全 文 :·基础研究 ·
月腺大戟根总黄酮对
尖孢镰刀菌抑制作用的研究*
高 橼 , 万赛罗 , 蔡永萍* , 林 毅
(安徽农业大学生命科学学院 , 安徽 合肥 230036)
摘 要:采用生长速率法和孢子萌发法分别测定月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发的
抑制率 , 显微观察总黄酮处理尖孢镰刀菌后菌丝体形态结构的变化 , 并测定菌丝体相对电导率 , 菌丝体内超氧
化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明:月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长和分生孢子
萌发均有显著的抑制作用 ,抑制率随总黄酮浓度增加而增高 , 20 mg/L时抑制率达 100 %。总黄酮处理后的尖
孢镰刀菌菌丝较细 ,分支减少 , 透明度差 , 液泡数量增多且形成较大的液泡;菌丝体细胞膜透性增加 , SOD、CAT
活性呈先上升后下降的趋势。以上实验结果可为植物病害生物防治及开发植物源农药方面提供理论依据和实
验技术。
关键词:月腺大戟;总黄酮;尖孢镰刀菌
中图分类号:S435
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2008)02-0213-07
TheInhibitoryEffectsofTotalFlavonesExtractedfromthe
RootsofEuphorbiaebracteolataHayata.onFusariumoxysporum
GAOYuan, WANSai-luo, CAIYong-ping* , LINYi
(ColegeofLifeScience, AnhuiAgriculturalUniversity, Hefei230036, Anhui, China)
Abstract:TheinhibitoryratiooftotalflavonesextractedfromtherootsofEuphorbiaebracteolataHayata.isdeter-
mined.onthemyceliagrowthandsporegerminationofFusariumoxysporumbythemethodsofgrowthrateandsporeger-
mination.Then, themobilityandstructureofmyceliawereobservedundermicroscope, thepenetrationandtheactivity
ofsuperoxidedismutase(SOD), catalase(CAT)ofmyceliaweredetermined.Theresultsshowedthatthetotalflavones
extractedfromtherootsofEuphorbiaebracteolataHayata.hadsignificantlyinhibitiveefectonthemyceliagrowthand
sporegerminationofFusariumoxysporum.Therateofinhibitionrisedwiththeincreasingofconcentrationoftotalfla-
vones.Therateinhibitionwas100 % whentheconcentrationreached20 mg/L.Themyceliatreatedbecamethinner,
ramusandtransparencydecreased, somethingthickassembled, morevacuoleappearedandbecamebigger.Thepenetra-
tionofmembraneincreasedandtheactivityofSOD, CATincreasedfirstanddecreasedlater.Theseresultscanprovide
theoreticalbasisandexperimentaltechniquesforthebiologicalcontrolofplantdiseasesandthedevelopmentofbotanical
pesticides.
Keywords:EuphorbiaebracteolataHayata.;totalflavones;Fusariumoxysporum
第 17卷第 2期
2008年 4月
激 光 生 物 学 报
ACTA LASER BIOLOGY SINICA Vol.17 No.2Apr.2008
* 收稿日期:2007-06-25;修回日期:2007-07-11
基金项目:安徽省教育厅 “十五”学术带头人基金资助项目(2002年度)
作者简介:高橼 (1983— ), 女 , 在读硕士生 , 主要从事药用植物有效成分的提取 、纯化及生物活性的研究。
(手机)13866736235;(电子信箱)gaoyuansmile@163.com
*通讯作者:(电子信箱)swkx12@ahau.edu.cn
月腺大戟 (EuphorbiaebracteolataHayata.)为大
戟科(Euphorbiaceae)大戟属 (Euphorbia)植物 ,也是
中药 “狼毒 ”的来源之一 ,分布于安徽 、江苏 、浙江 、山
东等省 ,生于山坡 、草地或林下 ,资源极为丰富。狼
毒包括瑞香狼毒 [ 1-2] 、狼毒大戟 [ 1]和月腺大戟 [ 3-4] 3
种源植物。
民间常用月腺大戟作农药 ,月腺大戟也有抑菌
杀虫 、抗结核病等活性 [ 1] 。但目前还未见有关月腺
大戟中总黄酮对植物病原菌的抑制作用方式及机理
的研究报道 。
尖孢镰刀菌 (Fusariumoxysporum)为半知菌亚门
镰刀菌属的一种真菌 ,能引起番茄 、棉花等多种作物
枯萎病 ,主要症状是维管束枯萎 、植株枯黄 、球茎和
根腐烂 、植株生长衰弱 [ 5] 。目前生产上主要依靠化
学防治控制其危害 [ 6] ,但近几年化学农药残留问题
引起了广泛的关注 ,人们开始寻找无污染无残留的
植物源农药来替代化学农药的大量施用。有关月腺
大戟对尖孢镰刀菌的作用目前还未见报道。
通过提取月腺大戟根中总黄酮 ,测定月腺大戟
根总黄酮对尖孢镰刀菌的菌丝体生长和分生孢子萌
发的抑制作用 ,显微观察月腺大戟根总黄酮处理尖
孢镰刀菌后菌丝体形态结构的变化 ,并测定菌丝体
质膜的透性及 SOD、CAT活性的变化 ,初步研究月腺
大戟根中总黄酮对尖孢镰刀菌的抑制效果及作用方
式 ,以期为在生产实践中防治枯萎病及植物源农药
的研发提供理论依据和实验技术。
1 材料与方法
1.1 材料
月腺大戟(EuphorbiaebracteolataHayata.)采自安
徽省淮北相山。尖孢镰刀菌 (Fusariumoxysporum)由
安徽农业大学植保学院提供 。
1.2 方法
1.2.1 月腺大戟根总黄酮溶液的提取 取粉碎
的月腺大戟根 5.0 g, 85 ℃用 50 %乙醇 200 mL于索
氏提取器中提取 2 h,浓缩 。用 AB-8大孔树脂吸附
纯化总黄酮 [ 7-8] ,按姚新生的方法鉴定 [ 9] ,紫外分光
光度法测定其含量为 83.6 %[ 10] 。
1.2.2 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生
长的抑制作用 在无菌条件下 ,配制月腺大戟根总
黄酮浓度分别为 0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、
15 mg/L和 20 mg/L的 PDA固体培养基。平板凝固
后放入生长一致 、直径为 8 mm的尖孢镰刀菌 ,每处
理重复 3次 ,放于 28 ℃恒温培养箱中培养。 7 d后
开始测量菌落直径 ,并计算尖孢镰刀菌菌丝生长抑
制率 [ 11] 。菌落直径采用十字交叉法 ,测量菌落的两
个垂直交叉直径 ,求其平均值然后减去 8 mm(菌饼
直径)作为菌落真实直径 。按下式求出菌丝生长抑
制率:
菌丝生长抑制率 =(对照菌落直径 -处理菌落
直径)/对照菌落直径 ×100 %。
1.2.3 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌分生孢
子萌发的抑制作用 在无菌条件下 ,取等量尖孢镰
刀菌孢子悬液加入总黄酮浓度分别为 0 mg/L、1 mg/
L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L和 20 mg/L的葡萄糖溶
液中 ,每处理重复 3次 , 28 ℃培养。每隔 3 h用光学
显微镜观察一次 ,每处理镜检孢子数为 150个 ~ 100
个 ,以芽管长度超过孢子直径一半计为孢子萌发 ,直
至对照萌发率达到 80 %以上 ,并计算分生孢子萌发
的抑制率 [ 11] 。
孢子萌发率 =萌发孢子数 /检查孢子总数 ×
100 % ;
抑制率 =(对照孢子萌发率 -处理孢子萌发
率 )/对照孢子萌发率 ×100 %。
1.2.4 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝形
态影响的显微观察 取上述 0 mg/L、15 mg/L月腺
大戟根总黄酮处理的尖孢镰刀菌菌丝 ,用蒸馏水冲
洗 ,分别置于载玻片上 ,在光学显微镜下观察。菌体
内的液泡用 pH6.8浓度为 0.01 %的磷酸缓冲液配
置的中性红染色。
1.2.5 尖孢镰刀菌菌丝体相对电导率 、SOD、CAT
活性的测定 尖孢镰刀菌的分生孢子接种于 50 mL
液体培养基中摇床培养(110 r/min, 28 ℃)24 h后 ,
离心收集菌丝体 ,用 0.9 %NaCl洗涤离心 ,取等量菌
丝体悬液加入总黄酮浓度分别为 0 mg/L、5 mg/L、10
mg/L、15 mg/L和 20 mg/L的葡萄糖溶液中 ,立即取
出 5 mL样品用 DDS-11A型电导率仪测定其电导率 ,
继续培养 ,每隔 5 h取出 5 mL样品离心 ,取上清液用
于测定其相对电导率 [ 12-13] 。
每隔 5 h取 3 mL样品 ,于 5 000 r/min下离心 5
min,弃去上清液 ,收集菌体;用 3 mL的 0.9 % NaCl
洗涤 1次 ,再重悬于 0.9 %NaCl中 ;经超声波破碎
后 , 11 000 r/min下冷冻离心 10 min,所得上清液备
用 ,测定 SOD、CAT活性 [ 14] 。 SOD活性的测定采用
氮蓝四唑 (NBT)光化还原法 ;CAT活性测定采用紫
外分光法 [ 15] 。
214 激 光 生 物 学 报 第 17卷
1.3 数据处理
将菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率换算成几
率值 ,总黄酮浓度换算成对数 ,以浓度对数为横坐
标 ,几率值为纵坐标算出月腺大戟根总黄酮对尖孢
镰刀菌菌丝生长抑制率和对孢子萌发抑制率的毒力
方程 、并计算出有效中浓度 EC50 [ 16] 。
实验结果采用 SPSS软件对数据进行处理 ,进行
差异显著性测验。
2 结果与分析
2.1 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长
的抑制作用
由表 1可以看出 ,随着处理组中月腺大戟根总
黄酮浓度的增加 ,尖孢镰刀菌菌落直径逐渐减小 ,菌
丝生长受到的抑制作用逐渐增强 。当总黄酮浓度为
1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L时 ,菌落
生长直径分别比 0 mg/L总黄酮处理组减少了 0.028
%、29.81 %、56.07 %、76.98 %、和 88.70 %,而菌
丝生长抑制率分别为 5.91 %、15.10 %、56.77 %、
75.79 %和 100 %(表 1)。可见 ,当月腺大戟根总黄
酮浓度为 10 mg/L以上时 ,抑制率可达 50 %以上;当
为 20 mg/L时 ,抑制率可达 100 %(图 1),表明月腺
大戟根总黄酮对离体平皿培养的尖孢镰刀菌菌丝体
的生长有很强的抑制效果。通过计算 ,得出月腺大
戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制作用的毒力
回归方程为 :y=4.8603x+0.2887, R=0.9531, EC50
为 0.6938 mg/L。
表 1 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长
的抑制作用
Tab.1 InhibitoryefectsonmyceliumofFusarium
oxysporumbytotalflavoneextractedfromtherootsof
EuphorbiaebracteolataHayata.
总黄酮浓度(mg/L)
Concentrationof
totalflavones
菌落直径(mm)
Diameter
ofcolony
生长抑制率(%)
Inhibitionrate
ofgrowth
0 70.8±0.4 0.00±0.000
1 68.8±0.8* 5.19±0.035*
5 49.7±0.7** 15.10±0.039**
10 31.1±1.0** 56.77±0.135**
15 16.3±0.5** 75.79±0.146**
20 8.0±0.0** 100.00±0.000**
注:表中数据均为 3次重复的平均值。 “*”表示 5 %水平
时差异显著 , “ **”表示 1 %水平时差异显著。下表同 。
Note:Thedataaretheaverageoftherereplicates.* shows
differentat5 % level, ** showsdifferentat1% level.The
sameasbelow.
2.2 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌孢子萌发
的抑制作用
月腺大戟根总黄酮不仅对尖孢镰刀菌菌丝生长
有很强的抑制作用 ,而且对其分生孢子的萌发也有
明显的抑制作用(表 2)。随着月腺大戟根总黄酮浓
度的增加 ,尖孢镰刀菌分生孢子萌发率逐渐下降;当
总黄酮浓度为 1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20
mg/L处理时 ,分生孢子萌发率分别比 0 mg/L总黄酮
处理组减少了 0.026 %、24.34 %、48.14 %、77.53
%和 100 %。
当用月腺大戟根总黄酮浓度为 10 mg/L以上时 ,
尖孢镰刀菌分生孢子萌发的抑制率分别为 50 %以
上 ;且分生孢子萌发抑制率随总黄酮浓度的增加而
上升 ,当达到 20 mg/L时 ,其对分生孢子萌发抑制率
215第 2期 高 橼等:月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌抑制作用的研究
表 2 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌分生孢子
萌发的抑制作用
Tab.2 InhibitoryefectsonconidiophoreofFusari-
um oxysporum bytotalflavonesextractedfrom the
rootsofEuphorbiaebracteolataHayata.
总黄酮浓度(mg/L)
Concentrationof
totalflavones
孢子萌发率(%)
Rateof
sporegermination
孢子萌发抑制率(%)
Inhibitionrateof
sporegermination
0 80.50±0.07 0.00±0.00
1 78.38±0.07* 2.15±0.04*
5 60.91±0.07** 23.96±0.05**
10 41.75±0.07** 47.88±0.07**
15 18.09±0.05** 77.42±0.07**
20 0.00±0.00** 100.00±0.00**
达 100 %。通过计算 ,月腺大戟根总黄酮对尖孢镰
刀菌分生孢子萌发抑制率的毒力回归方程为:
y=3.969x+1.2783, R=0.9502 , EC50为 0.67 mg/L。
2.3 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌形态的影
响
为了解月腺大戟根总黄酮抑制尖孢镰刀菌菌丝
生长的原因 ,挑取在含不同浓度总黄酮的固体培养
基上生长一致的菌丝 ,在光学显微镜下观察其形态
的变化。 0 mg/L总黄酮处理组的菌丝生长正常 ,粗
细均匀 ,分支较多 ,菌丝体透明度较大 (图 2-1);15
mg/L总黄酮处理组的菌丝较细 ,分支减少 ,透明度
差 ,并可以观察到原生质体凝集(图 2-2),液泡数量
增多且形成较大的液泡(图 2-3)。
随着月腺大戟根总黄酮处理 ,尖孢镰刀菌分生
孢子形态也产生一定的变化 。 0 mg/L总黄酮处理组
的分生孢子萌发正常 ,大致可分为三个阶段 :培养 10
h~ 12 h时 ,有 90 %以上的分生孢子已经开始萌发 ;
12 h~ 24 h,芽管伸长成菌丝 ,菌丝粗细均匀并不断
伸长;24 h后发现个别菌丝已经开始产生孢子。而
经月腺大戟根总黄酮处理的分生孢子 12 h后 ,只有
少数可以萌发 ,且在光学显微镜下可以观察到萌发
的分生孢子中出现很多沉积物 (图 2-4), 24 h后 , 20
mg/L总黄酮处理的分生孢子破碎(图 2-5)。由此可
216 激 光 生 物 学 报 第 17卷
见 ,月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌的菌丝和分生
孢子的形态都有一定的影响 ,且对其分生孢子的破
坏作用更强 。
2.4 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝体细
胞膜透性的影响
为了进一步了解月腺大戟根总黄酮抑制尖孢镰
刀菌菌丝生长的生理原因 ,用含不同浓度月腺大戟
根总黄酮的培养液培养尖孢镰刀菌菌丝体 ,测定不
同浓度处理下不同时间培养液的相对电导率 。由图
3可知 ,随着培养时间的延长 ,培养液相对电导率逐
步增加 ,并随处理中月腺大戟根总黄酮浓度的增加
而升高。
图 3 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝相对电导率
的影响
Fig.3 Effectsoftotalflavonesextractedfromtherootsof
EuphorbiaebracteolataHayata.oncomparativeconductance
ofmyceliaofFusariumoxysporum
培养 0 h~ 5 h内 ,培养液的相对电导率变化不
大 ,但处理组均高于 0 mg/L总黄酮处理组;培养在 5
h~ 10 h,培养液的相对电导率急剧升高 ,而后缓慢升
高 ,说明在处理 5 h~ 10 h,尖孢镰刀菌菌丝体细胞膜
的透性增大加较快 。月腺大戟根总黄酮浓度低于 5
mg/L时 ,培养液相对电导率变化不大 ,上升趋势不
显著;当浓度为 5 mg/L以上时 ,培养液相对电导率
增加明显。如培养 10 h,月腺大戟根总黄酮浓度为 5
mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L时 ,培养液相对电
导率达 6.91 %、15.22 %、23.38 %、35.26 %。这表
明 ,月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌细胞膜有一定
的破坏作用 ,浓度越高 ,时间越长 ,破坏作用越明显 。
2.5 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝体
SOD、CAT的影响
用不同浓度月腺大戟根总黄酮培养尖孢镰刀菌
菌丝体 ,随着培养时间的增加 ,菌丝体 SOD、CAT活
性在培养初期变化平稳 ,逐渐增强 ,后呈下降趋势。
培养 10 h时 ,菌丝体 SOD活性出现峰值 ;培养 15 h
时 ,菌丝体 CAT活性出现峰值(图 4、图 5)。不同浓
度月腺大戟根总黄酮处理的尖孢镰刀菌菌丝体 CAT
活性变化趋势与 SOD活性变化趋势大致相同 ,但菌
丝体内 CAT活性在 10 h~ 15 h内迅速上升 , 15 h时
达到高峰 ,比 SOD活性达高峰晚 5 h,说明两种酶是
在不同时间受到激活。
由图 4可知 ,随着总黄酮浓度增加 ,菌丝体 SOD
活性越强 , 10 h后 SOD活性下降的越快 。培养 10 h
时 ,总黄酮浓度为 5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/
L时 , SOD活性分别比 0 mg/L总黄酮处理组增加了
14.06 %、27.86 %、58.37 %和 74.88 %;而培养到
30 h,总黄酮浓度为 5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20
mg/L时 , SOD活性分别比 0 mg/L总黄酮处理组下降
了 22.53 %、45.34 %、62.46 %和 76.35 %。
由图 5可知 ,处理组总黄酮浓度越大 ,培养 10 h
~ 15 h内 ,尖孢镰刀菌的菌丝体 CAT活性上升越明
显 ,培养 15 h,总黄酮浓度为 5 mg/L、10 mg/L、 15
mg/L、20 mg/L时 ,菌丝体 CAT活性分别比 0 mg/L
总黄酮处理组增加了 15.94 %、36.23 %、57.01 %
和 74.39 %;培养 15 h后 ,其 CAT活性下降明显 ,培
养到 30h,总黄酮浓度为 5 mg/L、10 mg/L、15mg/L、20
mg/L时 ,菌丝体 CAT活性分别比 0 mg/L总黄酮处理
组下降了 8.77 %、23.46 %、35.04 %和 47.88 %。
图 4 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝体 SOD的影
响
Fig.4 EffectsoftotalflavonesextractedfromtherootsofEu-
phorbiaebracteolataHayata.onSODofmyceliaofFusarium
oxysporum
217第 2期 高 橼等:月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌抑制作用的研究
图 5 月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝体 CAT的
影响
Fig.5 Efectsoftotalflavonesextractedfromtherootsof
EuphorbiaebracteolataHayata.onCATofmyceliaofFu-
sariumoxysporum
3 讨论
月腺大戟根总黄酮处理尖孢镰刀菌后 ,其菌丝
体生长 、分生孢子萌发受到抑制及菌丝体细胞膜透
性增加 ,这可能是由于菌体细胞膜上麦角甾醇 [ 17] 、
蛋白质等主要成分的合成受阻 ,或是抑制细胞壁的
主要成分 、相关酶的合成及活性 [ 18-19] ;加上液泡增多
的压力 ,从而造成电解质的渗漏。
SOD和 CAT是植物体中重要的抗氧化酶类 ,它
们的主要功能是清除对细胞膜起破坏作用的活性氧
自由基 ,以免细胞受害。月腺大戟根总黄酮处理尖
孢镰刀菌后 , SOD和 CAT活性先上升 ,可能是细胞内
活性氧的生成能力超过它们的清除能力 ,而诱导它
们的活力暂时的上升 ,但终因大量活性氧物质的毒
害 ,而使它们的活性逐渐下降。 SOD是清除体内 O-2
的酶 , CAT是清除 H2O2 的重要酶类 , 由于 SOD和
CAT活性下降 , O-2 和 H2O2在菌体内积累而产生毒
害 。
月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌具有较强的抑
制作用。当处理组总黄酮浓度为 20 mg/L时 ,对离
体平皿培养中的尖孢镰刀菌菌丝生长和其分生孢子
萌发的抑制率均达 100 %;但是否能抑制活体植物
中的尖孢镰刀菌的生长 ,控制植物枯萎病的发生 ,还
有待进一步的研究 。
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·科技信息 ·
关于召开 “中国遗传学会第十届全国激光生物学学术会议 ”首轮通知
经中国遗传学会批准 , “中国遗传学会第十届全国激光生物学学术会议”拟在华中科技大学召开。 会议的组织 、接待及
参观考察等诸项工作委托武汉光电国家实验室(筹)、生物医学光子学教育部重点实验室(华中科技大学)、激光生命科学
教育部重点实验室(华南师范大学)、医学光电科学与技术教育部重点实验室(福建师范大学)予以协办;会议论文的审稿 、
论文录取 、出版等工作由《激光生物学报》编辑部负责 。现将有关情况通知如下。
一 、会议主题 激光生物学的发展和应用
二 、征文内容
1.激光生物学和生物光子学的基础研究;
2.激光生物医学 、光子中医学的基础研究及其临床应用;
3.激光整形 、美容的研究与应用;
4.激光针灸在人类 、动物中的临床应用与基础研究;
5.离子束生物工程的基础与应用研究;
6.辐射生物学(含激光育种 、辐射育种 、空间育种等)的基础与应用研究;
7.激光生物技术(含微束照射技术 、光镊技术 、光谱技术 、共聚焦扫描显微技术 、细胞分流技术等)及其仪器的研制 、应用。
三 、时间安排 2008年 11月 27日 ~ 11月 29日
四 、会议论文
1.凡参加学术会议者 , 请提供 800字以内的中文摘要 。论文摘要截止日期为 10月底 。
2.凡经审查合格的会议论文全文 , 将在 《激光生物学报》予以发表 ,不另出专辑。
五 、联系人
付 玲:华中科技大学 武汉光电国家实验室(筹)生物医学光子学研究部 G30(邮编:5430074 );电子信箱:lfu@mail.
hust.edu.cn;亦可直接与 《激光生物学报》编辑部联系。地址:长沙市岳麓山湖南师范大学生命科学学院内(邮编:
410081);电子信箱:jgswxb@hunnu.edu.cn;网址:http://www.jgswxb.net
主办单位:中国遗传学会
承办单位:武汉光电国家实验室(筹)
生物医学光子学教育部重点实验室(华中科技大学)
激光生命科学教育部重点实验室(华南师范大学)
医学光电科学与技术教育部重点实验室(福建师范大学)
219第 2期 高 橼等:月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌抑制作用的研究