全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:960-964
文章编号:1001-6880(2007)04-0960-05
　
　
　收稿日期:2006-12-11　　　接受日期:2007-03-13
　基金项目:国家自然科学基金项目(20575039);高等学校博士学
科点专项科研基金项目(20050718011)
＊通讯作者 Tel:86-29-85303939;E-mail:zqzhang@snnu.edu.cn
朱砂七粗多糖的提取及生物活性的研究
崔军见 1, 2 ,原江锋 1, 2 ,张志琪 1, 2＊
1陕西师范大学化学与材料科学学院;
2陕西师范大学 药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室 ,西安 710062
摘　要:首次从朱砂七中提取粗多糖(PCCP), 研究了 PCCP对· OH自由基 、O-2·自由基和 DPPH·自由基的清
除能力以及抗脂质过氧化能力 ,选用人肝癌细胞 HepG2, 经 MTT染色法研究其体外抗肿瘤活性。结果显示 , PC-
CP的浓度在 8.48 mg/mL时 , 对· OH、O-2·和 DPPH·的清除率分别达到了 52.3%、 54.7%和 38.3%;PCCP的
浓度在 8.48 mg/mL时 ,对脂质过氧化的抑制率达到了 62.0%;PCCP的浓度在 277.78 μg/mL时 ,对人肝癌细胞
HepG2的抑制率达到了 42.6%,表明 PCCP具有一定的体外抗氧化能力和体外抗肿瘤活性。
关键词:朱砂七;粗多糖;抗氧化;抗肿瘤
中图分类号:Q503;R932 文献标识码:A
ExtractionandBiologicalActivityofCrudePolysaccharide
fromPolygonumcilinerve
CUIJun-jian1, 2 , YUANJiang-feng1, 2 , ZHANGZhi-qi1, 2＊
1SchoolofChemistryandMaterialScience, ShaanxiNormalUniversity;2KeyLaboratoryofMedicinalPlantResourceand
NaturePharmaceuticalChemistryofMinistryofEducation, ShaanxiNormalUniversity, Xi an710062 , China
Abstract:Crudepolysaccharide(PCCP)wasextractedfromPolygonumcilinerveforthefirsttime.Hydroxylradical, su-
per-oxideanionradical, DPPH· radicalandlipidper-oxidationinhibitionofPCCPwerestudiedinvitro.Theanti-tumor
activitywasevaluatedbyMTTcolorimetricassaywithHepG2.Hydroxylradical, super-oxideanionradicalandDPPH·
radicalwerescavengedby35.1%, 40.7% and38.3% whentheconcentrationofPCCPcameto8.48 mg/mL;Lipid
per-oxidationinhibitionrateofPCCPwas62.0%ataconcentrationof8.48 mg/mL;HepG2inhibitionrateofPCCPwas
42.6% whentheconcentrationofPCCPcameto277.78μg/mL.TheseresultsindicatedthatPCCPhasantioxidantac-
tivitiesandanti-tumorefectsinvitro.
Keywords:Polygonumciliinerve;crudepolysaccharide;anti-oxidation;anti-tumor
　　朱砂七(Polygonumcilinerve),别名朱砂莲 、红
药子 ,始载于 《图经本草 》,为蓼科植物 [ Polygonum
cilinerve(Nakai)Ohwi]的块根 ,产于陕西 、甘肃 、河
南等地 。其味苦 、性凉 ,具有清热解毒 、活血凉血 、止
血止泻 、去风湿 、强腰膝 、抗肿瘤及抗癌袭击的功能 ,
民间广泛用于治疗急性胃痛 、菌痢 、扁桃体炎及跌打
损伤 、风湿腰痛 、肝炎等症 ,与其它草药配伍用于抗
肿瘤及癌袭击转移 ,临床效果显著 ,为 “太白七药 ”
之一[ 1] 。现代药理研究及临床治疗表明朱砂七具
有抗炎 、抗菌 、抗病毒 ,抗肿瘤等作用 。文献报道 ,朱
砂七含大黄甙 (rhapontin)及蒽醌类物质:大黄酚
(chrysophanol)、大黄素甲醚 (physcion)、大黄酸
(rhein)、大黄素(e-modin)和大黄素-8-氧 -D-葡萄糖
甙[ 2] 。对朱砂七多糖的研究尚未见报道 ,本研究从
朱砂七提取粗多糖(CrudePolysaccharideofPolygo-
numcilinerve, PCCP),并对它的抗氧化活性以及抑
制人肝癌细胞 HepG2生长的能力进行了研究。
1　实验材料
1.1　药材
朱砂七 , 2005年 11月份采于陕西太白山 ,室藏
标本号为 PT200511 ,经本重点实验室任毅教授鉴
定 ,贮藏于陕西师范大学植物标本室 。取清洗干燥
后的块状根粉碎 ,过 50 ～ 60目筛 ,备用。
1.2　试剂
邻二氮菲;过硫酸铵(AP);N, N, N′, N′-四甲基
DOI :10.16333/j.1001-6880.2007.06.020
乙二铵(TEMED);α-萘胺;三氯乙酸(TCA);硫代巴
比妥酸(TBA);四苯基氮唑蓝 (MTT);二甲基亚砜
(DMSO)等 ,以上试剂均为分析纯。二苯代苦味酰
肼(DPPH),购自 Sigma公司;透析袋(相对分子质
量 8000 ～ 10000),购自华美生物试剂有限公司;人
源性肝癌细胞 HepG2,购自中科院上海细胞库;RP-
MI-1640,小牛血清 FBS,购于 Gibco公司 。
1.3　仪器
AnkeTGL-18C-C型离心机;RE-52A旋转蒸发
器;724微型可见分光光度计;37XB型倒置显微镜;
POLARstarOPTIMA型多功能微板测试系统等 。
2　实验方法
2.1　朱砂七粗多糖(PCCP)的提取
称取干燥后经粉碎的朱砂七药材 60 g,分别用
石油醚 、乙醇脱脂 2 h。分别加入 600、400、200 mL
蒸馏水 ,时间为 4、3、2h,在 90 ～ 100 ℃提取三次 ,用
六层纱布除去药渣 ,合并三次滤液 ,滤液旋转蒸发浓
缩至 60 mL, 8, 000g离心 15 min后 ,取上层溶液流
水透析过夜 ,浓缩后加入乙醇 , 使乙醇终浓度为
80%,沉淀多糖 ,静置过夜。沉淀用砂心漏斗抽滤 ,
再用 95%的乙醇 、丙酮 、乙醚洗涤多糖 ,干燥 ,制得
粗多糖 ,称重为 3.056 g,朱砂七粗多糖的产率为
5.1%。采用苯酚-硫酸法测定 PCCP中多糖的含
量 ,测得其多糖的质量分数为 91.8%。
2.2　样品溶液的制备
精密称取 PCCP1.06 g,用蒸馏水定容到 50 mL
的容量瓶 ,制备成 21.24 mg/mL的溶液。再移取
1.25、2.50、5.00、7.50、8.75、10.00 mL溶液分别定
容到 25 mL的容量瓶中 ,稀释成 1.06、2.12、4.24、
6.36、7.42、8.48mg/mL的粗多糖溶液 ,备用 。
2.3　PCCP对 ·OH的清除能力
采用 Fenton反应研究 PCCP对 · OH的清除能
力 [ 3, 4] 。在反应体系中分别加入 0.75 mmol/L的邻
二氮菲 1.00mL, 0.150mol/L的 PBS(pH7.4)1.50
mL,充分混匀后 ,加入 0.75 mmol/L的 FeSO4溶液
1.00mL,加后立即混匀。然后再向反应体系中加
入不同浓度的多糖溶液 1.00 mL,混匀 ,用 Vc做阳
性对照 。另设阴性对照管和正常管 ,不加糖液 。再
分别加入 0.01%的 H2O2溶液 1.00mL,正常管不加
H2O2溶液 ,以等体积蒸馏水补充体积 。在 37 ℃水
浴中孵育 30 min,测定 A536 nm,做三次平行实验 。
· OH的清除率 =[ (A2 -A1)/(A0 -A1)] ×100%
其中 , A0正常管吸光值 , A1阴性对照管吸光值 ,
A2加样管吸光值。
2.4　PCCP对 O-2·的清除能力
向反应体系中分别加入 AP溶液 0.40 mL,
TEMED溶液 1.60mL,反应 1 min后 ,加入不同浓度
的多糖溶液 ,混匀 ,以相同体积的蒸馏水做对照。再
加入 0.010 mol/L盐酸羟胺 0.40 mL,在 25 ℃混合
反应 20 min后 , 加入 0.017 mol/L对氨基苯磺酸
2.00 mL和 0.7 mmol/L的 α-萘胺 2.00 mL,然后在
25 ℃反应 25min,反应后的显色液用 5.00 mL正丁
醇充分振荡 ,静置分层 ,取正丁醇相测 A530 nm,做三
次平行实验[ 5] 。用 Vc和香菇多糖做阳性对照。
O-2·的清除率 =[ (a-b)/ a] ×100%
其中 , a为对照的吸光值 , b为 PCCP、Vc和香菇
多糖溶液的吸光值 。
2.5　PCCP对 DPPH·的清除能力
取不同浓度 PCCP溶液 2.00 mL, 加入 0.30
mmol/LDPPH·甲醇溶液 4.00 mL,立即混匀 , 反应
30 min后 ,用分光光度计测 A517nm。用 Vc和香菇多
糖做阳性对照 。样品对 DPPH·的清除率可由下式
得到 [ 6, 7] :
DPPH·的清除率(%)=[ 1-(A1 -A2)/A0 ]
×100%
其中 , A0为 2.00 mL无水甲醇 +4.00 mL0.30
mmol/LDPPH·甲醇溶液在 517 nm处的吸光度;A1
为 2.00 mL待测试样溶液 +4.00 mL0.30 mmol/
LDPPH·甲醇溶液在 517 nm处的吸光度;A2 为
2.00 mL待测试样溶液 +4.00 mL无水甲醇在 517
nm处的吸光度 。
2.6　PCCP对脂质过氧化抑制作用的研究
脂质体分散液的制备:将 10.00mL蛋黄溶解于
10 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.45)中 ,制备成 10%
的脂质体分散液 ,备用。
取 0.50 mL卵磷脂乳浊液 ,加入 1.00 mL不同
浓度的 PCCP溶液 , 100 μL25 mmol/L的 FeSO4溶
液 , 1.50 mL的蒸馏水。正常管和对照管不加多糖
液 ,其他试剂同前 。将上述试管 37℃下水浴 2h,取
出后 ,加入 1.50 mL20%的乙酸溶液 , 100 μL20%
的 TCA,静置 10 min后加入 1.50 mL0.8%的 TBA
和 1.1%的 SDS的混合液 ,正常管不加 TBA。于 95
℃下反应 15 min,冰水冷却后 10, 000 g/min离心 5
min,取上清液 ,测 A532 nm,做三次平行实验 [ 8, 9] 。用
Vc和香菇多糖阳性对照。
961Vol.19 崔军见等:朱砂七粗多糖的提取及生物活性的研究
2.7　MTT法测 PCCP对人肝癌细胞 HepG2的生长
抑制作用
取处于对数生长期的 HepG2细胞 , 0.25%的胰
蛋白酶液消化成细胞悬液 。用 0.4%台盼蓝染色后
计数。用含 10% FBS的 RPMI-1640培养液稀释细
胞悬液使细胞浓度至 1×105个 /mL,接种于 96孔平
底培养板 ,每孔接种 150 μL。 37 ℃、5%CO2饱和湿
度条件下在培养箱内培养 24 h,实验组每孔加入用
RPMI-1640完全培养基稀释的不同浓度的多糖溶液
各 50μL,阴性对照组加 RPMI-1640完全培养基 50
μL,另设空白组 , 每组设 4个复孔 ,于 37 ℃、5%
CO2培养箱中继续培养 24 h后 ,每孔加 20 μLMTT
(5mg/mL)温育 4h,弃去培养液 ,加入 150mLDM-
SO,水平振荡数次 ,使紫色结晶全部溶解 ,多功能微
板测试系统于 492 nm处读板 ,根据测得的光密度值
(OD值),计算细胞的抑制率 [ 10] :
细胞生长抑制率 =(1-实验组 OD值 /对照组
OD值)×100%
3　实验结果
3.1　PCCP对 ·OH的清除能力
利用 Fenton反应 ,检测 PCCP对羟基自由基的
清除作用 ,结果如图 1所示 。可以看出 , PCCP表现
出一定的清除羟自由基的活性 , PCCP的浓度在 8.48
mg/mL时 ,清除率达到了 52.3%,且对羟自由基的
清除率随着浓度的增加而增加 ,在所选浓度范围内 ,
清除率与浓度呈量效关系 。阳性对照组 Vc的浓度
在 200、400 mg/L时 ,清除率分别达到了 52.3%和
85.7%。
图 1　朱砂七粗多糖对· OH的清除作用
Fig.1　Eliminationeffectofcrudepolysaccharideonthe· OH
3.2　PCCP对超氧离子的清除能力
采用 AP-TEMED体系研究了 PCCP对超氧离子
自由基的清除作用 ,以 Vc为阳性对照 。由表 1可以
看出 Vc的浓度在 200 mg/L时 , 清除率达到
66.0%, PCCP的浓度在 6.36 mg/mL时 ,清除率达
到了51.4%,且在所选的浓度范围内 ,清除 O-2·的
能力随着 PCCP的浓度升高而增强 ,呈现出量效关
系。
3.3　PCCP对 DPPH·的清除能力
以 Vc和香菇多糖为阳性对照 ,研究了 PCCP对
DPPH·的清除能力 ,结果如表 2,可以看出香 Vc、菇
多糖和 PCCP都表现出一定的清除 DPPH·的能力 ,
其中 Vc的清除 DPPH·的活性最高 , 浓度在 200
mg/L时达到了 88.3%, 香菇多糖的浓度在 1.00
mg/mL时的清除率达到了 33.7%, PCCP的浓度在
8.48 mg/L时清除率达到了 38.3%,且在所选的浓
度范围内 ,呈现出量效关系。
表 1　朱砂七粗多糖对 O-2·超氧离子的清除作用
Table1　EliminationeffectofcrudepolysaccharideontheO-2·
组名
Group
样品浓度
Concentration
(mg/mL)
清除率
Seavengingrate
(%)
Vc 200 66.0
PCCP 1.05 11.3
2.12 27.4
4.24 43.9
6.36 51.4
8.48 54.7
表 2　朱砂七粗多糖对 DPPH·的清除作用
Table2　EliminationeffectofcrudepolysaccharideontheDPPH·
组名
Group
样品浓度
Concentration
(mg/mL)
清除率
Seavengingrate
(%)
Vc 200 88.3
香菇多糖 1.00 33.7
PCCP 1.06 12.1
2.12 18.0
4.24 21.5
6.36 35.7
8.48 38.3
3.4　PCCP对脂质过氧化的抑制作用
卵磷脂 C-2位上所含极低密度脂蛋白和低密度
脂蛋白的过不饱和脂肪酸 ,在亚铁离子的催化下 ,经
振荡 ,能诱发脂质过氧化 ,产生烷氧基(LO· )和烷
基过氧基(LOO· )。在加热的条件下 ,过氧化物可
与硫代巴比妥酸(TBA)反应产生红色化合物 ,并在
A532 nm处有显著的光吸收 。实验结果如表 3所示 ,加
入 200mg/L的 Vc后 , A532nm明显降低 ,同时 ,加入不
同浓度的 PCCP和香菇多糖的 A532 nm都有不同程度
的降低 ,表明在 Fe2+诱导体系中 , PCCP对脂质过氧
962 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.19
化有一定的抑制作用 ,从表 3可以看出 , PCCP的浓
度在 8.48 mg/mL时对脂质过氧化的抑制率达到了
62.0%,香菇多糖的浓度在 1.00 mg/mL时对脂质
过氧化的抑制率达到了 44.5%,证明了 PCCP具有
一定的抗脂质过氧化能力 。
表 3　朱砂七粗多糖对脂质过氧化的抑制作用
Table3　Inhibitionofcrudepolysaccharideonthelipidperoxi-
dation
组别
Group
样品浓度
Concentration A532nm
抑制率(%)
Inhibitoryrate
正常组 0 0.224 -
模型组 0 1.187 -
Vc 200 0.356 70.0
香菇多糖 1.00 0.655 44.5
PCCP 1.06 0.809 31.8
2.12 0.783 34.0
4.24 0.652 45.1
6.36 0.588 50.5
8.48 0.451 62.0
3.5　PCCP对 HepG2人肝癌细胞的生长抑制作用
采用 MTT法测定 PCCP对人肝癌细胞 HepG2
的生长抑制作用 ,实验结果如图 2所示 , PCCP低浓
度与高浓度对 HepG2的生长抑制率差异显著 ,说明
PCCP有抑制 HepG2生长的能力。在所选的浓度范
围内 ,与 PCCP呈剂量依赖关系 ,随着多糖的浓度增
加而增加。 PCCP的浓度在 277.78μg/mL时 ,对人
肝癌细胞 HepG2的抑制率达到了 42.6%。
图 2　朱砂七粗多糖对 HepG2人肝癌细胞的抑制作用
Fig.2　InhibitionofcrudepolysaccharideontheHepG2
4　讨论
近年来 , “氧化应激”(oxidativestres)及它对人
体产生的影响的研究引起了人们的极大兴趣。活性
氧(ROS)是通过阳光照射 、紫外辐射 、电子辐射 、化
学反应以及人体代谢产生的 ,它的产生破坏了机体
平衡 、造成 DNA的破坏 、致癌和细胞老化 [ 11] ,因此
研究对这些活性基团的清除是非常必要的。目前 ,
清除自由基应用较多的有 Vc、Ve和甘露醇 ,另外 ,
酚类物质有很好的清除自由基的活性 ,但它在清除
自由基的同时也造成了对机体的负面影响 [ 12] 。
近年来对多糖的研究不断深入 ,发现多糖有良
好的抗氧化活性 ,在清除自由基方面 ,作为药物 ,多
糖所产生的毒副作用小 。研究表明 ,多糖及糖复合
物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料 ,更
重要的是它存在于一切细胞膜结构中 ,参与生命现
象中细胞的各种活动。另外 ,中药多糖因具有增强
机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用 ,而且几乎没有
毒性 ,愈来愈引起人们的兴趣 ,成为当前的研究热
点。
本实验从清除自由基 、抗脂质过氧化以及抑制
人肝癌细胞的生长等方面研究了 PCCP的生物活
性。实验结果显示 PCCP具有一定的清除自由基的
能力 ,在浓度为 8.48 mg/mL时 ,对 · OH自由基的
清除率达到了 52.6%, 对 O-2 ·的清除率达到了
54.7%。另外 ,在应用二苯代苦味酰基(DPPH· )
进行抗氧化评价时 , PCCP对 DPPH·清除虽不及香
菇多糖和 Vc,但是也显示出一定的清除活性;用
Fe2+诱导脂质过氧化体系 ,结果显示 PCCP具有明
显的抗脂质过氧化能力 ,这可能是由于 PCCP具有
双键共轭结构 , PCCP具有清除自由基的能力是其
具有抗氧化的主要原因;采用 MTT法检测 PCCP对
人肝癌细胞株 HepG2的抑制作用 ,发现有显著性差
异 ,当 PCCP的浓度在 277.78 μg/mL时对 HepG2
的抑制率达到了 42.6%,说明了 PCCP具有抑制肿
瘤细胞增殖的作用 。
本项研究从五个方面探索了 PCCP的生物活
性 ,结果显示出 PCCP具有一定的体外抗氧化能力
和抑制肿瘤细胞生长的作用 ,而朱砂七多糖的体内
活性还有待进一步的研究。
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