全 文 ：中国农学通报 2012,28(16):215-218
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
大叶羊蹄甲为豆科植物褐毛羊蹄甲 [Bauhinia
ornate Kurz var.kerrii (Gagnep.) K.Larsen&S. S. Larsen]
的干燥藤茎。秋、冬季采收，除去侧枝，切成厚片，干
燥。具有清火解毒，除风止痛的功效。用以治疗皮癣，
疔疮脓肿，湿疹，风疹，麻疹，水痘，麻风病等[1]。
目前国内外对大叶羊蹄甲属植物的研究相对缺
乏，目前的研究主要集中在微量元素[2]、化学成分的研
究方面[3-4]，对于黄酮类化合物提取工艺及抗氧化方面
研究尚未见文献报道。黄酮类化合物对治疗冠心病、
老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病等方面的效果显
著，并且还具有消除自由基、抑菌、抗癌等方面作用，并
开发出了多种的保健食品和药物[5]。为此，本试验利
用正交试验法对不同条件下的醇提法提取黄酮的效果
进行比较，来研究提取大叶羊蹄甲中黄酮类化合物的
较佳工艺条件；同时利用提取到的黄酮类化合物对
基金项目：云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室开放基金“傣族雅解药微量元素形态与抗氧化活性研究”
(MZY1119)；云南民族大学绿色化学与功能材料研究省创新团队(2011HC008)；云南省高校绿色化学新能源与材料科技创新团队(2011UY09)。
第一作者简介：钟佳，女，1987年出生，辽宁人，硕士生，研究方向：分离分析科学。通信地址：650000云南昆明呈贡大学城云南民族大学云南民族大
学化学与生物技术学院2009级分析化学研究生，E-mail：zhongjia0421@163.com。
通讯作者：叶艳青，女，1967年出生，云南人，教授，硕士，研究方向：分离分析科学。通信地址：650000云南昆明呈贡大学城云南民族大学化学与生
物技术学院，Tel：0871-5910017，E-mail：yey-qing@163.com。
收稿日期：2011-12-14，修回日期：2012-03-01。
大叶羊蹄甲总黄酮的提取及其对羟自由基的清除作用研究
钟 佳，马金晶，罗 雯，叶艳青
（云南民族大学化学与生物技术学院/民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室/
云南省聚乳酸基功能材料工程实验室，昆明 650500）
摘 要：为了研究大叶羊蹄甲中总黄酮的提取、鉴别方法及对羟自由基的清除作用。用乙醇提取法提取
大叶羊蹄甲中黄酮类物质，采用分光光度法对提取物中总黄酮含量及羟自由基清除能力进行测定。提
取大叶羊蹄甲中总黄酮的最佳工艺条件为：回流温度为80℃，乙醇体积分数为80%，固液比1:20，提取时
间为1 h，在此条件下，黄酮的提取率为11.81%。此方法试验步骤简便，无污染，是提取大叶羊蹄甲中黄
酮类化合物的有效途径，大叶羊蹄甲中总黄酮提取液对Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除
作用。
关键词：大叶羊蹄甲；总黄酮；提取；羟自由基；清除
中图分类号：R931.7 文献标志码：A 论文编号：2011-3742
Extracting of Total Flavonoids from Bauhinia and Its Effects on Scavenging of Hydroxyl Radicals
Zhong Jia, Ma Jinjing, Luo Wen, Ye Yanqing
(School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan Nationalities University/
Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry, State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education/
The Engineering Laboratory of Polylactic Acid-Based Functional Materials of Yunnan, Kunming 650500)
Abstract: The aims were to study the extraction, identification method of total flavonoids in Bauhinia and its
effect on scavenging hydroxyl radicals. The total flavonoids were extracted by using ethanol extraction method
from Bauhinia. A spectrophotometry was used to check the total flavonoids in Bauhinia and the effect of
Bauhinia on scavenging hydroxyl radicals. The optimum technical conditions were ethanol concentration 80%,
the volume 1:20 and heating extracting time 1 h at 80℃ . The extraction rate of flavonoids was 11.81%. This
test was simple and had no pollution. It provided the best way to extract the flavones form Bauhinia.
Key words: Bauhinia; total flavonoids; extraction; hydroxyl radicals; scavenge
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Fenton反应体系[6]产生的羟自由基(·OH)的清除作用
进行了研究，探讨了黄酮类化合物抗衰老、提高免疫力
的机理，为大叶羊蹄甲的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试剂及材料
大叶羊蹄甲原药（购于西双版纳傣族自治州民族
医药研究所原药材）；芦丁标准品（中国药品生物制品
检定所）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化
铝、锌粉、过氧化氢（体积分数为 0.1%）、硫酸亚铁
（7.5 mmol/L的溶液）、邻二氮菲（7.5 mmol/L无水乙醇
溶液），均为分析纯；1.0 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶
液 PBS（用KH2PO4和NaOH配制）。试验用水为去离
子水。
1.2 主要仪器
WFJ7200型分光光度计（尤尼柯UNICO）；电子天
平（北京赛多利斯天平有限公司）；SP-752型紫外可见
分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；电热恒温干燥
箱（天津市津北真空仪器厂）。
1.3 实验方法
1.3.1 大叶羊蹄甲中黄酮类物质的提取[7-14] 醇提回流
法提取工艺：大叶羊蹄甲→干燥→粉碎→醇提回流→
抽滤→定容→含量测定。准确称取2.0000 g大叶羊蹄
甲干料，加入一定量不同体积分数的乙醇，回流，抽滤
定容。
1.3.2 大叶羊蹄甲提取物的特性试验
（1）光谱扫描。黄酮、黄酮醇类物质结构中，A环
苯甲酰基系统的吸收谱带范围在 310~385 nm，B环桂
皮酰基系统吸收的谱带范围在250~280 nm，异黄酮和
二氢黄酮醇类只有苯甲酰系统，一般在该波长范围没
有强吸收。大叶羊蹄甲黄酮提取物在288 nm、308 nm
有吸收峰（图 1），因此该提取物中，可能主要含有黄
酮、黄酮醇等物质。
（2）大叶羊蹄甲中黄酮类化合物定性分析。用 5
种定性分析方法判定是否含有黄酮类物质：①取少量
溶于70%乙醇的样品，加入几滴10%氢氧化钠；②取少
量溶于70%乙醇的样品加入少许锌粒，振荡，加入浓盐
酸几滴；③取少量溶于70%乙醇的样品，加入几滴硫酸
铝溶液，再加入亚硝酸钠，在氢氧化钠碱溶液中；④铅
盐试验，取少量样品液，加2%的乙酸铅试剂；⑤与三氯
化铝反应，取少量样品液，将少量液体涂于滤纸上，吹
干后，加入1%三氯化铝乙醇溶液。羊蹄甲的提取液经
以上 5种试验均发生了相应的颜色变化，证明羊蹄甲
中含有黄酮类化合物。
1.3.3 大叶羊蹄甲黄酮提取物的定量试验——总黄酮
含量的测定
（1）测定方法依据。以芦丁为对照品测定大叶羊
蹄甲中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜
pH，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能
获得稳定的特征吸收峰。
（2）波长的选择。取样品液适量，在 0.30 mL 5%
亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以
试剂为空白参比液在 420~700 nm波长范围测定络合
物的吸光度，络合物于 500 nm波长处有最大吸收，故
测定时选用此波长。
（3）标准曲线的绘制。称取 120℃干燥恒重芦丁
100.8 mg，用60%微热乙醇溶解，定容至100.00 mL，得
浓度为1.008 mg/mL的标准储备液。分别准确吸取标
准使用液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于 9
只 25 mL容量瓶中，加 10 mL 30%乙醇，加 5%NaNO2
溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加 10% Al(NO3)3溶液
1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH 溶液
10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置 10~15 min，于
500 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。依芦丁浓
度 -吸光度标准工作曲线，得出回归方程：A=
0.0125C+0.0153；相关系数 r=0.9999。
1.3.4 样品中总黄酮的测定方法 准确吸取样品液1.0 mL，
置于 10 mL容量瓶中，用 60%乙醇稀释至刻度，取
2.0 mL于 25 mL容量瓶中，按标准曲线制备方法测定
吸光度。所测样品吸光度值经标准曲线回归方程换算
后，得出提取液总黄酮浓度，然后按公式(1)计算提取
率：
提取率 = C ×稀释倍数 × V
W
× 100% ………… (1)
其中：C为所测定溶液的吸光度值，代入回归方程
计算出相应的总黄酮含量；W为试验称取大叶羊蹄甲图1 大叶羊蹄甲黄酮提取物紫外扫描曲线
2000
1000
0.000
190 2 300 400(nm)
A
bs
·· 216
钟 佳等：大叶羊蹄甲总黄酮的提取及其对羟自由基的清除作用研究
的质量；V为测定时大叶羊蹄甲的定容体积。
1.3.5 正交试验方案的设计 醇提回流法提取大叶羊
蹄甲中黄酮类化合物的影响因素较多，为综合考虑各
种因素影响的主次顺序，确定醇提回流法的最佳提取
工艺，而对回流温度(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)、
固液比(D)作四因素水平正交试验，见表1。
1.3.6 提取液中黄酮类化合物对(·OH)的清除效果
（1）黄酮类化合物对羟基自由基清除的原理。参
照 Fenton反应方法建立·OH自由基产生体系模型。
H2O2与二价铁离子混合后产生·OH的Fenton反应，见
式(2)。
H2O2+Fe2+－→·OH+OH-+Fe3+………………… (2)
利用邻二氮菲-Fe2+氧化分光光度法[3]检测羟自由
基与抗氧化剂的作用。邻二氮菲-Fe2+被羟自由基氧化
为邻二氮菲Fe3+后，其在510 nm处最大吸收峰消失，从
而可以在 510 nm处测其吸光度，吸光度的变化，能反
映抗氧化剂抗自由基的能力。
（2）黄酮类化合物对(·OH)清除效果测定。准确
量取 5.0 mL PBS（1.0 mol/L，下同）、2.0 mL蒸馏水和
3.0 mL乙醇于试管中，混匀作为空白参比管；精密量
取5.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲（7.50 mmol/L，下同）、
1.0 mL FeSO4（7.50 mmol/L，下同）、2.0 mL乙醇和
1.0 mL蒸馏水于试管中，混匀作为未损伤管；准确量取
5.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲、1.0 mL FeSO4、2.0 mL
乙醇和1.0 mL 0.1% H2O2于试管中，混匀作为损伤管；
准确量取5.0 mL PBS、1.0 mL样品液、2.0 mL蒸馏水和
2.0 mL乙醇于试管中，混匀作为样品参比管；准确量取
5.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲、1.0 mL FeSO4、1.0 mL
乙醇、1.0 mL样品液和 1.0 mL H2O2于试管中，混匀作
为样品管。将上述试管同时置恒温水浴锅中，37℃保
温 60 min，于 510 nm处测吸光度A值，每管重复 5次，
取其平均值。计算羟自由基清除率(E)，见公式(3)。
羟自由基清除率E =（A样品 - A样参） -（A损伤 - A空参）
A未损 - A损伤
× 100%
………………………………………………… (3)
2 结果与分析
2.1 正交试验结果与分析
从正交试验直观分析及极差分析可知，四因素对
黄酮提取率影响的顺序为：回流温度>乙醇浓度>固液
比>提取时间。最后确定出最佳提取条件为：回流温
度为 80℃，乙醇体积分数为 80%，固液比 1:20，提取时
间为1 h。该条件下黄酮提取率为11.81%（表2）。
2.2 大叶羊蹄甲提取物对羟基自由基(·OH)的清除效
果
以试验的提取液作为样品，分别取不同体积的样
品测其对·OH的清除作用，结果见表3和图2。由图2
知，羊蹄甲提取物体外清除羟自由基的效果比较理想，
在羊蹄甲提取液浓度达到2.009 mg/mL即相当于原药
材质量 20.03 mg时，对羟自由基的清除率可达到
水平
1
2
3
因素
A/℃
60
70
80
B/h
3
2
1
C/%
70
80
90
D/(g/mL)
1:20
1:15
1:10
表1 正交试验因素水平表
编号
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
Ⅶ
Ⅷ
Ⅸ
K1
K2
K3
R
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
10.17
10.40
11.48
1.31
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
10.74
10.58
10.73
0.15
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
10.53
11.01
10.51
0.50
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
10.64
10.55
10.85
0.30
总黄酮提取率/%
10.03
10.26
10.21
10.96
10.09
10.16
11.24
11.39
11.81
表2 正交试验结果与分析
·· 217
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76.26%。在一定范围内羟自由基清除率与羊蹄甲提
取液的浓度成正相关关系，在对羟自由基的清除率达
到 50%时，羊蹄甲提取液的浓度为 1.035 mg/mL，相当
于原药材质量10.32 mg。
3 结论与讨论
用醇提回流法提取大叶羊蹄甲的黄酮类物质，最
佳的提取工艺是回流温度为 80℃，乙醇体积分数为
80%，固液比 1:20，提取时间为 1 h，在此条件下，得到
黄酮的提取率为 11.81%。回流温度对大叶羊蹄甲中
总黄酮的提取率影响最大，提取时间对大叶羊蹄甲中
总黄酮的提取率影响最小。与以往的乙醇提取黄酮的
方法相比，此方法经过正交试验的筛选，找出了在同等
试验条件下最佳的提取方法，使黄酮类化合物提取更
完全。此外，此方法工艺简单，采用乙醇为提取溶剂，
污染小，节省溶剂，经提取得到的黄酮类物质纯度较
高，是一条理想的黄酮提取方法，为其他中药中黄酮类
化合物的研究提供参考。
大叶羊蹄甲的提取液对·OH自由基有很好清除
作用，说明大叶羊蹄甲提取液具有很好的抗氧化能力，
加以继续研究可以应用在新药的开发上。黄酮类化合
物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草
药的有效成分，具有很高的药用价值[5]。天然来源的
生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏
障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、
保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗
脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能[15]。
本试验结果表明，大叶羊蹄甲中含有较为丰富的黄酮，
其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因
此，大叶羊蹄甲具有广泛的开发和利用价值，值得综合
利用，加强资源开发。
此试验方法对于大叶羊蹄甲的抗氧化研究并不很
全面，超氧自由基和DPPH方面仍可以进行研究；此试
验方法的适用范围比较广泛，但是仍存在不足，从黄酮
的提取时间和羟自由基清除效果测定的试验步骤上，
仍存在较大的改进空间。
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致谢：感谢“云南省高校科技创新团队支持计划资助”。
提取液浓度/(mg/mL)
0.4820
1.004
1.486
2.009
2.410
清除率/%
24.62
49.29
60.53
76.26
75.87
表3 羊蹄甲提取液对羟自由基清除效果的测定
图2 抗氧化剂质量浓度对羟自由基清除率的影响
010
2030
4050
6070
8090
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
提取液浓度/(mg/mL)
清
除
率
/%
·· 218