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凉粉草多糖提取及纯化工艺的研究



全 文 : 82 《食品工业》2010 年第 1 期
凉粉草多糖提取及纯化工艺的研究*
冯涛,郁晶晶,杨晓波
上海应用技术学院香料香精技术与工程学院 (上海 200235)
摘 要 研究Na2CO3浓度、料液比、提取时间对多糖提取率的影响,双氧水浓度和加入量对多糖脱色效
果的影响,比较截留分子量为10 K与50 K中空纤维膜管对多糖超滤纯化的效果。结果发现,凉粉草多糖的
最佳提取工艺为:碳酸钠溶液1.5%(M/V),料液比9/250(M/V),提取1.5 h。在此条件下,测得凉粉草多糖
的提取率为41.00%,总糖含量为3.495%;100 mL料液中加入10%的双氧水20 mL时脱色效果可达超滤工艺
要求;截留分子量为10 K的中空纤维膜管在超滤后多糖的保留率高于50 K的。因此可选择截留分子量10 K
的中空纤维膜管对凉粉草多糖进行纯化。
关键词 凉粉草;粗多糖;脱色;超滤;纯化
Studies on Extracting and Purifying Technologies of Mesona Blumes
Polysaccharide
Feng Tao, Yu Jing-jing, Yang Xiao-bo
School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology (Shanghai 200235)
Abstract This paper, fi rstly CNa2CO3, Mesona Blumes: solvent (M/V) and extracting time were investigated on the
extraction rate of MBP, then MBP solution was decolorized by H2O2, fi nally under the pressure of 0.1 MPa, the
decolorized MBP solution had been circularly ultra fi ltered by hollow fi ber membrane tube with Mw cutoff of 10
K and 50 K for 2 h respectively. It was concluded that optimal extracting technologies of MBP were 1.5% Na2CO3,
Mesona Blumes : solvent 9/250 (M/V), and extracting 1.5 h at 95℃ water bath. Under such a condition, extraction
rate of MBP was 41.00% and total sugar content was 3.495%. MBG solution was decolorized by 10%, 20 mL
H2O2 added into per 100 mL MBG solution. After ultrafi ltration, each of their retention part was precipitated by
70% alcohol. Each MBG obtained was analyzed by determining polysaccharide content, Mw distribution and
monosaccharide composition; it was founded that hollow fi ber membrane tube with Mw cutoff of 10 K could be
better than that of 50 K. So the hollow fi ber membrane tube with Mw cutoff of 10 K should be chosen for a further
study.
Keywords Mesona Blumes;polysaccharide;decolorization;ultrafi ltration;purifi cation
凉粉草(Mesona Blume)又名仙人草、仙草、仙人
冻、薪草,为唇形科仙草属一年生草本植物。目前
中国有3种,分别为M. chinensis Benth, M. paruifsota
(Benth) Brea, M. procumbens Hemsl,分布于我国的广
东、福建、广西、江西、海南、浙江、台湾和云南等
地。其他国家如印度、印度尼西亚、马来西亚也有分
布[1]。
凉粉草多糖(Mesona Blume Polysaccharide,MBP)
是凉粉草中含有的一种具有凝胶性的多糖。将凉粉草
用水煎熬数小时,过滤,取它们的胶质,加入适量的
淀粉再煮熟,待冷却之后,则结成黑褐色半透明的
糕状,这就是人们俗称的凉粉,深受广东、广西、
福建、台湾等地区人们的喜爱[2]。有研究表明:MBP
具有显著的抗脂质过氧化作用[3],同VE和BHT相比,
MBP清除超氧阴离子自由基和螯合Fe2+的能力都要好
些,而清除DPPH自由基和还原力都要差些[4]。
试验通过单因素和正交试验确定MBP的最佳提取
工艺,并利用H2O2对MBP溶液的脱色工艺进行初步研
究,在此基础上,选择中空纤维膜组件进行超滤纯
化,以确定截留分子量最适合MBP纯化的中空纤维膜
管。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
凉粉草:福建省武平县下坝乡种植基地,食
用级;无水碳酸钠:山海虹光化工厂,化学纯;
30%H2O2、无水乙醇、苯酚、硫酸、无水葡萄糖、酒
石酸钾钠和3,5-二硝基水杨酸:国药基团化学试剂有
限公司,分析纯。
1.2 仪器及设备
HHS型电热恒温水浴锅:上海医疗器械五厂;
Anke TDL-5型离心分离机:上海安亭科学仪器厂;
722S型可见分光光度计、UV757型紫外可见分光光度
*基金项目:上海市教委科技创新项目(08YZ164)
工艺技术
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计:上海精密科学仪器有限公司;LGS-4型真空冷冻
干燥机:江苏海门轻工机械四厂;10 K、50 K型中空
纤维超滤膜管及简易型超滤装置:华东理工大学膜工
程研究所;Waters 600高效凝胶色谱仪:美国Waters
公司。
1.3 凉粉草多糖提取纯化工艺流程
原料预处理(干燥、粉碎)→加入Na2CO3溶液
→95℃水浴提取MBP→冷却→纱布过滤去除凉粉草渣
→滤液中加入H2O2脱色(50℃)→冷却→超滤→乙醇沉
淀→离心分离→取其沉淀冻干→成品。
1.4 凉粉草多糖提取条件的优化
1.4.1 Na2CO3溶液浓度的选择
分别配制浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、
2.5%的碳酸钠溶液。其他两个因素定为:料液比=
10/250(M/V);在95℃水浴锅中水浴时间为1 h。考察
碳酸钠溶液因素对多糖提取率的影响。
1.4.2 料液比的确定
由1.4.1确定碳酸钠溶液浓度为1.5%,水浴时间仍
暂定为1 h。分别选择5∶250,10∶250,15∶250,
20∶250,25∶250(M/V)考察其对多糖提取率的影
响。
1.4.3 水浴时间的确定
由1.4.1和1.4.2确定碳酸钠溶液浓度为1.5%,料
液比为10/250(M/V)。水浴时间分别取1.0、1.5、2.0、
2.5、3.0 h考察其对多糖提取率的影响。
1.4.4 正交试验
由1.4.1、1.4.2和1.4.3确定的最佳单因素条件,选
择三因素三水平进行正交试验,对正交试验确定的最
佳条件再进行验证。
1.5 凉粉草多糖的脱色处理
1.5.1 双氧水加入量的确定
双氧水浓度先初定为15%,凉粉草多糖溶液置
于50℃左右的水浴锅中慢慢加入分别为0、10、20、
30、40 mL的15%双氧水(30%的双氧水会导致加热反
应过程中产生大量的气泡从而致使凉粉草多糖有效成
分的损失增大),待到反应完全,即料液中再无气体
产生,即可对其进行脱色率和多糖损失率的计算。
1.5.2 双氧水百分比浓度的确定
由1.5.1确定双氧水的加入量为20 mL,然后在
五份相同体积的料液中加入0%、5%、10%、15%、
20%的双氧水进行脱色处理,其他操作步骤与注意事
项同“1.5.1”。
1.6 凉粉草多糖的超滤纯化
将经过脱色处理的多糖溶液(共约1 600 mL)分成
两分,分别在截留分子量为10 K和50 K的中空纤维膜
管下进行超滤操作。仪器通电稳定5 min后在压强为
0.1 MPa的条件下超滤2 h左右,取截流液部分进行多
糖含量、多糖分子量分布以及单糖组成的测定。
1.7 测定方法
1.7.1 多糖提取率的计算
多糖提取率(%)=[(m1-m2)/m3]×100 (1)
式中:m1—经过恒温干燥恒重的小烧杯和粗多糖
的总质量,g;m2—经过恒温干燥恒重的小烧杯的质
量,g;m3—称取凉粉草原料的质量,g。
1.7.2 多糖含量的测定
多糖含量=总糖含量-还原糖含量[5]。
总糖含量:苯酚-硫酸法[6];还原糖含量:3,5-二
硝基水杨酸法[7]。
1.7.3 ICUMSA色值测定及脱色率计算方法
干燥所得到的固体MBP复水使其浓度为0.01 g/
mL,再在420 nm对0.01 g/mL的MBP溶液进行吸光值A
的测定,所选比色皿长度为光程长,则该MBP溶液的
ICUMSA色值可由如下公式计算:
IU=[A420/比色皿长度×糖液浓度(g/mL)]×1000 (2)[8]
脱色率计算公式如下:
脱色率(%)=(1-IU/IU0)×100 (3)
式中:IU——经过脱色处理的多糖溶液的色值;
IU0——未经过脱色处理的多糖溶液的色值。
1.7.4 脱色后多糖损失率的计算
损失率(%)=[(m0-m1)/m0]×100 (4)
式中:m0——未经脱色处理的多糖量;m1——经
脱色处理的多糖量。
1.7.5 MBP溶液分子量分布测定
采用Waters 600高效凝胶过滤色谱(HPGPC)测
定MBP的相对分子量。具体操作条件为:色谱柱
Ultrahydrogel™ Linear 300 mm×7.8 mmid×2;流动
相:0.1 mol/L sodium nitrate;流速:0.9 mL/min;柱
温:45℃;检测器:2410差式折光检测器。分别选
用Dextran T-2000 (Mw2 000 000),Dextran T-190 (Mw
188 000),Dextran T-10 (Mw10 000),Dextran T-3 (Mw
2 800),Dextran T-0.3 (Mw280) (Pharmacosmos Co. Ltd.,
Denmark)作为标准分子量[9]。
1.7.6 MBP溶液单糖组成的测定
分别称取经截留分子量10 K与50 K的中空纤维素
膜超滤的MBP 23 mg和24.6 mg,加4 mL 2mol/L的三氟
乙酸于121℃,0.1 MPa下水解1 h,将水解液旋转蒸发
至干后,加入10 mL色谱纯的甲醇溶解,最后将此甲
醇溶液置于真空度为0.1 MPa,40℃的真空干燥箱内
蒸干。
取此干样再加5 mL色谱级甲醇溶解,取100 μL
加100 μL还原胺化试剂(0.7 g对氨基苯甲酸+0.1 g
NaCNCH3+1 mL HAc),在70℃反应30 min,冷却稀释
至1 mL。最后加甲醇定容到10 mL。
色谱条件:柱温30℃,流速0.8 mL/min,色谱柱
为Atlantis C18,柱长4.6×250mm,检测波长203 nm,
进样量5 μL。
工艺技术
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洗脱条件:流动相缓冲液为0.05 mol/L,流动相
采用50 mmol/L四丁基硫酸氢胺溶液(A)和50%的四
丁基硫酸氢胺甲醇溶液(B)在不同时间按不同体积混
合后梯度洗脱,梯度条件为:0 min,A/B=95/5;40
min,A/B=90/10;45 min,A/B=80/20;49 min,A/
B=50/50;60 min,A/B=95/5。
选取的标准单糖及其质量浓度分别为:
D-Man(4.077 mg/mL),D-Gal(4.052 mg/mL),
D-Glc (4 .096 mg/mL),D-Xyl (4 .041 mg/mL),
D-Rha(3.991 mg/mL),D-Rib(3.723 mg/mL),Ara(1.004
mg/mL) Fuc(1.005 mg/mL),GlcA(1.975 mg/mL),
GalA(3.935 mg/mL)[10]。
2 结果与分析
2.1 MBP最佳提取条件的确定
在料液比为10/250(M/V),95℃水浴时间为1 h的
条件下,Na2CO3溶液浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.0
和2.5%(M/V)时,测定出MBP的提取率分别为16.30,
24.10,31.30,30.10和28.00%,由此可得Na2CO3最佳
提取浓度为1.5%。
在Na2CO3溶液浓度为1.5%,95℃水浴时间为
1 h的条件下,料液比分别为5∶250,10∶250,
15∶250,20∶250,25∶250(M/V)时,测定出MBP的
提取率分别为43.00,52.90,38.73,35.30和12.12%,
由此可得最佳料液比为10/250(M/V)。
在Na2CO3溶液浓度为1.5%,料液比为10/250(M/V)
的条件下,95℃水浴时间分别取1.0、1.5、2.0、2.5、
3.0 h时,测定出MBP的提取率分别为35.60,42.30,
40.80,28.80和27.30%,由此可得最佳水浴时间为1.5
h。
由上所选定的单因素提取条件,进行L9(33)正交
试验,所得正交试验结果如表1和表2所示。
表1 凉粉草多糖提取因素正交试验
编号 A碳酸钠溶液浓度/%
B料液比 /
m·v-1
C水浴时间/
min D
提取率
/%(m/m)
1 1(1.4) 1(9/250) 1(80) 1 34.11
2 1 2(10/250) 2(90) 2 38.90
3 1 3(11/250) 3(100) 3 23.73
4 2(1.5) 1 2 3 40.78
5 2 2 3 1 39.80
6 2 3 1 2 28.00
7 3(1.6) 1 3 2 33.44
8 3 2 1 3 32.80
9 3 3 2 1 26.36
K1j 96.74 108.33 94.91 100.27K2j 108.58 111.50 106.04 100.34K3j 92.60 78.09 96.97 97.31Rj 15.98 33.41 11.13 3.03
表2 凉粉草多糖提取因素正交试验方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
Na2CO3 /% 45.854 2 22.996 19.000 *
料液比 /m·v-1 226.748 2 113.715 19.000 *
水浴时间 /min 23.376 2 11.723 19.000
误差 1.99 2
由表1可得RB>RA>RC>RD的结论,这说明料液比
对于凉粉草多糖提取率的影响最大,Na2CO3%次之,
水浴时间的影响为最小。由表2可得,Na2CO3%和料
液比对多糖提取率的影响具有显著性,而水浴时间没
有显著性影响。
同时由各因素中K的最大值可以得出最佳因素
组合为A2B2C2,在此条件下测定出MBP的提取率为
39.80%(m/m),低于表1中的最佳因素组合A2B1C2条件
下的提取率40.78%(M/M),所以最终确定MBP的最佳
提取条件为1.5%碳酸钠溶液,9/250(M/V)的料液比,
95℃水浴1.5 h。
2.2 MBP脱色条件的确定
2.2.1 H2O2加入量的确定
按“1.5.1”的方法可得脱色结果如表3所示。
表3 H2O2加入量和H2O2百分比浓度的确定
H2O2加入量/mL 0 10 20 30 40IU 211 300 206 100 201 000 173 500 157 600
脱色率 /% 0 2.46 4.88 17.89 25.41
多糖损失率 /% 0 4.88 11.46 16.83 22.68
H2O2百分比 /% 0 5 10 15 20IU 197 600 191 500 186 000 179 400 174 000
脱色率 /% 0 3.09 5.87 9.21 11.94
多糖损失率 /% 0 18.64 26.16 39.70 39.87
从表3看出,随着H2O2加入量增大色值越来越
小,其脱色率越来越大,加入量为30 mL时脱色率升
至17.89%。虽然脱色效果明显,但是引起的多糖损失
率高达16.83%(M/M),因此30 mL的加入量不适合本工
艺要求。最终确定H2O2加入量为20 mL,此时多糖溶
液呈浅黄褐色,其色值为201 000,脱色率为4.88%,
多糖损失率为11.46%(M/M)。
2.2.2 H2O2百分比浓度的确定
按“1.5.2”的方法可得脱色结果如表3所示。
如表3所示,随H2O2百分比浓度的增大其脱色效
果越来越显著。多糖损失率的增大则说明H2O2浓度
越高多糖损失越大。综合考虑当双氧水百分比浓度
为10%时比较适合工艺要求,此时的多糖损失率为
26.16%(m/m)、IU 值为186 000、脱色率为5.87%。因
此,100 mL的料液中加入10%的双氧水20 mL时脱色
效果达到工艺要求。
2.3 MBP的超滤纯化
按1.6的方法,可得截留液组分1(10 K膜管)和截
留液组分2(50 K膜管)。
2.4 MBP超滤后截留液组分的分析结果
2.4.1 超滤后两种截留液组分中多糖含量的计算
表4 不同分子量膜管组件超滤后凉粉草多糖溶液的
多糖含量
含量 /%(M/M) 超滤前的MBP溶液 截留液组分1 截留液组分2
总糖 3.495 2.883 2.593
还原糖 0.015 0.090 0.045
多糖 3.480 2.793 2.548
从表4来看,超滤前溶液的多糖含量大于超滤后
截留液中的多糖含量,这说明超滤纯化使溶液损失部
分多糖。截留液组分1的多糖含量大于组分2的,这说
明MBP溶液在经过超滤纯化后,截留液组分1中多糖
工艺技术
85 《食品工业》2010 年第 1 期
保留率比组分2中大,即10 K中空纤维膜管的超滤纯
化效果要更适合工艺要求。
2.4.2 截留液组分中MBP分子量分布的测定
操作条件参照”1.7.5”中MBP溶液分子量分布测
定,Dextran T系列作为标准分子量。得标准曲线方程
为:Log Mol Wt=13.3-0.504t,R2=0.997 7,其中:Mol
Wt为Dextran T标准品的分子量,t为保留时间。截留
液组分1和2的分子量分布相应数据如表5所示。
表5 截留液组分1和组分2的色谱分析数据
峰名 数均分子量Mn
重均分子量
Mw 尖峰分子量Mp 含量%
组分1 组分2 组分1 组分2 组分1 组分2 组分1 组分2
峰3 48679 42129 77040 57571 46372 37797 6.64 3.06
峰2 1216 1085 3372 2836 1015 1059 31.25 28.91
峰1 85 88 114 112 95 82 35.44 34.82
峰4 15 17 20 23 26 28 26.67 33.21
从表5可以分析,截留液组分1中多糖(Mw=77040)
的保留率为6.64%(M/M),截留液组分2中多糖(Mw=
57 571)的保留率为3.06%(M/M),说明10 K膜管在对
MBP溶液进行超滤后保留多糖组分高。在分离纯化中
就试验中所提供的两种膜管型号来讲应选择此种型号
膜组件进行纯化比较合适。至于截留液中仍有大量低
于10 K或50 K的分子量的组分存在,其原因可能与超
滤过程不充分有关。在后续研究中,应对超滤过程进
行进一步地优化研究或者增加超滤循环的工作时间或
次数使溶液超滤充分至稳定。
2.4.3 截留液组分中MBP单糖组成的测定
按”1.7.6”中单糖组成的测定方法,分别得标准
单糖、截留液组分1和2的相应数据如表6所示。
表6 截留液组分1和组分2中的单糖组成(摩尔百分
比%)
样品 组分1 组分2
甘露糖 Man 2.158 2.243
核糖 Rib 0.6135 0.6889
鼠李糖 Rham 5.657 5.550
葡萄糖醛酸 GluA 1.187 1.595
半乳糖醛酸 GalA 15.17 15.07
葡萄糖 Glu 45.38 41.79
半乳糖 Gal 16.95 19.74
木糖 Xyl 5.235 5.071
阿拉伯糖 Ara 7.641 8.254
在凉粉草多糖分子中,半乳糖醛酸(GalA)是其特
有组成单糖,因此GalA的含量是代表MBP含量的一个
重要指标。综合分析表7后发现,截留液组分1中GalA
的摩尔百分含量为15.17%,截留液组分2中GalA的摩
尔百分含量仅为15.07%,由此可见10 K膜管超滤处理
的多糖溶液中保留的MBP含量多,应选择该型号膜组
件对凉粉草多糖溶液进行超滤。
综合3.4.1,3.4.2和3.4.3可知,选择截留分子量为
10K的中空纤维膜管对脱色处理的MBP溶液进行超滤
比较合适,下一步应专门对其超滤试验进行优化。
3 结论
经过单因素及正交试验得到MBP的最佳提取条件
为:1.5%碳酸钠溶液提取液,9/250 (M/V)的料液比,
95℃水浴1.5 h,在此条件下,测得凉粉草多糖的提
取率为41.00%(M/M),总糖含量为3.495%(M/M);在
50℃向100 mL的料液缓慢加入10%的双氧水20 mL可
达较好脱色效果且多糖损失较小,此时多糖损失率为
26.16%(M/M)、脱色率为5.87%;截留分子量为10 K中
空纤维膜管超滤所得截留液中多糖含量为2.793%(M/
M),高于50 K的2.548%(M/M),多糖(Mw=77040)的保
留率为6.64%(M/M),多于50 K的3.06%(M/M),GalA的
摩尔百分含量为15.17%,大于50 K的15.07%,因此,
选用截留分子量为10 K的中空纤维膜管适合MBP多糖
溶液的超滤纯化。
参考文献
[1] 冯涛,顾正彪,金征宇.凉粉草胶的研究进展[J].中国食品
添加剂,2005,16(6):21-24,28.
[2] 黄健豪,赵为康.利乐无菌纸盒包装凉粉的研制[J].广州
食品工业科技,1998,14(3):42-44.
[3] 杨敏,冯磊,柯雪琴.仙草多糖对大鼠肝匀浆脂质过氧化
的试验研究[J].浙江预防医学,2002, 14(12):4-5.
[4] Lai, Lih-Shiuh, Chou,Su-Tze, Chao,Wen-Wan.
Studies on the antioxidative activities of Hsian-tsao (Mesona
procumbens Hemsl) leaf gum[J]. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2001, 49(2):963-968.
[5] 杜邵龙,周春山,雷细良.超滤膜法浓缩薏苡仁多糖提取
液[J].膜科学与技术,2007,27(5):78-81.
[6] 张双风,林香娟,于村.苯酚-硫酸法测定胖大海凉茶
中多糖的研究[J].河南预防医学杂志,2000,11(3):144-
145.
[7] 宋占午,王莱,刘艳玲.3,5-二硝基水杨酸测定还原
糖含量的条件探讨[J ] .西北师范大学学报(自然科学
版),1997,33(2):52-55.
[8] 冯涛,顾正彪,金征宇.凉粉草胶脱色树脂的筛选[J].食品
工业科技, 2006, 27(11): 85-87,91.
[9] T.,Feng, Z.B.,Gu, Z.Y.,Jin. The chemical composition
and some rheological properties of Mesona Blumes gum[J].
Food Science and Technology International, 2007, 13(1):55-
59.
[10] Feng,Tao, Gu,Zheng Biao, Jin, Zheng Yu, et al.
Isolation and characterization of an acidic polysaccharide
from Mesona Blumes gum[J]. Carbohydrate Polymers, 2008,
71(2): 159-169.
工艺技术