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检疫性杂草假高粱与近缘植物种子的波谱鉴别方法



全 文 :浙江大学学报(农业与生命科学版) 41(4):421~427,2015
Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)
http://www.journals.zju.edu.cn/agr
E-mail:zdxbnsb@zju.edu.cn  DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2015.01.211
基金项目:国家自然科学基金(31070479);上海市科委基础研究重点项目(10JC1412100)。
*通信作者(Corresponding author):郭水良(http://orcid.org/0000-0003-4048-1892),E-mail:gsg@shnu.edu.cn
第一作者联系方式:刘小慧(http://orcid.org/0000-0001-690-4740),E-mail:L2013xh@163.com
收稿日期(Received):2015-01-21;接受日期(Accepted):2015-04-21;网络出版日期(Published online):2015-07-07 
URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20150707.1731.005.html
检疫性杂草假高粱与近缘植物种子的波谱鉴别方法
刘小慧1,邹满钰1,印丽萍2,郭水良1*
(1.上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;2.上海出入境检验检疫局,上海200315)
摘要 为便于出入境检验检疫部门正确、快速地鉴别出假高粱[Sorghum halepense(L.)Pers]及其近缘种,以石
油醚作为溶剂,获取了假高粱、高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]、黑高粱(Sorghum almum Parodi)和苏丹草
[Sorghum sudanense(Piper)Stapf]种子12份样品的浸提液,应用Unicam UV540型紫外分光光度计,将狭缝设
置成1nm,扫描速率0.5s,获得了200~400nm波长范围内每种植物种子在200个紫外波段上的吸光度。借助
于SPSS 16.0软件,应用单因素方差分析,过滤掉差异性小的波段,明确了假高粱与近缘植物种子间存在显著和
极显著差异的63个波段。对这63个波段上的吸光度数据应用主成分分析进一步筛选出了信息负荷量大的18
个波段。以这18个波段上的吸光度数据为指标,以12个样品为对象,做出了它们的紫外光谱图、聚类图和二维
排序图。上述方法能较好地将假高粱与其他3种近缘杂草种子鉴别开。为比较通过单因素方差分析和主成分分
析后筛选的光谱数据对鉴别假高粱与其他3种近缘植物种子的效果,直接基于200个波长上的吸光度数据,应用
相同的软件和参数,也做出了假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草12个样品的紫外光谱图、聚类图和二维排序图,说明
筛选出的这些敏感波段能够更简便、有效地识别假高粱和其近缘植物种子,为今后应用紫外光谱法鉴别假高粱与
同属近缘的其他3种植物种子提供了技术参数。
关键词 假高粱;紫外光谱;单因素方差分析;排序;聚类分析
中图分类号 TP 393.09;S 41-31   文献标志码 A
Seed identification between Sorghum halepense(aquarantine weed)and its closed species based on
ultraviolet spectrum.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2015,41(4):421-427
Liu Xiaohui 1,Zou Manyu1,Yin Liping2,Guo Shuiliang1* (1.College of Life and Environmental Sciences,
Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine
Bureau,Shanghai 200315,China)
Summary  Sorghum halepense (L.)Pers is an important quarantine weed,which is native to the
Mediterranean region,and now is considered as one of the ten worst weeds in the world.The species is mainly
dispersed by seeds.Sorghum almum Parodi is also an important weed,and Sorghum bicolor (L.)Moench and
Sorghum sudanense(Piper)Stapf are two cultivated plants.Due to their morphological similarity,it is difficult
for entry-exit inspection and quarantine departments to properly and quickly identify the seeds of S.halepense
from those of its closed species.Therefore,how to identify the seeds of S.halepensefrom those of its congeneric
浙江大学学报(农业与生命科学版)
species is urgently needed.
In this paper,seeds from the above four species were extracted with petroleum ether to get their extractions,
which were analysed by ultraviolet(UV)spectrophotometer(Unicam UV540)to get 200UV absorbance data
within 200-400nm with 1nm slit and at a scan rate of 0.5s.From these 200absorbance data,the sensitive
wavelengths whose absorbance data could be separated each other were firstly identified by SPSS 16.0using one-
way analysis of variance(ANOVA).From these preliminarily-selected sensitive wavelengths,more sensitive
wavelengths with high information load were further identified by principal component analysis(PCA).With the
absorbance data of these informative wavelength spectra in relation to four species,both cluster analysis and PCA
were applied to produce a dendrogram and a two-dimensional scatter plot,respectively.In order to verify the effect
of the informative wavelengths which were selected by one-way ANOVA and PCA,a spectrum chart,a
dendrogram,a two-dimensional scatter plot from PCA were directly produced on the basis of the absorbance data
corresponding to the 200wavelengths.
According to the above procedures,sixty-three wavelengths were preliminarily selected by using ANOVA.
From these wavelengths,eighteen informative wavelengths from 283to 300nm with a step of 1nm were identified
by PCA.On the dendrogram,the scatter plot and the spectrum chart produced based on these eighteen informative
wavelengths,the seed samples of S.halepense and its three congeneric species were wel separated each other.Al
these three schemes were better than those on the basis of the absorbance data corresponding to the 200
wavelengths in the seed identification of these four Sorghumspecies.
The above results indicate that the extraction scheme with petroleum ether,and the selected eighteen
informative wavelengths by ANOVA and PCA,as wel as the charts by cluster analysis,PCA,or directly based
on absorbance data are effective to identify the seeds of S.halepense from those of S.bicolor,S.almumand S.
sudanense.
Key words Sorghum halepense (L.)Per;ultraviolet spectrum;one-way analysis of variance;ordination;
cluster analysis
  假高粱[Sorghum halepense(L.)Per]是禾本
科高粱属多年生杂草,原产于地中海地区,是世界上
危害大、难防除的十大恶性杂草之一。已有53个国
家将假高粱入侵视为严重问题,特别是中东、地中
海、印度、澳大利亚、南美洲中部和北部地区以及美
国的墨西哥湾沿岸[1]。假高粱被中国、美国、澳大利
亚和欧洲大部分国家列为检疫性杂草,中国农业部
早在1995年就将假高粱列为我国进口植物检疫对
象[2]。苏丹草[Sorghum sudanense(Piper)Stapf]
原产于北非,是当前世界各国栽培最普遍的一年生
禾本 科 牧 草[3]。高 粱 [Sorghum bicolor (L.)
Moench]为重要的农作物,在我国南北各省区均有
栽培。黑高粱(Sorghum almum Parodi)分布于阿
根廷、美国、智利、新西兰、澳大利亚、南非等地,其根
茎不如假高粱发达,但与假高粱生长习性相似,所以
黑高粱与假高粱常混合发生,对农作物造成危害,我
国已将其定为有害杂草实施检疫监控,其他许多国
家还没有将其作为检疫对象[4]。
假高粱常常通过混杂在货物中而被传播扩散。
由于假高粱与同属的高粱、黑高粱和苏丹草种子形
态相似,出入境检验检疫部门面临着如何正确、快速
地鉴别出假高粱及其近缘种的问题。目前主要通过
形态学观察、染色体计数和核型、生物化学和分子标
记的方法来区别假高粱与近缘植物种子[5-8]。高粱
属植物种子形态相似,难于仅仅基于形态进行有效
的鉴别;同时,假高粱与黑高粱等染色体数相同,核
型上极为相似,且核型分析需要根尖幼芽,操作复
杂,用到的试剂毒性较大;限制性内切酶片段长度多
态性和随机扩增多态性DNA等分子标记手段虽然
也用于假高粱及近缘种的分类鉴别中[9-10],但是用
这类方法检测需要多达几周时间,难以满足货物快
速通关的要求,而且费用也较高。因此,迫切需要一
种快速有效、简便地鉴别假高粱与近缘植物种子的
方法。紫外光谱法由于样品处理简单、操作快速、仪
器普及率高而被广泛地应用于中药材的真伪和优劣
鉴别中[11-12],也辅助于某些生物类群的分类识
别[13],但是该方法尚没有应用到杂草种子鉴别中。
因此,本文探讨了紫外光谱法应用于假高粱和近缘
植物种子快速识别的技术参数,以期实现海关部门
对检验检疫对象的快速鉴定,从而满足货物快速通
224 第4 1卷 
刘小慧,等:检疫性杂草假高粱与近缘植物种子的波谱鉴别方法
关的要求。
1 材料与方法
1.1 实验原理
光谱检索方法是一种将光谱数字化后利用某种
算法对未知物谱图和谱库标准谱图进行一个数据点
对一个数据点的光谱匹配,最后找到最佳值,从而获
得对未知物鉴定的方法;用该方法对未知物进行分
类鉴别已有成功的应用报道[14]。
假高粱与高粱、黑高粱、苏丹草种子形态相似,但
是它们的种子在化学成分组成上可能有一定差异,这
种差异有可能反映在它们的紫外光谱上。先用某种溶
剂获取它们的种子浸提液,再获取一定波段范围内若
干紫外光谱数据;由于不同波段上的紫外吸光度在假
高粱与近缘种之间的差异程度不同,通过单因素方差
分析,筛选出差异显著的敏感波段,再基于这些波段作
连续波谱、排序和聚类图,如果这些图谱上假高粱与近
缘种能够明显的区别,说明以上方法能够识别假高粱
和近缘植物种子;最后通过优化,建立假高粱、高粱、黑
高粱和苏丹草种子有显著差异的敏感波段吸光度数据
库。在实际应用中,检疫部门只要通过规范的操作流
程获取待检疫种子在这些敏感波段的数据,再基于这
些数据与数据库的值进行聚类和排序分析,或直接做
出它们的紫外光谱图,从而辅助判别它们是否为假高
粱种子。
1.2 材料
假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草种子由上海出入
境检验检疫局植物检疫实验室提供。实验开始前将
种子于室内干燥通风处晾干,并保存于纸袋内。
1.3 紫外光谱数据获取方法
分别称取假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草种子各
3份,每份0.2g,置于50-mL具塞锥形瓶中,分别加
入分析纯石油醚20mL,密塞,室温放置,浸泡2.5h
后过滤,根据滤液情况稀释至100mL,置于1cm石
英比色杯中,以相应溶剂作为空白对照,在 Unicam
UV540型紫外分光光度计上扫描。波长范围:200
~400nm,狭缝:1nm,扫描速度:0.5s,获取每种植
物种子在200个紫外波段上的吸光度。
1.4 数据分析
利用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析,明
确假高粱与近缘植物种子在哪些波段上存在显著和
极显著差异,并过滤掉差异性小的波段。基于假高
粱与近缘植物种子在紫外光谱波段上差异显著的吸
光度数据,分别应用Excel 2007和PC-ORD 5.0软
件做出杂草种子石油醚提取液的紫外光谱图、聚类
和二维排序图。聚类分析时,采用Sorensen(Bray-
Curtis)作为样品之间的距离系数,采用最近邻体法
(nearest neighbor)作为聚类策略。
为比较单因素方差分析和主成分分析后的数据
对鉴别假高粱种子的效果,本文直接基于200个波
长上的吸光度数据,应用相同软件和参数做出了假
高粱、高粱、黑高粱和苏丹草12个样品的紫外光谱、
聚类和二维排序图。
2 结果
假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草种子石油醚提取
液在200~400nm波段上的吸光度数据详见附表1
(http://www.journals.zju.edu.cn/agr/CN/
article/showSupportInfo.do?id=10306)。通过单
因素方差分析,从200个波段中筛选出63个在假高
粱、高粱、黑高粱和苏丹草之间有显著差异的波段,
在此基础上,应用主成分分析,获得了18个信息负
荷量大的波段(表1)。
基于表1的数据,对假高粱、高粱、黑高粱和苏
丹草的12个样品进行聚类分析和主成分分析,分别
得到图1和图2。
聚类分析表明,基于18个波段上的吸光度数
据,在图1虚线处能够有效地将假高粱、高粱、黑高
粱和苏丹草4种植物种子区分出来,其中,假高粱与
高粱、苏丹草与黑高粱又分别聚为一组。
主成分分析同样显示这4种植物种子在18个
波段上有极明显的区别(图2),利用排序也极容易
将假高粱与其他3种近缘植物种子区分出来。
直接基于18个波段上的吸光度数据作光谱图
(图3),也基本上能够识别出假高粱与其他3种植
物种子,但是区分度明显小于聚类(图1)和排序分
析图(图2)。
如果对数据不进行筛选,直接以原始的200个数
据进行聚类(图4)和主成分分析(图5),也能够识别出
假高粱和其他3种近缘植物种子。从图4中可以看
出,苏丹草首先与黑高粱聚在一起,再与假高粱聚在一
起,而高粱与前三者的关系最远。从图5中也可以看
出,假高粱、苏丹草和黑高粱的关系最近,高粱与它们
的关系最远,但该排序图对假高粱的区分度比图2差。
而如果直接基于200个波段上的吸光度数据作光谱图
(图6),则无法识别出假高粱与其他3种植物种子。
324 第4期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
表1 假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草种子石油醚提取液的18个波段吸光度
Table 1 Absorbance data based on 18wavelengths of extracts of S.halepense,S.bicolor,S.almumand S.sudanense with petroleum ether
λ/nm
  假高粱S.halepense     高粱S.bicolor     黑高粱S.almum     苏丹草S.sudanense  
h1 h2 h3 b1 b2 b3 a1 a2 a3 s1 s2 s3
283  0.047  0.047  0.047  0.046  0.045  0.046  0.057  0.058  0.058  0.064  0.062  0.059
284  0.046  0.045  0.046  0.044  0.043  0.045  0.055  0.056  0.057  0.064  0.060  0.058
285  0.044  0.044  0.043  0.044  0.042  0.044  0.053  0.054  0.055  0.062  0.059  0.056
286  0.043  0.044  0.042  0.043  0.042  0.044  0.052  0.053  0.054  0.060  0.057  0.056
287  0.043  0.042  0.041  0.042  0.042  0.042  0.051  0.052  0.053  0.060  0.057  0.055
288  0.041  0.040  0.039  0.041  0.039  0.042  0.049  0.050  0.050  0.057  0.055  0.052
289  0.039  0.037  0.038  0.039  0.038  0.040  0.047  0.048  0.049  0.056  0.053  0.051
290  0.037  0.036  0.036  0.038  0.036  0.038  0.045  0.046  0.047  0.055  0.051  0.049
291  0.036  0.035  0.035  0.037  0.036  0.038  0.045  0.046  0.046  0.054  0.051  0.049
292  0.033  0.033  0.032  0.035  0.034  0.036  0.041  0.043  0.044  0.051  0.049  0.046
293  0.034  0.032  0.032  0.035  0.033  0.036  0.041  0.042  0.043  0.052  0.048  0.046
294  0.032  0.031  0.031  0.034  0.033  0.035  0.039  0.040  0.041  0.049  0.048  0.045
295  0.029  0.029  0.028  0.032  0.031  0.033  0.037  0.039  0.040  0.048  0.046  0.043
296  0.030  0.029  0.028  0.032  0.031  0.033  0.037  0.038  0.039  0.048  0.045  0.043
297  0.029  0.028  0.028  0.032  0.031  0.032  0.035  0.036  0.037  0.047  0.044  0.042
298  0.028  0.027  0.026  0.031  0.029  0.031  0.035  0.036  0.037  0.046  0.044  0.042
299  0.028  0.028  0.026  0.031  0.030  0.031  0.035  0.036  0.036  0.047  0.044  0.042
300  0.027  0.027  0.027  0.031  0.029  0.030  0.035  0.036  0.036  0.046  0.043  0.042
(b1~b3):高粱;(h1~h3):假高粱;(a1~a3):黑高粱;(s1~s3):苏丹草。
(b1-b3):S.bicolor;(h1-h3):S.halepense;(a1-a3):S.almum;(s1-s3):S.sudanense.
图1 基于表1中18个波段吸光度数据的假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草12个样品的聚类分析图
Fig.1 Cluster dendrogram of 12samples of S.halepense,S.bicolor,S.almumand S.sudanense based on absorbances of 18wavelengths
shown in Table 1
424 第4 1卷 
刘小慧,等:检疫性杂草假高粱与近缘植物种子的波谱鉴别方法
  (a1~a3):黑 高 粱;(h1~h3):假 高 粱;(s1~s3):苏 丹 草;
(b1~b3):高粱。
(a1-a3):S.almum; (h1-h3):S.halepense; (s1-s3):S.
sudanense;(b1-b3):S.bicolor.
图2 基于表1中18个波段吸光度数据的假高粱、高粱、黑高
粱和苏丹草12个样品的主成分分析图
Fig.2 Two-dimensional scatter plot of 12samples of S.halepense,
S.bicolor,S.almum and S.sudanense based on the
absorbances of 18wavelengths shown in Table 1by principal
component analysis(PCA)
(b1~b3):高粱;(a1~a3):黑高粱;(s1~s3):苏丹草;(h1~h3):假高粱。
(b1-b3):S.bicolor;(a1-a3):S.almum;(s1-s3):S.sudanense;(h1-h3):S.halepense.
图3 基于表1中18个波段吸光度数据的假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草12个样品的紫外光谱
Fig.3 UV spectra of 12samples of S.halepense,S.bicolor,S.almumand S.sudanense based on the absorbances of 18wavelengths
shown in Table 1
  (b1~b3):高粱;(s1~s3):苏丹草;(a1~a3):黑高粱;(h1~h3):假高粱。
(b1-b3):S.bicolor;(s1-s3):S.sudanense;(a1-a3):S.almum;(h1-h3):S.halepense.
图4 基于200个波段吸光度数据的假高粱、高粱、黑高粱和苏丹草12个样品的聚类分析图
Fig.4 Cluster dendrogram of 12samples of S.halepense,S.bicolor,S.almumand S.sudanense based on the absorbances of 200
wavelengths
524 第4期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
  (a1~a3):黑高粱;(h1~h3):假高粱;(s1~s3):苏丹草;
(b1~b3):高粱。
(a1-a3):S.almum;(h1-h3):S.halepense;(s1-s3):S.
sudanense;(b1-b3):S.bicolor.
图5 基于200个波段吸光度数据的假高粱、高粱、黑
高粱和苏丹草12个样品的主成分分析图
Fig.5 Two-dimensional scatter plot of 12samples of S.
halepense,S.bicolor,S.almumand S.sudanense
based on the absorbances of 200wavelengths by PCA
  (b1~b3):高粱;(h1~h3):假高粱;(a1~a3):黑高粱;
(s1~s3):苏丹草。
(b1-b3):S.bicolor;(h1-h3):S.halepense;(a1-a3):S.
almum;(s1-s3):S.sudanense.
图6 基于200个波段吸光度数据的假高粱、高粱、黑高
粱和苏丹草12个样品的紫外光谱图
Fig.6 UV spectra of 12samples of S.halepense,S.bicolor,
S.almumand S.sudanense based on the absorbances of
200wavelengths
3 讨论
本研究基于石油醚提取液获得了假高粱、高粱、
黑高粱和苏丹草这4种植物种子在18个敏感波段
(283~300nm)上的紫外光谱数据,测定数据的重
复性好,与其他样品也能明显的区别开;同时,基于
这18个敏感波段的光谱数据进行的聚类和排序分
析能够在一定程度上对这4个植物种子进行区分。
由于植物种子的化学成分受到生长环境、成熟
度、贮存时间和环境的共同影响,今后应该摸索不同
环境条件对假高粱及近缘植物种子紫外光谱的影
响;其次,本研究仅限于目前出入境检验检疫部门从
进出口货物中截获的高粱、黑高粱和苏丹草这3种
假高粱近缘种子,由于高粱属植物种类繁多,下一步
应该扩大种类范围,以确定在更广泛的种类范围内
鉴别假高粱的光谱数据。
陈国奇等[13]认为,基于红外光谱数据探讨植物
类群的亲缘关系或分类关系还有很大的局限性,该
方法仅在十字花科、伞形科和菊科等富含某些特殊
化学成分的类群上比较适用,而对于化学成分比较
单一的禾本科、莎草科等植物该方法并不适合。本
文基于紫外光谱数据,首先应用单因素方差分析筛
选出研究对象之间存在显著差异的波段,在此基础
上,应用聚类、排序等多元统计,可能提高了种类识
别的敏感度。事实上,光谱数据的预处理对于后续
的判别有重要作用。黄华军等[15]首先对原始光谱
用移动窗口平均、一阶差分导数和矢量归一化进行
预处理,使用主成分分析和线性判别分析方法降维,
采用仿生模式识别方法建立模型,通过对光谱预处
理校正光谱失真,使样品光谱集在特征空间分布的
范围收缩,相对距离增大,实现了玉米母本和杂交种
子的鉴别。本文采用传统的单因素方差分析方法,
首先筛选出分类群之间有显著差异波段上的吸光
度,再进行后续的分类识别,方法直观,效果明显。
与紫外光谱相比,红外光谱具有更高的灵敏
度,在药物鉴定方面得到了广泛应用。应用傅里
叶变换红外光谱仪直接测定法,具有所需样品量
极少、不需要萃取或粉碎、快速简便的优点,但是
红外光谱仪价格昂贵。相对于其他波谱鉴定法,
紫外光谱法成本低,在波谱法鉴别上有着广泛的
应用,但由于不同的波谱性质不同,鉴别灵敏度有
异,今后可集成应用高光谱成像技术[16]、傅里叶变
换红外光谱、近红外光谱等不同波谱的结果,以进
一步提高鉴别的可靠性。
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624 第4 1卷 
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724 第4期