，在 415 nm处测吸光值，酶液加入后开始
计时，记录 1 min 时的 OD415 nm值。空白用 5 mL 磷
酸缓冲液代替邻苯二酚溶液。一个相对酶活性单位
(U)定义为:在上述测定条件下，每分钟引起吸光度
改变 0． 001单位所需酶量［5］。
1． 2． 3 多酚氧化酶酶学性质研究
1． 2． 3． 1 底物浓度对多酚氧化酶活性影响及 Km、
Vm 值的测定
配制一系列不同浓度(0． 01 ～0． 09 mol /L)的邻苯
二酚溶液(用 0． 2 mol /L、pH 5． 8磷酸缓冲液配制)，取
上述溶液5 mL于具塞试管中，按照1． 2． 2的方法，测定
不同底物浓度影响下多酚氧化酶的酶活性［6］。并以
Lineweawer －Beak 作图法求出 Km、Vm 值。
1． 2． 3． 2 多酚氧化酶的耐热稳定性
将备测酶液在 90 ℃恒温水浴中处理一定时间
(1 ～ 5 min，间隔 1 min)后，立即置于冰浴中冷却，然
后在室温下测定多酚氧化酶的残余酶活性。
1． 2． 4 外界环境对多酚氧化酶活性的影响
1． 2． 4． 1 pH对多酚氧化酶活性的影响
配制一系列不同 pH 的磷酸缓冲液(0． 2 mol /
L，pH 3． 2 ～ 7． 8，梯度为 0． 2) ，分别用上述缓冲液配
制 0． 2%邻苯二酚溶液，并取 5 mL 于具塞试管中，
按照 1． 2． 2 的方法，测定不同 pH 影响下多酚氧化
酶的活性。
1． 2． 4． 2 温度对多酚氧化酶活性的影响
取 0． 2%的邻苯二酚溶液(用 0． 2 mol /L、pH
5． 8 磷酸缓冲液配制)5 ml 于具塞试管中，并在某
一温度(10 ～ 70 ℃，梯度为 5 ℃)下保温 10 min
后，按照 1． 2． 2 的方法，测定不同温度影响下多酚
氧化酶的酶活性。
1． 2． 4． 3 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
用 0． 2 mol /L、pH 5． 8 的磷酸缓冲液，配制不
同浓度(0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、0． 30、0． 35、
0． 40、0． 45、0． 50、0． 55、0． 60g /L)的抗坏血酸、亚
硫酸氢钠、柠檬酸、抑制剂溶液。将上述不同浓度
的抑制剂溶液 1 mL 加入到 0． 5 mL 备测酶液中，
摇匀后，倒入已保温(20 ℃)10 min的邻苯二酚溶
液中，混匀后倒入 1 cm 的比色皿中，迅速测定多
酚氧化酶(多酚氧化酶)的残余酶活性。
2 结果与分析
2． 1 多酚氧化酶酶学性质研究
2． 1． 1 底物浓度对多酚氧化酶活性影响及 Km、
Vm 值的测定
底物邻苯二酚的浓度对多酚氧化酶活性影响的
实验结果见图 1。
图 1 底物浓度对 PPO活性的影响
从图 1 可以看出，底物浓度对反应初速率的影
响很大，在浓度较小时呈直线上升，当底物浓度继续
增加时反应速度增加缓慢，不再呈直线关系，最后趋
于极限值。这是由于在底物浓度较低时，并非所有
的酶分子都能与底物相结合。随着底物浓度增加，
越来越多的酶分子都与底物结合，此时酶被底物饱
和，进一步增加底物浓度也不能提高酶的活性。变
化曲线类似于米氏方程所描述的初速率随底物浓度
的变化规律，因此，对实验结果处理:以 1 /V 为纵座
标，1 /［S］为横座标作图进行验证。
根据 Lineweaver － Burk 作图法，以 1 /V 为纵座
标，1 /［S］为横座标作图，得图 2。
图 2 1 /V － 1 /［S］双倒数图
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粮油食品 粮油食品科技 第 19 卷 2011 年 第 2 期
由图 2 可以看出，雪莲果多酚氧化酶酶活性反
应动力学符合米氏方程。根据直线斜率和纵轴截
距，可求得该反应的米氏常数 Km = 0． 1927 mol /L，
最大反应速率 Vmax = 1． 25 U /min，相应的米氏方程
为 V =1． 25 ×［S］/(0． 1927 +［S］)。Km 是酶催化
反应的一个重要特征常数，Km 值代表反应速度达
到最大速度一半时的底物浓度，反应酶与底物的亲
合力，Km 越小，酶与底物的亲合力越大。
2． 1． 2 多酚氧化酶的耐热稳定性
多酚氧化酶活性的热稳定性实验结果见图 3。
图 3 PPO活性的热稳定性(90℃)
由图 3 可知，高温热处理能迅速钝化多酚氧化
酶的活性，在 90 ℃的热处理条件下，多酚氧化酶的
失活时间为 2 min。据报道，蕨菜多酚氧化酶的耐热
性比雪莲果较差，番石榴多酚氧化酶的耐热性比雪
莲果稍强［7 － 8］。总的来说，多酚氧化酶的耐热性都
较差，一般在 70 ℃以上的高温处理后，酶活性显著
降低。因此雪莲果加工过程中可采用热烫钝化多酚
氧化酶的酶活性，抑制褐变的发生。
2． 2 外界环境对多酚氧化酶活性的影响
2． 2． 1 pH对多酚氧化酶活性的影响
pH值对雪莲果多酚氧化酶的影响见图 4。
图 4 pH对 PPO活性的影响
雪莲果多酚氧化酶在 pH 值小于 3． 0 时几乎没
有活性，这是因为在强酸条件下，酶中的 Cu2 +解离
出来，使酶失活;随 pH 值的增加，雪莲果多酚氧化
酶活性逐渐增大，当 pH 值为 5． 8 时，活性达到最
大，pH 6． 0 时活性降低，pH 6． 6 时活性再次升高，以
后又下降，这是因为在碱性条件下，Cu2 +易转变成
不溶性氢氧化铜而与酶脱离使酶失活，图 4 出现双
峰现象，说明雪莲果多酚氧化酶可能具有同工酶，其
中雪莲果多酚氧化酶的最适 pH为 5． 8，这一结果与
莲藕、甘薯、莴苣、猕猴桃、鸭梨、冬瓜的多酚氧化酶
最适 pH 值基本一致［9］。
2． 2． 2 温度对多酚氧化酶活性的影响
温度对多酚氧化酶活性的影响如图 5 所示。
图 5 温度对 PPO活性的影响
从图 5 可知，雪莲果中多酚氧化酶最适温度为
20 ℃，在 10 ～ 40 ℃范围内，多酚氧化酶表现出较高
的活性，当温度 ＜ 10 ℃或 ＞ 40 ℃时，多酚氧化酶的
活性显著降低，温度到 70 ℃时酶基本失活，这是因
为多酚氧化酶是一种蛋白质，不适宜的温度会破坏
活性部位三维结构的完整性，而它又是保持酶活性
的关键。可见，低温和高温都可抑制酶活性。
2． 2． 3 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响
按 1． 2． 4． 3 进行实验，结果见图 6。
图 6 抑制剂对 PPO活性的影响
多酚氧化酶是一种含铜的酶，该酶的抑制剂可
以有两种类型:一种是与酶中铜起作用抑制酶活性;
另一种是通过影响底物(如酚类化合物)与酶活性
中心结合部位的作用而抑制酶的活性。实验主要对
不同浓度的抗坏血酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸抑制剂溶
液，对多酚氧化酶的抑制作用进行研究。由图 6 可
以看出:抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸对多酚氧化酶
均有明显抑制效果，浓度为 0． 45 mmol /L 的抗坏血
酸，0． 55 mmol /L的亚硫酸钠和 0． 6 mmol /L 柠檬酸
能有效抑制多酚氧化酶的活性。
多酚氧化酶是含铜蛋白质，柠檬酸是一种有机
酸，它既有还原性又是螯合剂，一方面能与底物的氧
化产物邻苯二醌反应生成邻苯二酚，阻止了邻苯醌
进一步氧化、聚合成黑色素;另一方面，多酚氧化酶
的催化活性中心为铜离子，Richrd 等认为氧是通过
与铜离子形成桥式键合在酶上，柠檬酸分子具有三
个羧基，羧基氧与酶中铜离子发生配位反应，抑制了
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粮油食品科技 第 19 卷 2011 年 第 2 期 粮油食品
铜离子的催化活性，所以柠檬酸多酚氧化酶活性具
有抑制作用［10］。抗坏血酸对多酚氧化酶活性的抑
制机理主要是将 Cu2 +还原成 Cu +，同时抗坏血酸具
有还原性，能把酶促反应的中间产物邻苯醌还原成
邻苯二酚而抑制褐变，它甚至可以被多酚氧化酶直
接氧化，起到竞争性抑制剂的作用;抗坏血酸对醌类
的还原能力在很大程度上取决于其浓度:当使用抗
坏血酸的浓度低时，在还原醌的过程中很快被消耗
掉，只能在较短时间内抑制有色物质的形成;当使用
抗坏血酸的浓度高时，抗坏血酸可以将生成的醌类
不断还原，重新供给多酚氧化酶底物，直到多酚氧
化酶反应失活。上述整个过程是不可逆的。在 50
～ 60 ℃范围内抗坏血酸 15 min能显著使酶褐变。
3 雪莲果加工过程中酶促褐变的控制途径
在雪莲果体内，多酚氧化酶主要存在于完整细
胞的质体和微体中，而多酚氧化酶的底物存在于液
泡中，处于潜伏状态，在完整的细胞中作为呼吸传递
物质，在酚醌之间保持着动态平衡，不发生酶促褐
变。当新鲜的雪莲果在贮运加工过程中组织被损
伤，氧大量侵入，酶原被激活，酚类物质经酶的催化
作用氧化为醌类物质，从而引起褐变反应。由此可
见，多酚氧化酶酶促褐变必须具备 3 个条件:酚类
底物、多酚氧化酶和氧，三者缺一不可。由多酚氧化
酶酶促褐变的形成条件不难发现对其抑制可从减少
酚类物质含量、控制多酚氧化酶活性、降低氧浓度三
方面考虑，生产上只要控制其中一个条件或抑制多
酚氧化酶酶促反应的进行，就可以抑制多酚氧化酶
酶促褐变。但在控制酶促褐变的实践中，除去底物
的途径可能性极小，现实的方法主要从酶活性和酶
促反应的控制和氧气的控制等方面入手。
3． 1 钝化酶活性
钝化多酚氧化酶活性是控制雪莲果酶促褐变的
一条主要途径，雪莲果多酚氧化酶钝化方法主要有:
热处理、酸化剂处理、鳌合剂处理。
多酚氧化酶是一种以铜离子为辅基的金属蛋
白，高温易使蛋白质变性，酶活便降低或完全失活，
因而热处理可以控制酶促褐变。由图 3 可知，雪莲
果多酚氧化酶在 90 ℃的热处理条件下，多酚氧化酶
的失活时间为 2 min。因此只需将雪莲果在≥90 ℃
热处理条件下处放 2 min以上即可达到钝化多酚氧
化酶酶活性的目的;由于雪莲果多酚氧化酶的最适
宜 pH值为 5． 8，在 pH 值小于 3． 0 时几乎没有活性，
故可通过使用酸化剂处理降低雪莲果组织的 pH 值
使之偏离多酚氧化酶的最适 pH 而使酚酶失活或被
钝化，从而抑制酶促褐变;螯合剂通过多酚氧化酶中
的铜离子形成配位化合物使酶被钝化。常用的鳌合
剂有 EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸、植酸(肌醇六
磷酸)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)等。
3． 2 抑制酶促反应
抑制雪莲果多酚氧化酶方法主要有:酸抑制剂、
低温、驱氧等方法。
由图 6可知:抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸对多酚
氧化酶均有明显的抑制效果，浓度为 0． 45 mmol /L的
抗坏血酸，0． 55 mmol /L的亚硫酸钠和0． 6 mmol /L柠
檬酸能有效抑制多酚氧化酶的活性;雪莲果多酚氧化
酶的最适反应温度 20 ℃。将新鲜雪莲果或加工产
品进行低温冷藏，由于降低温度可以降低该酶促催
化反应的反应速率，能有效延缓褐变的产生;氧是多
酚氧化酶酶促褐变不可缺少的条件，除去氧或降低
环境中氧含量可有效地抑制多酚氧化酶酶促褐变的
发生。生产上可利用抽气、被膜、气调等方法降低或
驱除环境中的氧浓度。
4 结论
针对从雪莲果中提取的多酚氧化酶，对其特性进
行研究，以邻苯二酚为底物，测定了不同温度、pH值、
底物浓度和抑制剂对多酚氧化酶活性的影响。结果
表明，雪莲果多酚氧化酶的最适温度为 20℃，最适
pH值为5． 8;雪莲果多酚氧化酶的米氏方程符合单底
物酶促反应动力学，相应的动力学参数为 Km = 0．
1927 mol /L，Vmax =1． 25 U/min，抗坏血酸、亚硫酸氢
钠、柠檬酸对多酚氧化酶有一定的抑制作用。
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