全 文 ：海南位于我国大陆南端， 属热带季风气候， 光、
热、 水资源丰富， 具有优越的生态环境， 是热带、 亚
热带生物生长繁衍的 “天堂”。 但这一得天独厚的自
然条件也使海南省成为易遭受外来生物入侵的区域之
一， 成为外来植物入侵的重灾区。 通过引种逸为野生
和无意间带入等途径进入海南省的外来入侵植物达
35科、104属、141种[1]。 假臭草[Eupatorium catari-
um Veldkamp (Praxelis clematidea R.M.King)]， 属
菊科泽兰属植物， 原产南美， 现散布于东半球热带
地区。 国内是20世纪80年代在香港首次发现， 目
前主要于华南的热带和亚热带地区， 在海南、 广
东、 福建、 澳门、 台湾等地广泛分布。 由于假臭草
曾被误认为是藿香蓟或熊耳草， 单家林等推测 90
年代末在海南各地已有大片分布[2]， 但海南首次记
录却是 2004年[3]。 作者调查发现， 目前假臭草在
海南全省均有分布， 最容易入侵的生境是公路边，
海南假臭草叶斑病菌分离及生物学特性①
杨 叶 1)② 张 宇 1) 王兰英 1) 王 萌 1) 李超萍 2)
(1 海南大学环境与植物保护学院 海南海口 570228；
2中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南儋州 571737)
摘 要 从野外自然感病的假臭草中分离到一致病菌株J4B， 经致病力测定、 菌落形态、 培养性状观察及rDNAITS
序列分析表明： J4B的致病力强， 发病症状明显， 菌落呈白色至黄色、 绒毛状、 边缘整齐， 生长速率为0.98mm/d，
不产孢， ITS序列长622bp。 生物学特性研究表明： 该菌以连续黑暗培养对菌丝生长最好， 最适温度为30℃， 55℃
30min菌丝死亡， 最适pH值为6， 最佳培养基为PDA和PSA培养基， 最佳碳源和氮源分别是半乳糖和硝酸钠。
关键词 假臭草 ； 叶斑病 ； ITS； 生物学特性
分类号 S45
Isolation and Biological Characteristics of Leaf Spot Pathogen of
Eupatorium catarium in Hainan
YANG Ye1) ZHANG Yu1) WANG Lanying1) WANG Meng1) LI Chaoping2)
(1 Environment and Plant Protection College, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
2 Environment and Plant Protection Institute, CATAS, Danzhou, Hainan 571737, china)
Abstract A pathogen (J4B) isolate from the diseased leaves of Eupatorium catarium which was collected
in the fields of Hainan province. Based on pathogenicity test, morphological observation of colonies,
culture characteristics, rDNA ITS sequence analysis. The isolate J4B with high pathogenicity against
Eupatorium catarium, symptoms was special, on PDA medium the colony is white and yellow, fluffy, neat
edge, growth rate is 0.98 mm/d, no condia, ITS sequence length is 622 bp. The biological characteristics
test result showed that the optimum light conditions was continuous darkness for the growth of J4B, the
optimum temperature was 30℃ , the optimum pH was 6, the lethal temperature was 55℃ remaining 30
min, the optimum medium were PDA and PSA, the optimum C source and N source were Galactose and
NaNO3.
Keywords Eupatorium catarium ; leaf spot ; ITS ; biological characteristics
① 基金项目： 海南省自然科学基金项目(No.807032)； 海南大学自然科学基金项目(No.hd09xm52)。
收稿日期： 2012-03-21； 责任编辑/凌青根； 编辑部 E-mail： rdnk@163.com。
② 杨 叶(1970～)， 女， 硕士， 副教授。
Vol．32, No．6
2012年6月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第32卷第6期
Jun． 2012
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2012年6月 第32卷第6期热带农业科学
并在农田、 人工草地、 果园、 幼龄胶园及荒地等形
成浓密的植丛， 在局部区域内甚至覆盖了所有地面
及其地上物， 成为优势种， 其危害在很多地区甚至
超过了飞机草， 已成为海南的最具危险的外来入侵
杂草之一[4-5]， 对农业生产、 生态环境造成严重破
坏， 并使海南独有的景观特征受到影响。
假臭草繁殖快， 竞争力强， 并且分泌化感物质
抑制、 排斥其它植物， 化学防除很难有效控制其迅
速蔓延。 杂草的生防真菌是一类能够有效侵染有害
植物并在一定程度上控制其生长或繁殖的植物病原
真菌， 对靶标具有持续的控制作用， 可以利用孢
子、 菌丝及代谢产物开发微生物除草剂， 是杂草综
合防治的重要基础。 通过生物防治技术的研发， 寻
找安全、 高效、 持效及对环境友好的新途径以控制
外来入侵杂草的危害具有非常重要的意义。 本项目
针对外来入侵植物假臭草进行了病害调查， 2010
年在海南省临高县多文一处地势低洼的荒地， 发现
一片自然感病的假臭草， 其发病症状特别， 发病比
较严重， 病叶发黄卷缩且植株矮小， 于室内分离获
得了一种强致病性的真菌。 本文就致病真菌的分
离、 培养及鉴定等开展基础研究工作， 旨在筛选高
致病力菌株， 为假臭草的生物防治奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 病原菌的分离、 致病力测定及培养性状观察
1. 1. 1 病原菌的分离
从野外调查采集自然发病的假臭草， 记录典型
的发病症状， 采用常规的组织分离法分离培养、 纯
化及回接， 按柯赫法则验证确定为致病菌。 将纯化
后的菌株接种在PDA斜面上培养7d后备用。
1. 1. 2 致病力测定
从野外采集健康假臭草幼苗移植到花盆， 移植
2周后备用。 部分植株做活体接种用， 部分剪下叶
片做离体测定。 将病原菌打菌饼(直径为 0.5cm)接种
于叶片上， 接 20～25个叶片。 对照接无病原菌的
培养基琼脂块， 在室温(25～30℃)保湿培养， 每天观
察发病症状， 5d后计算发病率和病情指数。 病情
分级标准： 0级为不发病； 1级为出现水渍状小斑
点， 直径小于 5mm； 2级为病斑直径 6～10mm； 3
级为病斑直径 11～15mm； 4级为病斑直径达 16～
20mm； 5级为病斑直径＞20mm。
1. 1. 3 菌株形态特征观察
将菌株接种于PDA平板， 25℃下培养7d后观
察记录菌落形态、 颜色、 气生菌丝生长状况、 是否
产孢及孢子形态等， 提供形态学鉴定的依据。
1. 2 病原菌 rDNA-ITS序列分析
采用 CTAB法提取病菌基因组 DNA[6]。 用引物
ITS1(5′→3′TCCGTAGGTGAACCTGCGC)和 ITS4(5′→3′
TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增病菌 rDNA-ITS片段。
PCR反应体系为： 10×PCR缓冲液2.5μL， 10mmol/L
dNTP1μL， 10pmol/μL各引物溶液 1μL， 模板 DNA
10～100ng， TagDNA聚合酶1.0U， 加无菌水至25μL。
PCR循环参数为： 94℃30s、 58℃30s、 72℃1min，
35个循环； 最后 72℃延伸 10min。 PCR产物回收
和连接克隆载体均按试剂盒说明书进行。 扩增产物
克隆后挑取3个阳性克隆， 送北京三博远志生物技
术有限责任公司进行序列测定 。 测序结果登录
Genebank， 进行BLAST同源序列比较分析。
1. 3 生物学特性测定
1. 3. 1 光照
取直径 5 mm的菌饼， 放在 PDA平板的中央，
置于 25℃恒温培养箱中， 分别采用连续光照、 光
暗交替和连续黑暗 3种光照条件连续培养。 5d后
用十字交叉法测量菌落直径。 每个处理设 3个重
复， 试验重复 3次。 应用 SPSS17.0统计软件， 采
用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
1. 3. 2 温度
将菌饼移至PDA平板上， 分别置于温度为 20、
25、 30、 35、 40℃下自然光照培养 ， 其它处理同
1. 3. 1。
菌丝致死温度测定： 移取3个菌饼到无菌试管
中， 加入2mL灭菌水， 置于40、 45、 50、 55、 60℃
的恒温水浴锅中， 先将试管预热 1min后再计时，
分别加热10、 20、 30、 40、 50和 60min， 取出后立
即在冰水中冷却至室温， 每处理重复3次。 将处理
后的菌饼接种到 PDA平板上， 置于 25℃恒温培养
箱中培养5d后， 目测镜检菌丝生长状况。 菌丝生
长用 “＋” 标记， 不长为 “－”。
1. 3. 3 pH值
用 1mol/L的 NaOH和 1mol/L的 HCl， 将 PDA
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杨 叶 等 海南假臭草叶斑病菌分离及生物学特性
培养基的 pH值分别调节为 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10，
制成不同pH值的固体平板， 其它处理同 1. 3. 1。
1. 3. 4 培养基
燕麦片琼脂培养基(OMA)、 淀粉琼脂培养基(SYA)、
玉米粉琼脂培养基(CA)、 查氏培养基(Czapek)、 麦芽汁
琼脂培养基(WBSA)、 马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、 马
铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)， 上述培养基按常规方
法配制[7]； 假臭草组织汁培养基[ESA： 100g假臭草新鲜
嫩叶(去柄)， 20g蔗糖， 20g琼脂， 加水至 1000mL]。 其它
处理同 1. 3. 1。
1. 3. 5 碳源与氮源
碳源测定时以 PA作为基础培养基(ck)[8]， 碳
源分别以 20g/L量加入。 碳源种类： 葡萄糖、 蔗
糖、 果糖、 半乳糖、 木糖、 麦芽糖、 甘露醇、 甘油和
肌醇。 氮源测定时以PDA为基础培养基(ck)， 碳源
分别以 5 g/L量加入， 氮源种类： 硝酸钠、 氯化
铵、 蛋白胨、 蛋氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸和磷酸氢
二铵， 其它处理同 1. 3. 1。
2 结果与分析
2. 1 病害症状及致病性测定
叶片上的发病症状非常特别， 均从叶尖叶缘处
开始发病， 初期病斑呈浅黄色至黄褐色， 病健交界
处有明显的黄边(图 1a)， 然后病斑逐渐向叶片中
央扩展， 颜色加深变为黑色； 发病植株矮小、 颜色
发黄， 发病严重时叶片类似镶上一条黑花边， 叶片
卷缩， 最终变软腐烂(图1b)。
致病性测定表明： 发病初期病斑呈水渍状， 渐
渐变为褐色 ， 后期呈黑色腐烂(图 2)。 发病率
100%， 病情指数为86.7。
2. 2 病原菌的培养性状与 rDNA-ITS序列分析
2. 2. 1 病原菌培养性状观察
J4B菌株在PDA培养基上平均生长速率为0.98
mm/d。 菌落初期为白色， 后期菌落正面隐约可见黄
色， 背面呈黄色至黄褐色， 菌落紧密呈绒毛状， 边
缘整齐(图3)； 菌丝有分隔； 培养20d以后， 未见
产孢及其它结构。
2. 2. 2 病原菌 rDNA-ITS序列分析
采用 CTAB法提取 J4B菌株的基因组 DNA后，
用引物 ITS1和 ITS4进行 PCR扩增， 得到大小约
0.6kb的扩增条带。 扩增产物克隆后挑取3个阳性
克隆测序， ITS序列长 622bp， 提交 GenBank， 登
录号为JN709463， 并进行 Blast搜索和比对分析，
与 J4B菌株 ITS序列的大小接近且同源性最高为
96%， 是子囊菌 Ascomycotina sp.。 通过形态及rDNA
-ITS序列分析只能鉴定为 Ascomycotina sp.， 该菌
也很有可能是新种， 相关研究还有待展开。
2. 3 生物学特性测定结果
2. 3. 1 光照
图 1 假臭草叶斑病， a： 发病初期， b： 发病后期
图 2 J4B菌株致病性测定
图 3 J4B菌株的菌落形态
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2012年6月 第32卷第6期热带农业科学
表 6 不同碳源对菌株 J4B菌丝生长的影响
碳源种类 菌落直径/cm 菌落生长状况
ck 4.27d 较稀疏
蔗糖 4.70ab 浓密
葡萄糖 4.77ab 浓密
果糖 4.67Cb 较浓密
半乳糖 4.86a 浓密
木糖 4.45c 较浓密
麦芽糖 4.28d 较浓密
甘露醇 4.78ab 浓密
丙三醇 4.50c 较浓密
肌醇 4.83ab 较浓密
以连续黑暗培养时菌丝生长速率最快、 菌落直
径最大， 与连续光照处理存在显著差异， 但菌丝较
为稀疏(表1)。
2. 3. 2 温度
供试的5个温度之间， 菌丝生长均存在显著差
异。 25～30℃均适宜菌丝生长； 最适温度为 30℃；
40℃时菌丝生长则严重受阻， 菌落很小且菌丝非常
稀薄。 见表2。
致死温度的测定表明， 60℃下所有处理菌丝均不
能生长， 在55℃30min菌丝即死亡， 此为菌丝的致
死温度(表3)。 这个菌还是比较耐高温的。
2. 3. 3 pH
pH4～10范围内菌丝均能生长， 表明该菌对酸
碱有较强的适应能力。 其中， 最适宜生长的是pH6，
菌落大小及菌丝生长均为最好； 其次是pH5， 表明
弱酸条件更有利于病菌的生长； 以pH10时菌丝长
势最差。 见表4。
2. 3. 4 培养基
供试培养基中以 PDA和 PSA对菌丝生长最好，
生长速度快且菌丝生长比较浓密， 与其它培养基之
间达显著差异； 其次是 OMA、 CA及 WBSA， 生长速
度比较快； 以 Czapek培养基对生长最不利， 菌落
直径小且菌丝最为稀疏(表5)。 所有供试培养基培
养20d后均未见分生孢子及其它结构。
2. 3. 5 碳源及氮源
供试所有碳源均有利于 J4B菌丝生长(表 6)，
除了麦芽糖与不加碳源的对照(ck)之间没有达到显
著差异外， 其它处理与对照相比都存在显著； 最适
宜的碳源有半乳糖、 肌醇、 甘露醇、 葡萄糖及蔗糖，
表 1 不同光照处理对菌株 J4B菌丝生长的影响
光照条件 菌落直径/cm 菌丝生长状况
连续光照 4.60 b 较浓密
自然光 4.75 b 浓密
连续黑暗 5.08 a 稀疏
说明： 小写字母表示 ɑ＝0.05的显著水平， 下相同。
表 3 不同温度处理对菌株 J4B菌丝生长影响
温度/℃ 菌落直径/(cm)菌丝生长状况
20 3.47 d 较稀疏
25 4.38 b 浓密
30 5.40 a 浓密
35 4.12 c 稀疏
40 1.24 e 稀疏
说明： “＋” 菌丝生长， “－” 菌丝不生长
温度
/℃
处理时间/(min)
10 20 30 40 50 60
40 + + + + + +
45 + + + + + +
50 + + + + + +
55 + + - - - -
60 - - - - - -
CK + + + + + +
表 4 不同温度和时间处理时病原菌丝的存活情况
表 4 不同 pH处理对菌株 J4B菌丝生长的影响
pH值 菌落直径/cm 菌丝生长状况
4 3.40 e 稀疏
5 5.07 b 较稀疏
6 5.20 a 浓密
7 4.90 c 浓密
8 4.78 d 浓密
9 4.84 cd 较稀疏
10 2.43 f 稀疏
表 5 不同培养基对菌株 J4B菌丝生长的影响
培养基 菌落直径/cm 菌丝生长状况较浓密
PDA 4.96 a 浓密
OMA 4.30 c 较稀疏
CA 4.30 c 较稀疏
SYA 4.07 d 较浓密
Czapek 4.03 d 极稀疏
WBSA 4.40 b 较浓密
PSA 4.83 a 浓密
ESA 4.06 d 稀疏
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杨 叶 等 海南假臭草叶斑病菌分离及生物学特性
表 7 不同氮源对菌株 J4B菌丝生长的影响
氮源种类 菌落直径/cm 菌落生长状况
ck 4.37 bcd 较稀疏
硝酸钠 5.50 a 浓密
氯化铵 4.43 bc 较浓密
蛋白胨 4.28 cde 浓密
甲硫氨酸 4.13 e 较稀疏
脯氨酸 4.50 b 浓密
苯丙氨酸 4.26 de 较浓密
磷酸氢二铵 4.13 e 较浓密
它们之间无显著差异； 随后依次是果糖、 丙三醇、
木糖、 麦芽糖。
供试氮源中以硝酸钠对菌丝生长最有利， 与其
它处理之间达显著差异； 其它依次为脯氨酸、 氯化
铵及对照(ck)； 磷酸氢二铵与甲硫氨酸对J4B菌丝
生长不利， 与对照存在显著差异(表7)。
3 结论与讨论
从 2008年至 2010年， 通过野外实地调查发
现， 海南假臭草蔓延速度惊人， 危害日趋严重， 短
短几年时间里在很多调查区域从曾经是零星发生到
成片生长， 部分区域甚至成为唯一可见的草本植
物， 可谓触目惊心。 但假臭草的病害极少见， 多数
区域郁郁葱葱、 生长极为繁茂， 偶见自然发病者多
数发病较轻。 而感病植株多在低洼积水处、 池塘边
以及贫瘠土壤中长势较弱的植株上发现。
这种假臭草叶斑病的发病症状比较特殊， 分离
获得的J4B菌株具有极高的致病力。 生物特性研究
表明： 病菌菌丝的致死温度为 55℃30min、 弱酸
条件有利于病菌的生长、 Czapek培养基上生长最
差及常见的多种氮源不利于生长， 这些均表明假臭
草分离获得的致病菌株J4B比较特殊。 开展生物学
特性测定， 旨在了解病菌的生长特性， 也想通过不
同措施促使产孢， 但是， 所有处理均未见分生孢
子。 为了进一步鉴定病菌， 进行 rDNA ITS序列分
析， 获得长为622 bp的ITS序列， 经Blast比对，
与菌株 J4B的 ITS序列的大小接近且同源性最高
也只有96%， 而且只能确定为子囊菌， 推测这可能
是一个新种。 针对本致病菌的进一步鉴定及生防利
用有待后续研究
假臭草病原微生物的研究， 除了作者之前所报
道的假臭草的链隔孢 Alternaria sp.、 镰刀菌 Fusari-
um sp.外[4,9]， 以及植原体引起的丛枝病[10]外， 目前
没有见到假臭草其它病害及病原菌的研究报道。 有
关假臭草的研究多数集中于化感方面及生物入侵方
面， 生物防治方面的研究工作严重滞后。 鉴于入侵
植物假臭草在国内入侵扩散加剧、 蔓延及危害的加
重[11-12]， 假臭草病害调查及病原微生物用于生物防
除相关研究工作亟需加强。
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