全 文 ：吉林农业大学学报 2015，37(4) :463 ～ 468 http:/ / xuebao． jlau． edu． cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@ vip． sina． com
鹿茸干细胞 MSAP 分析技术体系的建立及引
物筛选
*
杨 春，刘 振，路 晓，李春义
＊＊
中国农业科学院特产研究所，吉林省特种动物分子生物学省部共建国家重点实验室，长春
130112
摘 要:利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)技术进行鹿茸干细
胞基因组 DNA甲基化研究，建立并优化鹿茸干细胞 MSAP 技术分析的反应体系。对 MSAP 技术中的关键步
骤 DNA提取、酶切、预扩增反应中连接产物稀释倍数、选择性扩增反应中预扩增产物稀释倍数等条件进行了
优化。同时，利用优化条件，应用 ABI3730xl 测序仪对 64 对引物进行筛选。结果表明:优化后的反应体系得
到条带清晰、重复好和特异性强的选择扩增产物。建立的 MSAP反应体系保证了 MSAP图谱的稳定性和多态
性，筛选出来的 32 对引物组合满足鹿茸干细胞以及后续鹿相关基因组 DNA甲基化研究。
关键词:鹿茸干细胞;甲基化敏感扩增多态性;引物筛选
中图分类号:S829. 9 文献标识码:A 文章编号:1000-5684(2015)04-0463-06
DOI:10． 13327 / j． jjlau． 2015． 2625
引文格式:杨春，刘振，路晓，等．鹿茸干细胞 MSAP 分析技术体系的建立及引物筛选［J］．吉林农业大学学
报，2015，37(4):463-468．
Establishment of MSAP Analysis System and Selection of Primers for
Antler Stem Cell
YANG Chun，LIU Zhen，LU Xiao，LI Chunyi
State Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals，Institute of Special Animal
and Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130112，China
Abstract:In this study，we investigated genome-wide DNA methylation in antler stem cells，and es-
tablished methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP)system． The key factors influencing
the results of MSAP system were comparetively analyzed． DNA extraction，reaction time of restricted
enzymes，diluted multiples of adapter-ligation DNA for pre-amplification products，and diluted factor
of pre-amplification products for selective amplification were optimized． Meanwhile，the established
MSAP conditions were used to conduct a preliminary polymorphism screeing on 64 pairs of primers．
The results showed the clear bands，specificity and polymorphism of selective amplification product
could be obtained in the established MSAP system． Clear and stable MSAP patterns were achieved，
and 32 pairs of primers were selected for MSAP analysis． These results provide fundamental refer-
ence for further analysis of genome-wide DNA methylation on antler stem cells and deer．
Key words:antler stem cell;MSAP;primer screening
＊
＊＊
基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(31402059)
作者简介:杨春，男，博士，助理研究员，研究方向:鹿茸生物学和分子遗传学。
收稿日期:2015-04-15
通讯作者
吉林农业大学学报 2015 年 8 月
Journal of Jilin Agricultural University 2015，August
在动植物中，胞嘧啶 DNA甲基化是一种重要
的表观遗传学修饰方式。DNA 甲基化在生物界
基因组中广泛存在，在生物生命活动中起重要作
用，如基因的表达调控、细胞增殖、分化和多能性
等［1-3］。近年来，DNA 甲基化在再生医学领域成
为了研究热点。研究表明:基因和基因组 DNA甲
基化状态的变化能够影响相关组织和器官的再
生，如爪蟾尾部再生［4］、啮齿类脊髓再生［5］、斑马
鱼鳍再生［6］、斑马鱼视网膜再生［7］、肌肉再生［8］
和人毛囊再生［9］等。这些研究表明:DNA 甲基化
能够影响哺乳动物组织和器官的再生。
断肢再生是人类的梦想，是再生医学的研究
热点。目前，断肢再生的研究还仅局限于低等脊
椎动物(特别是两栖类，如蝾螈)。鹿茸是目前已
知的唯一能够完全周期再生的哺乳动物附属器
官［10-12］，因此将鹿茸作为哺乳动物断肢再生研究
的动物模型更具有针对性，将为人类断肢再生梦
想的早日实现提供可靠科学依据。鹿茸每年春季
由雄鹿的角柄上再生，角柄骨膜是鹿茸再生的关
键组织［13-16］。研究表明:鹿茸角柄骨膜细胞具有
干细胞特性，不仅能够表达胚胎干细胞特征基因
(如 Oct4、Nanog 和 Sox2) ，还能够分化成为多种
细胞类型，如软骨、脂肪、肌纤维和神经样细胞
等［17］。因此，鹿茸角柄骨膜细胞又被称为鹿茸干
细胞，而鹿茸的再生是基于鹿茸干细胞的再生。
目前，鹿基因组还未测定，所以鹿茸再生的分子调
控机制还不明了，尤其是表观遗传学调控机制。
DNA甲基化敏感性扩增片段多态性(Methyl-
ation sensitive amplified polymorphism，MSAP)是
在 AFLP技术的基础上建立起来的一种检测基因
组 DNA甲基化的方法［18］。MSAP 技术能够在无
基因组背景条件下对基因组 DNA 甲基化进行分
析，目前已广泛应用在动植物基因组 DNA甲基化
水平的检测上，如鸡［19］、猪［20］、玉米［21］、西瓜［22］
等。MSAP方法使用 HpaⅡ和 MspⅠ检测基因组
CCGG位点中的胞嘧啶甲基化状态。HpaⅡ和
MspⅠ是一组同裂酶，能够识别相同的 CCGG 位
点。但是，它们对胞嘧啶甲基化状态具有不同敏
感性，通过它们对基因组酶切，将产生不同的甲基
化片段，最后通过对片段的统计分析出基因组胞
嘧啶 DNA甲基化程度。本研究以鹿茸干细胞为
试验材料，通过优化酶切、预扩增和选择性扩增条
件建立适合检测鹿茸干细胞的 MSAP 方法，最后
通过利用 ABI3730xl测序仪进行引物筛选。所建
立的 MSAP方法将为今后研究鹿茸再生与 DNA
甲基化调控机制间关系奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 鹿茸干细胞基因组 DNA提取
鹿茸干细胞为吉林省特种动物分子生物学省
部共建国家重点实验室冻存样品。将鹿茸干细胞
分别按照细胞基因组 DNA 提取试剂盒(QIA-
GEN)操作手册和酚氯仿抽提的方法进行 DNA提
取及纯化，用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整
性，Biophotometer分光光度计(Eppendorf)检测浓
度。
1. 2 鹿茸干细胞基因组 DNA 的 MSAP 分析及
引物筛选
MSAP技术主要由 3 部分组成，DNA酶切、预
扩增和选择性扩增。其中，接头序列、预扩增引物
序列和选择性引物序列分别参照 Xu等［23］的方法
设计。分别取等量的 E 和 H-M 接头上下游引物
混匀，在 95 ℃ 10 min，85 ℃ 10 min，55 ℃
10 min，16 ℃ 10 min 条件下进行退火反应，获得
双链 E和 H-M接头。另外，选择性扩增引物使用
FAM荧光标记，接头和引物见表 1。
1. 2. 1 DNA 酶切体系建立 分别选取 250，
500，1 000 ng 鹿茸干细胞基因组 DNA，同时进行
HpaⅡ /EcoＲⅠ和 MspⅠ /EcoＲⅠ双酶切，体系:
3 组基因组 DNA，EcoＲⅠ和 HpaⅡ各 10 U，MspⅠ
为 20 U，37 ℃水浴 8 h，65 ℃灭活 20 min;酶切产
物用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，选择效果最佳
的双酶切反应条件。按照 DNA T4 Ligation Kit
(Thermo)要求，16 ℃连接过夜，65 ℃灭活20 min，
加水分别稀释 5，10，15，20 倍，稀释后的产物作为
预扩增模板备用。
1. 2. 2 预扩增体系建立 选取 2 μL 不同稀释
倍数的酶切连接产物作为模版进行预扩增，预扩
增引物见表 1。预扩增反应条件:94 ℃ 5 min;
94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环;
72 ℃ 7 min，16 ℃保存。预扩增产物 0. 8%琼脂
糖凝胶电泳检测。确定最佳连接产物浓度。将预
扩增产物再次分别加水稀释 5，10，15，20 倍作为
选择性扩增模板备用。
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杨春等:鹿茸干细胞 MSAP分析技术体系的建立及引物筛选
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
表 1 引物和接头
Table 1． Primers and adapters
引物 /接头 序列
EcoＲⅠ接头
5-CTCGTAGACTCGTACC-3
3-CATCTGACGCATGGTTAA-5
E+1 预
扩增引物
5-GACTGCGTACCAATTC+A-3
E+3 选择性
扩增引物
5-GACTGCGTACCAATTC+AAC-3
5-GACTGCGTACCAATTC+AAG-3
5-GACTGCGTACCAATTC+ACA-3
5-GACTGCGTACCAATTC+AGT-3
5-GACTGCGTACCAATTC+ATC-3
5-GACTGCGTACCAATTC+ACT-3
5-GACTGCGTACCAATTC+AGA-3
5-GACTGCGTACCAATTC+ATG-3
HpaⅡ /MspⅠ
接头
5-GACGATGAGTCTAGAA-3
3-CTACTCAGATCTTGC-5
HM+1 预
扩增引物
5-GATGAGTCTAGAACGG+T-3
HM+3 选择性
扩增引物
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+TAC-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+TAG-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+TAT-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+TAA-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+CAC-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+CAG-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+CAT-3
5-FAM－GATGAGTCTAGAACGG+CAA-3
1. 2. 3 选择扩增体系建立 不同稀释倍数的预
扩增产物 2 μL，FAM 标记的 H-M + 3 引物
20 pmol，E+3 引物 10 pmol，dNTP Mixture 1. 2 μL，
10 倍PCＲ buffer 2 μL，ExTaq 酶 0. 1 μL。PCＲ 扩
增条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，65 ℃(每循环
－0. 7 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，共 13 个循环;继续
94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行 23 个循
环，最后 72 ℃ 7 min。PCＲ扩增试剂购自 TaKaＲa
公司。选择扩增产物通过 ABI3730xl 测序仪上进
行毛细管电泳检测，最终选择出最佳预扩增产物
浓度。
1. 2. 4 引物筛选 利用优化好的 MSAP 方法，
对由 EcoＲⅠ引物 8 个，H-M引物 8 个，共计 64 对
引物进行筛选，引物序列见表 1。所有 FAM 荧光
标记好的选择性扩增产物在 ABI3730xl 测序仪上
进行毛细管电泳检测。具体步骤:将 5 μL选择扩
增样品分别加入 96 孔板中，6. 5 μL 甲酰胺，
0. 25 μL ＲOX500 分子量内标，95 ℃变性 10 min
后冰上放置 10 min，进行毛细管电泳。数据结果
通过 GeneScan3. 0 进行输出，最后通过自主开发
的 MSA分析软件对荧光图谱进行数据统计，选择
出重复性好和多态性强的引物对组合。
2 结 果
2. 1 基因组 DNA提取
由于 MSAP方法对 DNA 模版质量要求非常
高，试验使用细胞及组织 DNA 提取试剂盒进行
DNA的提取与纯化(QIAGEN) ，所得 DNA 通过
0. 8%琼脂糖电泳检测并进行浓度测定。结果
(图 1)显示，样品 1 为使用试剂盒所提取 DNA，其
主带清晰，没有发生降解，胶孔处没有蛋白质残留
和 ＲNA 残留。样品 2、3、4 为采用酚氯仿手提
DNA，虽然主带清晰，但是有部分蛋白残留，这将
影响后续酶切试验和毛细管电泳结果。样品 1 符
合 MSAP技术对 DNA质量的要求。
M． Marker DL2000;1 ～ 4． 基因组 DNA
图 1 鹿茸干细胞基因组 DNA
Fig． 1． DNA of antler stem cell
2. 2 酶切结果
基因组 DNA的用量和 DNA酶切效果将直接
影响预扩增结果。试验发现酶切模版量为
250 ng，酶切 8 h 条件下，DNA 酶切最完全(图
2) ，基因组酶切呈涂抹带。而其他浓度 DNA样品
在 8 h还不能够完全酶切。酶切时间过长会导致
DNA降解，在 MSAP 过程中影响预扩增产物质
量，导致预扩增片段上移。
2. 3 预扩增结果
依据预扩增产物片段范围应集中在 100 ～
1 000 bp 呈弥散状分布的原则，对不同稀释倍数
连接产物为模板进行预扩增，确定连接产物稀释
倍数。结果表明:连接产物在稀释 20 倍时，预扩
增结果最好，条带在 100 ～ 1 000 bp(图 3)。其他
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吉林农业大学学报 2015 年 8 月
Journal of Jilin Agricultural University 2015，August
预扩增结果可能由于模板浓度过高，条带范围均
超过规定范围，而且扩增片段在 250 ～ 1 000 bp富
集。最能够符合预扩增标准，最终确定连接产物
稀释 20 倍为最佳稀释倍数，预扩增效果最佳。
M． Marker DL2000;1，3，5． HpaⅡ /EcoＲⅠ 酶切 250，500，
1 000 ng DNA;2，4，6． MspⅠ /EcoＲⅠ 酶切 250，500，
1 000 ng DNA
图 2 不同浓度 DNA酶切
Fig． 2． Ｒestriction enzyme reaction of DNA of dif-
ferent concentration
M． Marker DL2000;1 ～ 4． 模板稀释 5，10，15，20 倍
图 3 预扩增结果
Fig． 3． Ｒesults of pre-amplification
2. 4 选择扩增结果
预扩增产物进行稀释后作为选择性扩增模
板，通过分别比较预扩增产物稀释 5，10，15，20 倍
的选择性扩增。结果表明:当预扩增产物稀释为
5，10，15，20 倍时，选择扩增条带均集中在 100 ～
500 bp，由于选择性扩增引物比预扩增引物多3 个
选择碱基，对甲基化片段具有更高的特异性，能够
看到明显条带(图 4) ，这表明所选择的引物特异
性和多态性强的特点。另外，通过对条带分布可
以清晰的看出，5 倍稀释的选择扩增产物浓度偏
高不利于后续试验，而且在 500 ～ 750 bp 有集中
条带。10 倍、15 倍稀释选择扩增结果与 20 倍稀
释结果比较，部分条带分离特异性不强，分离不明
显、集中。20 倍稀释结果与前 3 种结果比较来
看，条带分布和条带分离比较平均，特异性条带非
常清晰，能够通过肉眼辨别，最终确定预扩增产物
稀释 20 倍为最佳条件。
M． Marker DL2000;1 ～ 4． 模板稀释 5，10，15，20 倍
图 4 选择扩增结果
Fig． 4． Ｒesults of selective amplification
2. 5 引物筛选
利用优化后的 MSAP 反应体系，使用 ABI
3730xl测序仪对所有 64 对引物的选择性扩增产
物进行毛细管电泳检测，选择扩增引物的筛选决
定了 MSAP后续数据的可信性。而选择扩增引物
的原则为扩增条带清晰、特异性强、多态性强。最
后从 64 对引物组合中初步筛选出具有多态性强
特点的引物组合 32 对，部分引物筛选结果见图
5。由图 5 可见，1、2、5、7、8 这 5 对引物条带分布
均匀、多态性高和扩增条带多。相比而言，3、4、6
这 3 对引物在扩增条带、条带分布和多态性上都
弱于上面 5 对引物。所以通过对所有 64 对引物
筛选后，最终筛选出 32 对选择扩增引物。
图 5 引物的筛选
Fig． 5． Primer screening of MSAP
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杨春等:鹿茸干细胞 MSAP分析技术体系的建立及引物筛选
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3 讨 论
MSAP方法是一种基于 AFLP 技术的检测基
因组 DNA甲基化状态的方法。其主要是通过同
裂酶 HpaⅡ和 MspⅠ对基因组进行酶切，由于同
裂酶对 CCGG位点中胞嘧啶甲基化程度不同的敏
感性将产生不同的酶切片段，从而通过所产生片
段的类型和数量统计出基因组 DNA甲基化状态。
近年来，MSAP 方法已经应用到了很多动植物
DNA甲基化研究中，并且被广泛认为最经济和最
快捷的检测基因组 DNA甲基化的方法，并且不需
要基因组背景，这对于很多没有基因组数据的物
种来说是唯一的基因组 DNA甲基化检测方法，为
无基因组数据物种的表观遗传学研究提供了便利
途径。通过 MSAP 方法可对鹿茸干细胞中 DNA
甲基化状态进行分析，为深入了解鹿茸再生机制
奠定基础，提供研究思路。MSAP 技术体系由
DNA酶切、连接、预扩增和选择扩增 4 部分组成。
其对 DNA模板质量的要求非常高，DNA 的提取
过程不仅要保证 DNA 的完整性，而且还要保证
DNA中没有糖、蛋白质和 ＲNA 的残留。本试验
在 DNA提取时对不同方法做了相关比较，发现用
酚氯仿抽提的方法虽然能够节约成本，但是会造
成 DNA的污染、降解、蛋白质残留等。所以，在进
行 DNA提取时使用高质量的 DNA提取试剂盒对
于 MSAP 至关重要，不仅能够保证 DNA 的质量，
而且所提取的 DNA 浓度也符合 MSAP 所要求的
标准，无需过多的稀释而造成 DNA 浓度出现误
差。
预扩增反应产物主要集中在 100 ～ 1 000 bp
区间，条带呈弥散状态，无清晰可见条带。预扩增
反应体系优化中，发现对 PCＲ反应影响比较大的
是预扩增模板量和 ExTaq酶的用量。模板量过高
会导致条带区间超过 1 000 bp，而 ExTaq 酶的用
量过高会导致片段低于 250 bp。这可能是因为
ExTaq酶用量过多，酶的活性过高导致了片段背
景过高，从而使人产生错觉。所以，在 MSAP扩增
过程中由于模板用量非常小，另外需要 2 轮扩增。
虽然预扩增模板通过稀释而作为选择性扩增模
板，但是里面也会残留 ExTaq酶。
在引物筛选过程中，通过 ABI3730xl 测序仪
来完成引物的筛选，节约时间，省去繁琐的步骤，
提高检测效率，减少人为操作的误差，增强结果的
准确性和稳定性。另外，测序仪可对 96 个样品同
时进行分析，不仅节约时间而且满足大量样品检
测的高通量需要［24-25］。比较而言，FAM 标记的毛
细管电泳不但包括基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的
MSAP 方法的所有步骤，还包括了荧光检测特有
的内标，大大提高了数据统计过程的可靠性。
鹿茸是唯一可以周期再生的哺乳动物附属器
官，对鹿茸再生过程进行深入研究对实现人类断
肢再生研究具有参考价值。本试验以鹿茸再生的
基础———鹿茸干细胞为材料，通过对基因组 DNA
用量、酶切体系优化、预扩增和选择性扩增优化建
立了适合检测鹿基因组的 MSAP 方法，并且通过
毛细管电泳对引物进行了筛选。建立了能够适用
于毛细管电泳检测的 MSAP方法，节约了时间，提
高了结果的准确性，为鹿茸再生表观遗传学调控
机制的研究奠定基础。
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(责任编辑:林海涛
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物全年仍为24. 00 元;2007—2008 年出版的刊物全年为 32. 00 元;2009 年出版的刊物全年为 40. 00 元)。
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