全 文 ：假臭草(Praxelis clematidea R. M. King & H.
Robinson)是菊科(Composite)假臭草属(Praxelis)植
物[1]， 原产南美洲， 传入中国后曾一直被误认为藿
香蓟(Ageratum conyzoides linn.)或熊耳草(Ageratum
houstonianum Miller)[2-3]。 假臭草适应性强， 对土壤
养分有较强的吸收力， 种子具冠毛， 易于传播和对
其它植物受体有化感作用， 对中国华南入侵生境破
坏严重[4-5]。 假臭草EST-SSRs分子标记的开发， 为
其遗传多样性研究及其近缘种的鉴定提供了基础。
EST(Expressed sequence tags)是通过对由 mRNA
逆转录成的 cDNA克隆测序得到的一部分序列， 代
表着一定条件下基因组的部分转录信息[6]， 是一段
完整的或部分的基因表达序列， 相比 SSR而言，
EST-SSRs在近缘种间具有更高的通用性和保守性[7]。
假臭草 EST-SSRs 标记的开发①
黄 敏② 陈振玺 刘建福 王奇志③
(华侨大学化工学院 福建厦门 361021)
摘 要 从 NCBI的dbEST数据库中下载假臭草同族植物的 EST序列， 经 EST序列处理及 SSR位点查询， 首次设
计了 27对假臭草 EST-SSRs引物 ， 以海南省文昌市假臭草 DNA为模板 ， 采用单因素和 L16(45)正交试验对其
EST-SSRsPC反应体系进行优化。 建立了假臭草EST-SSRs最佳20μLPCR反应体系： Mg2+浓度为2.75mmol/L， 模
板 DNA用量为 35ng， TagDNA聚合酶为 2.25U， dNTPs浓度为 0.3mmol/L， 引物浓度为 0.6μmmol/L。 并用 14
个不同来源的假臭草样本对其体系进行验证实验 ， 结果均能获得稳定的 、 清晰明亮的扩增谱带 。 假臭草
EST-SSRs标记的开发为深入研究其遗传多样性提供了基础。
关键词 假臭草 ； EST-SSRs； 引物设计 ； 优化
分类号 Q754； S451
Development of Praxelis clematidea EST-SSRs
HUANG Min CHEN Zhenxi LIU Jianfu WANG Qizhi
(College of Chemical Engineering, Huaqiao University， Xiamen， Fujian 361021)
Abstract In this study, we download ESTs form dbEST database and first designed 27 primer pairs for
Praxelis clematidea after EST pretreatment and SSR locus identification. The sample were collected from
Wenchang City in Hainan province as DNA template, and the optimization and establishment of
EST-derived SSR-PCR reaction system for Praxelis clematidea was carried out by single factor test and
orthogonal experiment design of L16(45). The result was indicated that the optimal EST-SSRs PCR reaction
system (20 μL) was contained 2.75 mmol/L Mg2+, 35 ng DNA template, 2.25 U Tag DNA polymerase, 0.3
mmol/L dNTPs and 0.6 μmol/L primer. This system was tested by 14 Praxelis clematidea from different
places, which stable and clear polymorphic bands were acquired. Accordingly, the development of
EST-SSRs can be used for the genetic diversity research of Praxelis clematidea.
Keywords Praxelis clematidea ; EST-SSRs ; primer design ; optimization
① 基金项目 ： 国家标本平台教学标本子平台(No.2005DKA21403-JK)； 华侨大学 2012年实验教学改革与建设课题(No.
66661220Y)； 福建省自然科学基金项目(No.2010J05076)。
收稿日期： 2014-02-17； 责任编辑/凌青根； 编辑部 E-mail:rdnk@163.com。
② 黄 敏(1989～)， 男， 在读硕士研究生， 研究方向为入侵植物假臭草资源的开发与利用； E-mail:handmjueye@163.com。
③ 通讯作者： 王奇志(1976～)， 女， 博士， 讲师， 研究方向为植物系统发育和植物资源开发研究；
E-mail:wqz@hqu.edu.cn。
Vol．34, No．3
2014年3月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第34卷第3期
Mar． 2014
27- -
2014年3月 第34卷第3期热带农业科学
1.2方法
1.2.1假臭草基因组 DNA的提取与检测
采用改良的 CTAB法提取假臭草基因组 DNA[9]。
1%琼脂糖凝胶电泳检测， ND-2000超微量紫外分光
光度计测出基因组 DNA母液浓度(ng/μL)和纯度
(A260/A280)， 并将母液 用灭菌 ddH2O稀 释 为 10
ng/μL的工作液， -20℃保存备用。
1.2.2EST-SSRs标记引物的设计和筛选
目前为止 ， NCBI(National Center for Biotech-
nology Information)的dbEST数据库中没有公布假臭
草EST序列， 根据EST-SSRs标记的可通用性特征，
分别下载了假臭草同族植物胜红蓟(A. conyzoides)、
薇甘菊(Mikania micrantha)和甜叶菊(Stevia rebau-
diana)的 EST序列设计引物(截止 2013年 6月)。 对下
载的 EST序列进行预处理： 保留长度 100～700bp
(5′～3′)的 EST序列， 用 DNAStar软件去除序列中
的载体、 重复和PolyA/T序列[10-11]， 获得最低冗余
度的 EST序列 。 SSRIT(Simple Sequence Repeat I-
dentification Tool)软件查找EST中的SSR位点(http:
//www.gramene.org /gramene/search es/ssrtool)， SSR位点
筛选的标准为： 含二﹑三﹑四﹑五﹑六核苷酸基元
的最小重复数依次为 8﹑6﹑5﹑4和 3次 。 用
Primer Premer5.0软件设计EST-SSRs引物， 引物
设计的主要参数为： (1)退火温度为50～60℃； (2)
引物长度为 18～24bp， 20bp最佳； (3)PCR产物长
在100～500bp； (4)GC%含量为40%～60%[12]。 首次设计
了27对EST-SSRs引物(表2)， 送往上海生工生物工
程有限公司合成。 以扩增谱带清晰明亮、 具有多态性
为标准， 对 27对引物进行筛选， 筛选的反应体系
为： 20μLPCR反应体系中， Mg2+浓度为2.5mmol/L，
模板 DNA用量为 20ng， TagDNA聚合酶为 1.5U，
dNTPs浓度为0.25mmol/L， 引物浓度为0.6μmol/L，
EST-SSRs分子标记是基于PCR的标记手段， PCR结
果受到Tag聚合酶﹑Mg2+浓度、DNA模板浓度、 dNTPs
浓度及引物浓度的相互影响， 因此， ESR-SSRs标记
的开发必须建立稳定可靠的PCR反应体系。 假臭草
EST-SSRs标记的开发未见报道， 本研究的主要目
的为： (1)利用 EST-SSRs的可通用性特征[7-8]， 以
假臭草近缘种的EST序列设计EST-SSRs引物； (2)
采用单因素试验设计对 PCR反应体系中五因素(Tag
DNA聚合酶、Mg2+浓度、DNA模板、 dNTPs及引物浓度)设置不
同的水平梯度， 筛选出最适浓度范围； (3)基于单
因素结果 ， 设计 L16(45)正交试验 ， 建立假臭草
EST-SSRs标记的最佳PCR反应体系。
1 材料和方法
1.1材料
假臭草样品来源于海南省和广东省不同市县，
见表 1。 采摘新鲜叶片， 硅胶封装， 转至 -20℃冰
箱保存、 备用。
表1 假臭草采集信息
采集地 样品编号 采集地 样品编号 经纬度
海南海口
HHK1 海南万宁 HWN3
E110°32′02.0″
N19°04′04.5″
HHK2 海南文昌 HWC
E110°47′48.1″
N19°35′36.4″
HHK3 广东湛江 GZJ
E110°17′55.9″
N21°08′48.4″
海南儋州
HDZ1
广东珠海
GZH1
E113°32′ 5.5″
N22° 2′10.2″
HDZ2 GZH2
E113°32′ 2.9″
N22° 2′10.2″
海南万宁
HWN1 GZH3
E113°22′08.4″
N22° 2′10.2″
HWN2 广东河源 GHY
E114°37.193″
N23°42.756″
经纬度
E110°19′34.0″
N19°59′04.0″
E110°19′33.9″
N19°59′03.5″
E110°19′33.7″
N19°59′03.4″
E109°29′45.4″
N19°30′22.4″
E109°29′58.9″
N19°30′42.2″
E110°32′09.5″
N19°03′58.1″
E110°32′02.4″
N19°04′04.8″
28- -
黄 敏 等 假臭草EST-SSRs标记的开发
1.2.3EST-SSRs标记 PCR反应的单因素试验
分别对模板 Mg2+、 dNTPs、 引物、 Tag 酶及 DNA
模板进行梯度试验， 筛选最佳适宜浓度范围。 Mg2+
浓度试验中设 0.75、 1.00、 1.25、 1.50、 1.75、
2.00、 2.25、 2.50、 2.75、 3.00 mmol/L10个梯度；
dNTPs浓度试验中设 0.05、 0.10、 .15、 0.20、
0.25、0.30、0.35、0.40mmol/L8个梯度； 引物浓度
设 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8μmol/L
8个梯度； Tag酶浓度设0.50、 0.75、 1.00、 1.25、
1.50、 1.75、 2.00、 2.25、 2.50、 2.75、 3.00U/20μL
11个梯度； DNA模板量设10、 15、 20、 25、 30、 35、
40、 45、 50、 60、 80、 100ng/20μL12个梯度。 PCR
反应程序同1.2.2。
1.2.4EST-SSRs 标记 PCR 反应因素水平的正交
试验设计
基于 1.2.3筛选出的 EST-SSRs标记 PCR反应
体系中模板 DNA、 Tag酶、 Mg2+、 引物及 dNTPs浓度
五因素的适宜浓度范围， 运用正交辅助软件构建
L16(45)正交试验表 ， 设计模板 DNA、 Mg2+、 引物 、
dNTPs及Tag酶五因素和不同浓度的 4水平正交试
验(表3)。 根据表3， 制备总体积为20μL的PCR反
应体系， 除了表中的五因素外， 加入2.0μL10×
PCR buffer， 不足 20μL用灭菌 ddH2O补足， PCR
反应程序同1.2.2。
1.2.58%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
对单因素试验和正交试验设计的PCR扩增产物
PCR扩增反应程序： 94℃。 预变性 5min， 然后按
94℃变性50s， 53℃退火40S， 72℃延伸70S， 40
次循环； 72℃延伸 5min[13]。 根据实验结果， 筛选
得出最优的引物作为PCR反应体系的引物。
表2 27对EST-SSRs引物信息
引物编号 基元类型和重复次数 正向引物 反向引物 预产物长度/bp
srSSR701 AC， 9 TCGTCCCTCCATCAATCACTT CTCTTTCAGGCTTCC138
srSSR702 AC， 9 GTTCGTCCCTCCATCAATCACCTTCGG CTTTCTCCTTTC140
srSSR703 AC， 9 TTCGTCCCTCCATCAATCTCC TTTCAGGCTTCC137
srSSR704 AT， 13 CGTGATCCAACAAGCACCCATGCCGCCGAAACAAGAAC162
srSSR705 TA， 8 GGCACAAGGGTCCAGAATA CGGATGCACTATCAGGTT205
srSSR706 AAT， 6 GGCGTCGTCTTTGGGTAACAG ACAATGAGGGAGGT195
srSSR707 ACC， 10 ACAGCANGTAGCGGTATCCTTTTTCGGGTTGCANAGTTG147
srSSR708 CAT， 6 ATCACTTACTGCGGGTCTTGAC C C TCTTTCTTCATTT146
srSSR709 CAT， 6 ATCACTTACTGCGGGTCTTGAAACGCCCTTCTTTCTTCAT148
srSSR710 GAA， 6 TGATGATCAAGAGGCCAGTT T CT TCAAGCAACGA181
srSSR711 TAA， 6 GAACCCGACCCGAGTATAT AGG TGAAGACGATGC120
srSSR712 TGG， 6 GGAGCAACCAGAAACACCGTC TACCCGACCCGACAT104
srSSR713ACACCC， 3 CACAGCCCTCTTCTCCTTTACGGCGAATTTCTCCTCTA187
srSSR714ACACCC， 3 CAGCCCTCTTCTCCTTTCGACGG GTTTATCTGTTT166
srSSR715AGATAC， 3 AACAACCTCATCTGCCTTGAAA GATTTCGTCTCCACA169
srSSR716AGATAC， 3 GAAAGCACCTTCGGTCAGCA TTCGTCTCCACAACTCCTC135
srSSR717 AGATAC， 3 AAAGCACCTTCGGTCAGCATTT GTCTCCACAACTCCTC134
srSSR718 CAGTAA， 3 CGATGCTGCTGATTTTCT CTTCCATTTCTTGGCTCA197
srSSR719AGATGA， 3 CCCTCTAACAGTCCGACAA GCTAACGCATCAGCCACT216
srSSR720CCCGAA， 4 TCTGGGAGTCGTAATCTGG ATAGGTTTCTTCGGTGGTT169
srSSR721CCGGCA， 3 CTCTGCCTTCTTATACTTCTCC ACTGCTGATTGCGTTGATT173
srSSR722GAAATG， 4 TGGCAGCAGAACTAGGGTT AGCACGAGAATCGGGAGA171
srSSR723GAAATG， 4 TGGCAGCAGAACTAGGGTT GAGCAGCAAGCACGAGAAT179
srSSR724GAAATG， 4 AACCAGTGGCAGCAGAAC AGCAGCAAGCACGAGAAT184
srSSR725 ATCT， 13 AGCAAAGCAAGCGGGTAT ATAAAGTTCACCACCACAGGAT161
srSSR726 AACAAT， 4 CAATCTCCCGTTCCTCAC CGTCATCAATAACCGTCAA100
srSSR727CCCATA， 3 GGCTGAACCTGGAGGAACTTCCCTGGTGTCCAACAATAC92
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2014年3月 第34卷第3期热带农业科学
2.2引物筛选
依据扩增条带的敏感性、 特异性和数量， 筛选
出srSSR716作为PCR反应体系的最佳引物。
2.3EST-SSRs 标记 PCR 反应体系的单因素试验
分析
2.3.1Mg2+浓度对 EST-SSRs标记的 PCR扩增影响
Mg2+不同水平梯度试验结果显示(图 2-A)， 当
Mg2+浓度为 0.75～2.25mmol/L时， 有 2条扩增谱
带， 条带清晰但却有一定的弥散和拖尾现象； 当
Mg2+浓度为 2.25～3.00mmol/L时， 有 3条扩增普
带， 条带清晰明亮， 弥散和拖尾现象不明显， 因
此， 假臭草 EST-SSRsPCR反应 体系中 Mg2+浓度的
适宜浓度范围为2.25～3.00mmol/L。
2.3.2dNTPs 浓度对 EST-SSRs 标记的 PCR 扩增
影响
dNTPs参与新链DNA的合成， 直接影响PCR的
图1 改良CTAB法提取假臭草DNA
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
200bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
说明： 1～14依次为假臭草样HHK1、HHK2、HHK3、HDZ1、HDZ2、 HWN1、HWN2、HWN3、GZJ、HWC、 GZH1、GZH2、GZH3、GHY。 M： DL2000marker
表3 EST-SSRs PCR反应体系正交试验设计表
处理
组合
因素
模板DNA
/(ng·20μL-1)A
Mg2+
/(mmol·L-1)B
引物
/(μmol·L-1)C
dNTPs
/(mmol·L-1)D
Tag酶
/(U·20μL-1)E
1 20.00 2.25 0.50 0.15 2.25
2 20.00 2.50 0.60 0.20 2.50
3 20.00 2.75 0.70 0.25 2.75
4 20.00 3.00 0.80 0.30 3.00
5 25.00 2.25 0.60 0.25 3.00
6 25.00 2.50 0.50 0.30 2.75
7 25.00 2.75 0.80 0.15 2.50
8 25.00 3.00 0.70 0.20 2.25
9 30.00 2.25 0.70 0.30 2.50
10 30.00 2.50 0.80 0.25 2.25
11 30.00 2.75 0.50 0.20 3.00
12 30.00 3.00 0.60 0.15 2.75
13 35.00 2.25 0.80 0.20 2.75
14 35.00 2.50 0.70 0.15 3.00
15 35.00 2.75 0.60 0.30 2.25
16 35.00 3.00 0.50 0.25 2.50
进行 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ， DL2000为
Marker， 220V电压下电泳2h。 电泳完后， 用蒸馏
水清洗凝胶 2次， 放入 500mL的 0.1%硝酸银染色
液中浸泡10min， 取出凝胶并再次用蒸馏水清洗 2
次， 放入 500mL的显影液中显影。 银染结果用数
码相机拍照保存。
1.2.6数据处理
根据扩增条带的敏感性与特
异性即条带强弱及杂带的多少作
1～16分记分， 分数越高， 表示
敏感性、 特异性越好[14]。 3次重
复独立打分， 根据得分计算各因
素同一水平的试验值之和(Ki)和该
水平下的数据平均值(ki)， 并计算
同一因素不同水平间的极差 R。
每一因素水平下的数据平均值 ki
反映了因素各水平间对PCR反应
体系的影响情况， PCR反应体系
优化时， 应选取 ki最大值对应的
最适浓度水平。
2 结果与分析
2.1CTAB 法提取假臭草基因
组 DNA
从琼脂糖凝胶电泳图(图 1)可以看出， 提取的
假臭草基因组DNA的电泳条带单一， 清晰明亮， 点
样孔无滞留， ND-2000超微量紫外分光光度计检测
结果显示DNA的 A260/A230比值为1.8～1.9， A260/A230
比值为2.2～2.4， 满足EST-SSRs标记需求。
30- -
黄 敏 等 假臭草EST-SSRs标记的开发
产量。 由图2-B所示， 当dNTPs浓度为0.05mmol/L
时， PCR产物产量少， 扩增谱带不清晰， DNA条带
较弱； 当dNTPs浓度为0.05～0.20mmol/L时， 扩增
谱带的清晰度与浓度的大小呈正相关性； 当dNTPs
浓度为0.25～0.40mmol/L时， 扩增谱带清晰完整，
但随着dNTPs浓度的增大， DNA条带并没有显著的
变化。 因此， 假臭草EST-SSRsPC
反应体系中dNTPs浓度的适宜浓度
范围为0.25～0.40mmol/L。
2.3.3引物浓度对 EST-SSRs标记
的 PCR扩增影响
由图2-C可以看出， PCR的产量
与引物浓度呈正相关性， 当引物浓度
为0.1～0.2μmol/L时， 扩增谱带较
弱， 不清晰； 当引物浓度为0.3～0.4
μmol/L时， 随着浓度的增加， 扩增
谱带变得清晰明亮； 当引物浓度为
0.5～0.7μmol/L时， 扩增谱带清晰
明亮， 但并没有随着浓度的增加而
呈现出明显的变化； 当引物浓度为
0.8μmol/L时， 扩增谱带开始出现
弥散现象。 因此， 假臭草EST-SSRs
PCR反应体系中引物浓度的适宜浓
度范围为0.4～0.8μmol/L。
2.3.4Tag DNA 聚合酶用量对
EST-SSRs 标记的 PCR扩增影响
Tag酶的用量影响 PCR扩增的效率。 由图 2-D
可见， Tag酶用量过低时， PCR扩增效率低下， 当
Tag酶用量为 0.50～2.00U时， 有扩增谱带出现，
但同一Tag酶用量下， DNA条带间清晰不一； 当Tag
酶用量为2.25～3.00U时， 扩增谱带清晰度随Tag
酶用量的增加而增大。 因此， 假臭草EST-SSRsPC
反应体系中TagDNA聚合酶用量的适宜浓度范围为
2.25～3.00U。
2.3.5模板 DNA 量对 EST-SSRs 标记的 PCR 扩
增影响
模板DNA的质量和用量影响PCR结果的敏感性
和扩增效率。 由图 2-E所示， 当模板 DNA用量为
10、 15、 20ng/20μL时， 扩增谱带有缺失的现象，
相比其他用量而言， DNA条带较弱； 当模板DNA用
量为40、 45、 50、 60、 80、 100ng/20μL时， 随着模
板DNA用量的增加， PCR结果的敏感性降低， 出现
非特异性DNA条带， 且存在弥散现象； 当模板DNA
用量为 25、 30、 35ng/20μL时， 扩增谱带清晰明
亮。 因此， 假臭草 EST-SSRsPCR反应体系中模板
DNA量的适宜浓度范围为25～35ng/20μL。
2.4EST-SSRs 标记 PCR 反应体系的正交试验设
计分析
实验数据结果显示， EST-SSRs标记 PCR反应
体系中 5个因素的最佳反应水平为 A4B3C3D1E2(表
4)， 并不在正交组合表中出现， 但与组合9和组合
15接近。
2.5PCR最佳反应体系的稳定性验证
根据正交设计数据分析及PCR扩增产物电泳结
果(图 3)， 结合经济原则， 选择组合 15为最优反
应体系， 对海南和广东地区的 14个假臭草样本进
行 PCR扩增的结果(图 4)显示， 扩增谱带清晰明
亮， 稳定性好， 具有多态性。
3 讨论与结论
图2 假臭草EST-SSRs标记PCR反应体系单因素优化
说明： A： Mg2+浓度对假臭草EST-SSRs标记的PCR扩增影响， 1～10为从低到高
的不同浓度水平(下同)； B： dNTPS浓度对假臭草 EST-SSRs标记的 PCR扩增影响；
C： 引物浓度对假臭草 EST-SSRs标记的PCR扩增影响； D： TagDNA聚合酶用量对假
臭草EST-SSRs标记的PCR扩增影响。 E： 模板 DNA量对假臭草 EST-SSRs标记的 PCR
扩增影响。 M为markerDL2000(从上到下为250、 10bp)。
M 123 4 5 6 7 8 9 10M 1 2 3 4 5 6 7 8
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
250bp
100bp
250bp
100bp
250bp
100bp
250bp
100bp
250bp
100bp
2-A 2-B
2-C
2-E
2-D
31- -
2014年3月 第34卷第3期热带农业科学
说明:Ki为每个因素同一水平下试验值之和； ki为每一因素
水平下的数据平均值； R为同一因素不同水平间平均值的极差。
结果 模板DNA Mg2+ 引物 dNTPs Tag酶
K1 23 27.7 27.7 38.7 39
K2 24 28.3 34.7 32.3 41.7
K3 42.3 42.3 47.0 27.7 29.3
K4 46.7 37.7 26.7 37.3 26
k1 5.750 6.925 6.925 9.675 9.750
k2 6.000 7.083 8.675 8.075 10.425
k3 10.575 10.575 11.750 6.925 7.325
k4 11.667 9.417 6.675 9.325 6.500
R 5.917 3.650 5.075 2.750 3.925
表4 正交设计数据处理表
3.1EST-SSRs引物的设计
引物的设计是一个复杂的问题： 涉及目的条带
的长度大小(如大片段的 cDNA， 小片段的点突变基因及其侧
翼序列)； 模板DNA的复杂程度[11]； 引物设计的软件
(Premier Primer、 Oligo、 Dnastar、 Primer-BLAST 等)[16]； 以
及主要参数的差异(引物长度、 Tm值、 GC%含量、 预产物长
度)， 都会导致引物设计结果的变化。
3.2假臭草 EST-SSRs标记 PCR反应体系优化
单因素设计仅对PCR反应体系进行优化， 不能
检测PCR反应体系中各因素间的交互作用， 可能会
导致亚优化结果的产生[17]， 而正交设计试验可以弥
补这一缺点， 可以了解各因素间的内在规律， 找到
最佳的水平组合。 另外， EST序列中缺乏内含子序
列， EST-SSRs标记的对象是基因组DNA， 因此， 基
因组DNA中未识别的内含子剪接位点会干扰引物与
模板的结合， 导致扩增失败， 引物结合位点之间的
内含子会导致扩增产物过长， 或者扩增失败[8]， 如
图4中显示， HWC的扩增产物过长。 在类群间， 内
含子位点是相对保守的， 同时可以通过与模式植物，
如拟南芥或水稻的基因组序列校准提高引物的效率。
本实验中Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产量
具有显著影响， PCR反应体系中的Tag DNA聚合酶
需要 Mg2+来激活， 适量的 Mg2+浓度可以提高 Tag
酶的活性， 浓度过高则抑制Tag酶的活性， 过低则
无法彻底激活Tag酶的活性[18]。 dNTPs作为PCR反
应的原料， 其浓度的大小直接影响PCR的产量， 浓
度过低， 扩增谱带较弱甚至无带， 过高则与Tag酶
发生竞争性抑制， 争夺Mg2+， 抑制 PCR反应[19]。 从
单因素试验结果来看， 引物浓度超过一定值后， 随
着浓度的增加， PCR结果并没有明显的变化， 相对
于PCR反应体系中其他4个因素而言， 引物的优化
应偏向于经济角度考虑[20]。 Tag酶的用量直接影响
PCR的扩增效率， 酶量过多， 不仅增加实验成本，
同时也会提高错配率， 引起非特异性扩增， 用量过
低则导致酶与引物无法完美的结合。 模板DNA的质
量和用量影响PCR的敏感性和扩增效率， 图2-E所
示， 模板 DNA用量不同， 其扩增结果有显著差异，
用量过多时， 扩增谱带出现弥散和变弱的现象。 正
交直观分析结果显示的最佳PCR反应体系并不在正
交组合中， 但与组合 9和组合 15接近， 然而与组
合 15相比， 组合 9中对 Tag酶和引物的需求量较
多， 从经济角度考虑， 节约成本， 最终选择组合15
图3 正交试验设计PCR扩增产物电泳结果
说明： M为marker DL 2000,1～16分别代表表3中的16个组合
M 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250b
100bp
图4 PCR最佳反应体系的稳定性
说明： 1～14依次为假臭草样HHK1、 HHK2、 HHK3、 HDZ1、 HDZ2、 HWN1、
HWN2、 HWN3、 GZJ、 HWC、 GZH1、 GZH2、 GZH3、 GHY。 M： DL2000 marker。
M 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250b
100bp
32- -
黄 敏 等 假臭草EST-SSRs标记的开发
为假臭草 EST-SSRs标记的 PCR最优反应体系， 即
在 20μL的反应体系中， Mg2+浓度为 2.75mmol/L，
模板 DNA用量为 35ng， TagDNA聚合酶为 2.25U，
dNTPs浓度为0.3mmol/L， 引物浓度为0.6μmol/L。
与甘蔗[21]、 茄子[22]以及蔷薇科植物[23]相比， 假臭草
EST-SSRsPC最优反应体系中的 Tag酶用量偏高，
这可能是由于研究对象以及样品处理方式的差异所
导致的。
3.3EST-SSRs标记的可通用性研究
目前， 关于 EST-SSRs标记的可通用性研究已
取得了一定的成果。 Malay等[24]研究发现， 苇状羊
茅(Festuca arundinacea Schreb.)的EST-SSRs引物在
11种禾本科植物间产生清晰的扩增谱带， 可用于
羊茅属和黑麦草属的遗传研究。 Gasic等[23]研究
苹果 EST-SSRs引物在 50种蔷薇科植物间的通用
性， 其通用能力为25%(杏子)～59%(梨)， 其中11对
引物可进一步用于蔷薇科植物间的通用性研究。 小
麦[25]、 茄子[2]等也有 EST-SSRs通用性研究的相关
报道。 本研究开发的EST-SSRs标记在14个假臭草
样本的稳定性验证结果同样表明， 使用胜红蓟、 薇
甘菊和甜叶菊 EST序列建立起来的 EST-SSRs标记
也可用于研究近缘种假臭草的遗传多样性。
致 谢 感谢国家标本平台教学标本子平台资助(http://mnh.
scu.edu.cn/)。
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