全 文 ：— 50 — 现代中药研究与实践2009年第23卷第5期Research and Practice of Chinese Medicines
脱蛋白法和脱色法纯化珠子参多糖的工艺研究
刘小琴，陈 涛，巩仔鹏 *，唐金毅
（三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002）
摘要：目的 优化珠子参粗多糖的纯化工艺。方法 主要对珠子参多糖提取中脱蛋白和脱色方法进行
优化，从而得到最佳纯化工艺。结果 在 30 ℃加入链酶蛋白酶和三氯乙酸于冰箱放置过夜，再采用 Sevage
法共同除蛋白的方法效果最好；脱色则在 30 ℃用 7.5%~8%H2O2溶液最好。结论 本方法用于脱色及去除
珠子参粗多糖中蛋白质成分切实可行，可作为纯化珠子参粗多糖的纯化手段之一。
关键词：珠子参粗多糖；脱蛋白；纯化
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2009)05-0050-04
Studies on the Purifi cation Technology of Rhizoma Panzcis Majoris
Polysaccharide by Deproteinization and Decolorization Methods
LIU Xiao-qin, CHEN Tao, GONG Zi-peng, TANG Jin-yi
( Medical College, Three Gorges University, Yichang 443002, China )
Abstract: Objective To optimize the purification technology of Rhizoma Panzcis Majoris crude
polysaccharide. Methods The main purpose is to optimize the way of deproteinization and decolorization.
Chiefly, we compares two methods which are Sevage and TCA, in order to find out the best way to optimize
removing proteins. Secondly, we control one variable to get the best usage amount. Then, in order to fi nd the best
technology of decolorization we compare three decolored approachs as follows resin, hydrogen peroxide and
absorbite. Conclusion Using Sevage and TCA together with pronase to remove proteins and using 7.5%~8%
hydrogen peroxide to decolor is the best way to optimize purifi cation technology of Rhizoma Panzcis Majoris
polysaccharide. Results The method can be used effectively to decolor and remove proteins from Rhizoma
Panacis Majoris crude polysaccharide as well as an effective purifi cation method.
Key words: Rhizoma Panzcis Majoris crude polysaccharide; deproteinization; purifi cation
收稿日期：2008-12-31
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目，（NO. 2006ABA200）
作者简介：刘小琴（1956-）女，副教授，主要从事天然产物的研究。
*通讯作者：巩仔鹏 ，E-mail:gzp4012607@sina.com
显著的影响。因 A项（溶媒量）及 B项（提取时间）
对水提取均没有显著性差异，正交设计的结果以综
合评分为标准，选择综合评分中最大的一项，最终
确定 A3B1C3为最佳提取工艺。
3 讨论
本实验提取溶媒的考察结果表明，水提的出膏
率、咖啡酸含量及二萜酸含量最高，故选择用水做
为提取溶媒，这与日本将亚贡叶加工成茶饮的理论
相对应。
此外，亚贡二萜酸是作者实验中新发现的一种
最主要降糖成分，分别为亚贡二萜酸 A、亚贡二萜
酸 B、亚贡二萜酸 C、亚贡二萜酸 D[4]。本实验采用
水提可提出少量的亚贡二萜酸 A和 C。说明以水做
溶媒能够提出多种降糖活性成分。以绿原酸和咖啡
酸为主要测定指标，采用正交试验设计的方法来选
择最佳提取工艺，简便、稳定，为工业生产提供了
参考依据。
参考文献
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DOI:10.13728/j.1673-6427.2009.05.024
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珠子参 Panax japlcus var,major，为五加科植物
珠子参或羽叶三七的干燥根茎，主要分布于东喜马拉
雅至我国西部山区 [1]。化学研究表明 ,珠子参主要含
有多种皂苷、多糖、氨基酸和多种微量元素等 [2]。药
理研究证实 ,植物多糖除有免疫调节、抗肿瘤生物学
效应外 , 还有延缓衰老、抗病毒、抗辐射等作用 ,且
对机体毒副作用小 [3]。
珠子参多糖的药用价值非常高，特别是在抗肿
瘤方面的应用。现有对珠子参多糖的纯化工艺报道的
较少，本文拟从比较 TCA（三氯乙酸）法和 Sevage
法除蛋白效果，且比较两者对多糖的损失大小，找到
最适合的除蛋白的方法以及最佳的脱色工艺，进而提
高珠子参多糖质量，为实现工业化生产提供依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 AB204-N分析天平（瑞士 Mettler Toledo
公司）；Suprafuge22型高速冷冻离心机（Heraeus公
司）；721E可见分光光度计；KDM型调温电热套。
1.2 试剂 考马斯亮蓝 G-250（Fluka 分装），链酶
蛋白酶 E（华美生物），牛血清白蛋白 V（Roche分装）；
AB-8树脂（南开大学化工厂）；分析纯三羟甲基氨基
甲烷（Tris，北京华美转导科技有限公司提供），与
HCL配成 0.5 mol•L-1 pH 为 7.4 Tris•HCL溶液，其它
试剂均为分析纯；水为双蒸水。
1.3 药材 本次实验药材珠子参产于湖北省神农
架，经宜昌市药品检验所检测，检验结论：本品按
《中国药典》2005年版一部检验，结果符合珠子参
质量标准的规定（检验编号：20061188）。
2 方法与结果
2.1 珠子参粗多糖的提取工艺 根据文献报道 [4]，
将珠子参粗粉，过 50目筛→加 8倍量 95% 乙醇，
浸泡 24 h,回流提取 2次（分别为 3 h,2 h）→过滤，
药液待用；在药渣中再加 8倍量的水，微沸条件下提
取 3次（分别为 3 h,2 h,2 h）→过滤，合并药液，再
经减压浓缩后用 95% 乙醇沉淀至终浓度为 80% →离
心。药渣依次用 95% 的乙醇和丙酮反复洗涤→离心
液与洗涤液合并→真空低温干燥→珠子参粗多糖粗
品。
2.2 珠子参粗多糖的纯化 首先通过比较不同方法
除蛋白的效果，以及通过对多糖的损失的比较找到最
合适的除蛋白的方法，然后对选用的方法进一步优
化，通过单因子试验找到最合适的试剂用量。同样方
法，对脱色条件进行优化，最终确定最佳纯化工艺。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 分别吸取 20，40，
60，80，100，120，140，160 μL 的 1 mg•mL-1 的葡
萄糖标准溶液置于 25 mL的比色管中，定容，然后
分别加入 1.0 mL 6%的苯酚溶液和 7.0 mL的浓硫酸
摇匀，放置 5 min，沸水浴 20 min后，冷却至室温
后在 490 nm处测量其吸光度（A），以浓度（C）
对 A进行线性回归，通过线性分析，得回归方程
为：C=0.006 1 A + 0.006 9 （r=0.999 1，n=8）， 在
40.0~120.0 μg呈良好的线性关系。
2.2.2 蛋白质标准曲线绘制 精密吸取0.2，0.4，0.6，
0.8，1.0 mL 100 μg•mL-1牛血清蛋白标准溶液，分别
放入 5支比色管中，定容，然后分别加入 5 mL考马
斯亮蓝 G-250，盖上塞子放置 2 min，在 595 nm处测
量其吸光度（A），以蛋白质浓度（C）对 A进行线
性回归，通过线性分析，得回归方程为：C=0.005 6
A + 0.058 7（r = 0.999 0，n=5）。结果表明，在取值
范围内线性关系良好。
2.2.3 珠子参粗多糖脱蛋白实验及结果
2.2.3.1 氯仿与正丁醇的体积比对除蛋白质效果比较
取 5 g粗多糖溶于 100 mL，加热溶解，按 “2.2.2”
项下方法测定，未做任何处理的多糖中蛋白质含量吸
光度平均值为 0.770，此值为多糖中蛋白质含量空白。
将粗多糖溶液分装 5个带塞子 EP管，每管 20 mL，
按比例加入氯仿和正丁醇，振荡 20 min，离心，小
心取出上清液按 “2.2.2”项下方法测蛋白质含量吸光
度，并按 “2.2.1”方法分别测 1次与 5 次操作的多糖
含量的吸光度，结果见表 1，表 2。

从表 1、2测定的吸光度值来看，结合除蛋白质
表1 氯仿与正丁醇的体积比对除蛋白质效果（A）比较（均值）
Tab.1 Effects of volume ratio of n-butanol and chloroform on removing
proteintime
氯仿:正丁
醇
3:1
4:1
5:1
6:1
第1次
处理/A
0.502
0.503
0.535
0.500
第2次
处理/A
0.386
0.314
0.334
0.341
第3次
处理/A
0.266
0.190
0.135
0.157
第4次
处理/A
0.215
0.113
0.108
0.109
第5次
处理/A
0.132
0.101
0.068
0.079
表2 氯仿与正丁醇体积比对多糖含量的影响
Tab.2 Effects of volume ratio of n-butanol and chloroform on
polysaccharide content
氯仿:正丁醇
3:1
4:1
5:1
6:1
第1次处理/A
0.934
0.957
0.825
0.944
第5次处理/A
0.646
0.565
0.549
0.612
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的效果与对多糖的损失综合考虑，氯仿与正丁醇的体
积比以 6:1时效果最好。
2.2.3.2 TCA浓度对除蛋白质效果比较 取 5 g粗多
糖溶于 100 mL水中，将溶液加热，分别取 2 mL多
糖溶液置入 50 mL 容量瓶中，然后再加入不同溶度
TCA，摇匀后放置冰箱过夜，24 h 后 10 000 r 离心
20 min，分别按 “2.2.1”项下方法和 “2.2.2”方法测定
吸光度，结果见表 3，表 4。
从表 3，4可以看出，随着 TCA浓度的增大，
蛋白质含量吸光度减低，多糖含量的吸光度也降低；
6% TCA除蛋白质效果最好，但多糖含量降低较多；
综合各方面因素以 5% TCA效果较好，提示可用 5%
TCA脱去珠子参多糖中的蛋白质。
2.2.3.3 Sevage法除蛋白质效果比较 称取 5 g粗多
糖溶于 100 mL水中，将溶液加热，按 25：5：1比
例加入多糖溶液：氯仿：正丁醇，摇匀 20 min，离心，
小心移取上清液，重复多次，直到按 “2.2.2”方法测
得蛋白质含量吸光度值不变为止，同时按 “2.2.1”方
法测多糖含量吸光度值。结果见表 5。
从结果不难看出，Sevage法除蛋白质要应用多
次，蛋白质除的不是很干净，但多糖含量的损失较
小。
2.2.3.4 TCA- Sevage法除蛋白质效果的比较 称取
2 g粗多糖溶于 40 mL水中，加热溶液，加入 TCA
使其浓度为 5%，摇匀，放置 24 h，离心，小心移取
上清液用“2.2.1”方法测多糖含量和用“2.2.2”方法
测蛋白质含量吸光度（A），然后用 Sevage法多次除
蛋白质处理后再按照“2.2.2”方法测蛋白质含量吸
光度值，同时按“2.2.1”方法测多糖含量吸光度值。
结果见表 6。
从表中可以看出，TCA- Sevage法除蛋白质效果
较好，多糖损失较小。
2.2.3.5 酶 -TCA- Sevage法除蛋白质效果的比较 称
取 2 g粗多糖溶于 40 mL水中，将溶液加热。精密称
取链酶蛋白酶溶解在 5 mLpH=7.4 Tris•HCl中，在 30
℃时加入糖溶液，使链酶蛋白酶的浓度为 1%，摇匀
放置 20 min，再加入 TCA使其浓度为 5%，微摇后
放入冰箱24 h，再用 Sevage法除蛋白质，结果见表 7。
从表 7看出，酶与 TCA联合除蛋白质效果比较
好，如果再结合一次 Sevage法，基本可以完全除去
多糖中的蛋白质。
2.2.3.6 结论 用链酶蛋白酶 -TCA- Sevage联合除
蛋白质效果最好。
2.2.4 珠子参多糖脱色实验及结果
将脱蛋白质的样品糖液，透析 3 d，浓缩后，醇
沉使其浓度为 80%，再用 95%乙醇，丙酮依次洗涤
沉淀，真空干燥。干燥品供脱色试验用。
2.2.4.1 多糖溶液的配制和脱色效果的比较 脱蛋白
后的多糖按 1 g溶解于 20 mL水配成多糖溶液；根据
脱色后多糖溶液的吸光度的大小比较脱色效果。
表3 TCA浓度对除蛋白质效果比较
Tab.3 Comparison of different concentration of TCA on removing protein
TCA
第1次处理/A
第2次处理/A
第3次处理/A
4%
0.516
0.375
0.254
5%
0.437
0.300
0.238
6%
0.462
0.304
0.209
8%
0.474
0.260
0.155
10%
0.501
0.214
0.143
15%
0.368
0.189
0.074
表4 TCA浓度对多糖含量影响
Tab.4 Comparison of different concentration of TCA on polysaccharide
content
TCA
第1次处理/A
第2次处理/A
第3次处理/A
4%
0.970
0.848
0.653
5%
0.954
0.836
0.624
6%
0.925
0.642
0.432
8%
0.949
0.511
0.311
10%
0.756
0.450
0.147
15%
0.750
0.358
0.104
表5 Sevage法除蛋白质效果比较
Tab.5 Effects of Sevage method on removing protein
次数
第1次处理/A
第2次处理/A
第3次处理/A
第4次处理/A
第5次处理/A
第6次处理/A
第7次处理/A
蛋白质/A
0.533
0.374
0.314
0.291
0.215
0.178
0.178
多糖/A
0.776
0.728
0.642
0.628
0.619
0.585
0.556
表6 TCA- Sevage法除蛋白质效果的比较
Tab.6 Effects of TCA-Sevage method on removing protein
项目
TCA
Sevage处理1次
Sevage处理2次
Sevage处理3次
Sevage处理4次
Sevage处理5次
蛋白质/A
0.411
0.181
0.155
0.108
0.103
0.074
多糖/A
0.781
0.741
0.730
0.686
0.633
0.618
表7 酶-TCA- Sevage法除蛋白质效果
Tab.7 Effects of Enzyme-TCA-Sevage method on removing protein
测试管编号
1
2
3
平均值
酶-TCA，蛋白质/A
0.084
0.074
0.081
0.080
再用Sevage法，蛋白质/A
0.041
0.040
0.044
0.042
多糖含量/A
0.543
0.540
0.541
0.541
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2.2.4.2 几种脱色剂的处理，脱色效果以及对多糖含
量影响的比较：
① 空白对照：5 mL多糖溶液，30 ℃摇床 3 h →
定容 10 mL，在室温下测 A。
② 树脂处理对照 1 g树脂（AB-8）+ 5 mL多糖
溶液，30 ℃摇床 3 h，移至 10 mL容量瓶，并用少量
的水洗沉淀，最后定容 10 mL，在室温下测 A。
③ 活性 C处理对照事先已活化处理后的活性 C
+ 5 mL多糖溶液，30 ℃摇床 3 h，移至 10 mL容量瓶，
并用少量的水洗沉淀，最后定容 10 mL，使其浓度为
0.1%，在室温下测 A。
④ H2O2溶液对照： 30%H2O2溶液 + 5 mL多糖
溶液，用 NaOH调 pH = 9，30℃摇床 3 h→ 定容 10
mL，使其浓度为 7.5%，测 A。取 1 mL多糖溶液在
60 ℃水浴中摇动，直到没有气泡产生，冷至室温备
用。
2.2.4.3 多糖含量测定 将脱色后的树脂，活性 C和
H2O2溶液分别取 300 μL糖 + 150 μL水 + 450 μL苯
酚 + 2 100 μLH2SO4，沸水浴 15 min，冷至室温，再
在其中取 100 μL +3 mL水在 490 nm测定其多糖含量
的吸光度 A值，结果见表 8。
结果表明，从多糖脱色效果和多糖含量来看，
H2O2溶液处理效果最好。
2.2.4.4 不同浓度的 H2O2处理对脱色效果和多糖含
量的影响
① H2O2 +5 mL多糖溶液，用 NaOH调 pH = 9，
30℃摇床 3 h → 定容 10 mL，使其浓度分别为 7%，
7.5%， 8%，10%，12%，测 A。取 1 mL多糖溶液在
60℃水浴中摇动，直到没有气泡产生，冷至室温后按
“2.2.1”方法测糖含量的吸光度。结果见表 9。
② 取 300 μL多糖溶液 + 150 μL水 + 450 μL苯
酚 + 2 100 μLH2SO4，沸水浴 15 min，冷至室温，取
100 μL多糖溶液 +3 mL水在 490 nm测多糖含量的吸
光度 A值，结果见表 9。
结果表明，不同浓度的 H2O2 溶液脱色效果都很
好，但是其浓度对多糖的含量有很大的影响。综合各
方面因素，以 7.5%~8% H2O2溶液脱色效果好，多糖
含量最高。结论：珠子参多糖应用 7.5%~8%H2O2溶
液脱色效果为佳。
脱色后的多糖溶液透析 3 d，醇沉使其浓度为
80%，再用 95%乙醇，丙酮依次洗涤沉淀，真空干燥，
即得到珠子参精制多糖。
3 讨论
珠子参粗多糖未经精制，含有多种杂质，其中
具有药理活性的杂质主要为蛋白质，包括多糖结合蛋
白和游离蛋白。因此，除去粗多糖中的活性蛋白是纯
化珠子参多糖的工艺中非常重要的步骤。本文主要针
对脱蛋白法进行优化，综合考虑除蛋白效果及对多糖
成分损失的影响，实验表明用 Sevage法除蛋白必须
多次才能达到效果。但如果先用TCA法除一次蛋白，
然后再用 Sevage法除蛋白 5次，效果较明显，并且
比单独用 Sevage法除蛋白效果好。最后又发现若先
在多糖溶液中加入链酶蛋白酶，再用 TCA法除蛋白，
然后只需用一次 Sevage法便可达到除蛋白的效果，
而且多糖损失较少。该法主要利用链霉蛋白酶切断
糖蛋白中的蛋白链，使结合蛋白游离出来，然后再
用 TCA和 Sevage试剂将游离蛋白除去。这样既保证
蛋白质充分除去，又减少了多糖的损失。最后利用透
析法除去提取物中的小分子杂质，然后再用 7.5%~8%
H2O2溶液脱色，至此得到纯度比较高的珠子参多糖
组分。现有对珠子参多糖的纯化工艺报道较少，本文
的研究为珠子参多糖纯化工艺能够进一步转化为工
业化生产提供了依据。
参考文献
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表8 珠子参多糖脱色结果比较
Tab.8 Comparison of decoloration effect in Rhizoma Panzcis Majoris
crude polysaccharide

测定项目
脱色/A
多糖含量/ A
空 白
0.326
0.782
活性C
0.192
0.428
H2O2
0.080
0.627
树 脂
0.188
0.288
表9 不同浓度H2O2对脱色和多糖含量的影响
Tab.9 Effects of decoloration and polysaccharide with different
concentration of H2O2
H2O2 溶液浓度
7%
7.5%
8%
10%
12%
多糖含量/A
0.428
0.624
0.606
0.269
0.227
A
0.046
0.048
0.047
0.055
0.042