全 文 ：畜牧兽医科学
中国农学通报 第24卷 第2期 2008年 2月
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基金项目：国家自然科学基金两个基地项目（30510403163）；国家自然科学基金项目（30571340）。
第一作者简介：冯海华，女，1970年出生，山东省临朐人，讲师，博士，主要从事兽医药理学方面的研究。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333
号吉林大学畜牧兽医学院，Tel：0431-87986162，E-mail:fhh70@163.com。
通讯作者：邓旭明，男，1964年出生，教授，博士，主要从事兽医药理学方面的研究。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333号吉林大学畜牧兽
医学院，Tel：0431-87986162，E-mail：xumingdeng@yahoo.com。
收稿日期：2007-11-08，修回日期：2007-12-04。
IGF1对生长30d鹿茸的体外培养鹿茸生长中心
干细胞的影响
冯海华 1,赵丽红 1,闭兴明 1,李光凤 1,岳占碰 1,李春义 2,邓旭明 1
（1吉林大学畜牧兽医学院，长春130062；2新西兰INVERMAY农业研究中心，Mosgiel，新西兰50034）
摘 要:【研究目的】利用细胞培养技术,探讨胰岛素样生长因子(IGF1)对生长30d的鹿茸体外培养不同
代数梅花鹿鹿茸生长中心干细胞(鹿茸干细胞)的影响;【方法】原代分离、培养生长30d的鹿茸的梅花鹿
鹿茸干细胞,将第2代、5代、8代鹿茸干细胞经含有不同浓度的IGF1(0,1,3,和10nM)作用后,在培养
24h后用3H-胸腺嘧啶核苷测定法检测每分钟衰变数(DPM)值;【结果】取材于生长30d鹿茸的干细胞,
全部IGF1处理组(1,3,10nM)都显著高于对照组(0nM)(p<0.01)。3个不同浓度IGFⅠ处理组的平均值
和最高值都是离体培养2代的细胞最低(分别为2987和3743DPM/mg蛋白),而培养 5代的细胞最高
(分别为 10320和 12180DPM/mg蛋白),第 8代的细胞又开始下降(分别为 8754和 11568DPM/mg蛋
白);【结论】IGF1能够促进鹿茸干细胞分裂增殖,生长30d鹿茸的干细胞在离体培养,不同培养时期的
鹿茸干细胞对IGFⅠ刺激的敏感度不同。
关键词:IGF1;鹿茸;干细胞;梅花鹿
中图分类号:Q78,S852.65 文献标识码:A
EfcetsofInsulin-LikeGrowthFactor1ontheProliferationOrganicCenterStemCels
at30daysGrowingPeriodofAntlerinVitro
FengHaihua1,ZhaoLihong1,BiXingming1,LiGuangfeng1,YueZhanpeng1,LiChunyi2,DengXuming1
（1ColegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062;
2AgResearchLimitedInvermayAgriculturalCentrePuddleAley,Mosgiel,NewZealand,PrivateBag50034）
Abstract:【OBJECTIVE】Usingcelculturetechniquestoinvestigatetheefcetsofinsulin-likegrowthfactor
1(IGF1)ontheproliferationofantlerorganiccenterstemcels（antlerstemcels）fromvariouspassagesat30
daysgrowingperiodofantlerinvitro;【METHOD】Antlerstemcelswereisolatedfromsikadeerantlerof
growing30dayandcultured.Thesecond,fifthandeighthpopulationcelswereincubatedwith0,1,3,and
10nMIGF1.Thymidineincorporationassaywasappliedafter24hoursofculturerespectivelytodetermine
thedisintegrationperminute(DPM)value;【RESULTS】Theproliferationofcelsfromgrowing30daysantler
intheexperientalgroup (1,3,10nM)wassignificantlyhigherthanthatofthecontrolgroup（0nM）(p<0.01).
Theaverageandmaximalvalueoftheproliferationofcelsintheexperientalgroupwaslowestinthesecond
populationcels (2987and3743DPM/mgrespectively),highestinthefifthpopulationcels (10320and
12180DPM/mg),anddecreasedintheeighthpopulationcelsagain(8754and11568DPM/mg);【CONCLU-
SION】IGF1canenhancetheproliferationofantlerstemcelsculturedinvitro.ThesensitivityofIGF1onthe
antlerstemcelsfromvariouspassagesat30daysgrowingperiodofantlerinvitro.
Keywords:IGF1,antler,stemcel,SikaDeer
畜牧兽医科学
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畜牧兽医科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.22008February
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鹿角独特之处在于它的每年更新，这在哺乳动物
中绝无仅有，因而成为研究器官再生的理想模型[1,2]。鹿
角生长周期受雄激素的调节，春天睾酮含量下降，鹿角
脱落，鹿茸再生随即发生；夏天睾酮水平保持最低，鹿
茸快速生长；秋天睾酮含量急剧上升，鹿茸的生长停止
和完全骨化、脱掉茸皮；冬天由于睾酮处于高水平，使
鹿角紧附于角柄，直到次年春天睾酮水平下降才脱落，
并触发新一轮鹿茸的再生[3,4]。在生长期，鹿茸的生长呈
典型的S形曲线，开始时较慢，生长中期最快呈几何级
数，然后生长速度下降，IGF1可能是刺激鹿茸生长的
主要生长因子[1,5]。该研究在梅花鹿鹿茸生长的30d时
分离鹿茸干细胞传代培养，检测干细胞对IGF1刺激的
敏感度，以探讨影响早期鹿茸生长速度的因素。
1材料与方法
1.1试验材料
实验于2005-03/2006-06在吉林大学畜牧兽医学
院基础兽医研究室完成。选定4岁龄的健康梅花鹿（农
科院左家特产研究所提供），在鹿茸生长的30d进行取
材。
1.2试剂
DMEM培养基（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；I型胶
原酶(Invitrogen)；犊牛血清(Invitrogen)；台盼兰（Sig-
ma）；DMSO（Sigma）；IGF1（Roche）。
1.3组织分离
选定4岁龄的健康梅花鹿，在鹿茸生长30d锯取
鹿茸。锯下的鹿茸在细胞培养室的准备间消毒，并用
手术刀切取5cm长的鹿茸尖部。在细胞培养间将鹿茸
尖部从中央部纵向切开以暴露茸尖内部组织。依据Li
等[2]的取材方法，在解剖显微镜下定位切取鹿茸的间
质层。
1.4细胞培养
用平衡缓冲盐溶液清洗鹿茸间质层组织三次。将
组织切碎，再用缓冲液清洗。将清洗后的组织碎块移入
含有鹿茸组织消化液（90%DMEM培养液，10%的犊牛
血清，青（100U/ml）、链（100μg/ml）霉素，以及最终浓
度为200U/ml的I型胶原酶）的培养瓶中。于37℃温
箱中孵育3h左右。消化后的组织和游离出的细胞通过
离心除去消化液，再用细胞培养液清洗两次后转移至
培养瓶中培养。培养3d后换液并继续培养直到大多细
胞群落相互融合为止。用胰酶-EDTA消化掉贴瓶生长
的细胞，并对消化掉的细胞进行台盼兰染色以确定细
胞的活性。活性确定后的细胞被分装到含有1ml冻存
液的冻存管中（约为1百万个细胞/ml/管）逐步降温
冻存至液氮罐中。
1.5实验设计
细胞长满培养面的85%~90%时，用胰酶-EDTA
将细胞消化掉并用台盼兰染色法确定细胞活性。将细
胞以2×104细胞/ml的密度接种到24孔板的孔中，分
别培养2代、5代、8代细胞。培养48h后，用等量不含
犊牛血清但含有不同浓度的 IGF1（0，1，3，和 10nM）
的培养液来替换孔中正常培养液，每个处理都为4孔
重复，继续培养24h。在培养结束前2h，于培养液中加
入 2.5μCi/ml的 3H-胸腺嘧啶核苷。培养结束后用
4℃的三氯乙酸（TCA，10%）清洗细胞 3次。再用
500μl1NNaOH溶解细胞。吸取200μl溶解液于液体
闪烁计数器中测定放射强度。另吸取200μl溶解液进
行蛋白含量测定。最终结果以4孔的算术平均数±标准
差来表示，单位为DPM/mg蛋白。
1.6数据统计
采用SPSS10.0对所得数据进行方差分析，数据以
x±s表示，以确定处理组（含有不同浓度的IGF1组）与
对照组（无IGF1组）之间差异的显著性。
2结果
2.1鹿茸干细胞的分离、培养
用含10%犊牛血清的的DMEM培养的鹿茸干细
胞第3天全量换液除去未贴壁的细胞，倒置显微镜下
观察，鹿茸干细胞此时已贴壁，细胞形态均匀，呈梭形，
细胞呈克隆性生长，贴壁的细胞迅速增殖。台盼兰检测
结果表明试验中所用的细胞活性全部都在90%以上。
图1IGF1对体外培养不同代数鹿茸生长中心干细胞分泌蛋白
含量的影响
2.2IGF1对鹿茸干细胞的影响
结果见图1。取材于生长30d鹿茸的干细胞，全部
IGF1处理组都显著高于对照组（p<0.01）。3个不同浓
度 IGFⅠ（1，3，10nM）处理组的平均值和最高值都是
离体培养 2代的细胞最低（分别为 2987和 3743
DPM/mg蛋白）；而培养 5代的细胞最高（分别为
10320和12180DPM/mg蛋白）；到了第8代的细胞这
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些值又开始下降（分别为 8754和11568DPM/mg蛋
白）。这说明，IGF1能够促进鹿茸干细胞分裂增殖，生
长30d鹿茸的干细胞在离体培养，不同培养时期的鹿
茸干细胞对IGFⅠ刺激的敏感度不同，离体培养2代
后对IGFⅠ的敏感度仍处于较低的水平，传代到第5
代时其敏感度才达到高峰，到第8代时敏感度又开始
下降。
3讨论
近几年Li等[2,6]连续报道了如何在未经染色的、新
鲜鹿茸的组织切面上精确定位和取材鹿茸干细胞的方
法。该取材方法的建立为在细胞和分子水平上研究鹿
茸生物学，以及在建立鹿茸生物医学模型上提供了有
利的手段。笔者通过这种方法获得的细胞能满足实验
需要。
IGFⅠ是一种促细胞分化的生长因子，存在于鹿茸
角顶部再生鹿茸角增殖区，促进间充质干细胞及软骨
细胞的增殖。在鹿茸组织内有IGFⅠ和IGFⅡ的表达，
IGFⅠ和IGFⅡ受体在鹿茸角顶部也有表达，体外试验
证实，IGFⅠ和IGFⅡ均可促进鹿茸细胞的增殖[7]。实验
所有IGF1处理组，鹿茸干细胞的分裂繁殖都与加入的
IGF1浓度呈明显的量-效关系。这与Sadighi等[8]的报
道结果相似，他们发现3-10nM范围的IGF1浓度对培
养的鹿茸尖部细胞具有最大的刺激作用。
研究通过细胞培养证实生长早期的鹿茸干细胞，
在不同培养代数对IGF1刺激的敏感度不同，在离体培
养2代后对IGFⅠ的敏感度仍处于较低的水平，传代
到第5代时其敏感度才达到高峰，到第8代时敏感度
又开始下降。说明鹿茸干细胞本身对IGF1刺激的敏感
度的变化也是影响鹿茸生长速度的主要因素。
参考文献
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