全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(7): 10471055 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31170650)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-23)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王新超, E-mail: wangxinchao@caas.cn; 杨亚军, E-mail: yjyang@tricaas.com
第一作者联系方式: E-mail: zhouyh@tricaas.com
Received(收稿日期): 2015-01-15; Accepted(接受日期): 2015-04-02; Published online(网络出版日期): 2015-05-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150504.1026.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01047
冷驯化不同阶段茶树 DNA甲基化模式的变化
周艳华 曹红利 岳 川 王 璐 郝心愿 王新超* 杨亚军*
中国农业科学院茶叶研究所 / 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室 / 国家茶树改良中心, 浙江杭州 310008
摘 要: 低温胁迫是影响茶树产量、生长发育和地域分布的重要环境因子之一, 需要通过冷驯化的诱导来提高其抗
寒性。DNA甲基化是植物表观遗传的重要方式, 环境胁迫会引起植物 DNA甲基化状态的改变。为研究 DNA甲基化
是否参与茶树的低温响应, 本研究利用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)和高效液相色谱法(HPLC), 分析了不同
冷驯化阶段茶树基因组 DNA甲基化水平及状态变化。MSAP分析结果表明, 50对选择性扩增引物在对照、驯化后和
脱驯化样品中分别扩增出 905、968和 970个甲基化条带, 总甲基化位点比例分别为 50.6%、54.1%和 54.2%。与未驯
化的样品相比, 冷驯化后和脱驯化的样品基因组 DNA甲基化水平升高。HPLC的检测结果与 MSAP结果类似。进一
步分析甲基化模式发现, 与对照相比, 茶树冷驯化过程中同时发生了甲基化和去甲基化现象, 但总体变化趋势表现
为甲基化水平的增加。表明茶树在抗寒响应中出现 DNA甲基化现象。
关键词: 茶树; 冷驯化; DNA甲基化; 甲基化敏感扩增多态性(MSAP); 高效液相色谱(HPLC)
Changes of DNA Methylation Levels and Patterns in Tea Plant (Camellia sinen-
sis) during Cold Acclimation
ZHOU Yan-Hua, CAO Hong-Li, YUE Chuan, WANG Lu, HAO Xin-Yuan, WANG Xin-Chao*, and YANG
Ya-Jun*
Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture
/ National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China
Abstract: Low temperature is one of the most critical environmental factors that limit tea plant growth, survival and geographical
distribution. Tea plant can enhance its cold tolerance after undergoing a period of cold acclimation. DNA methylation is one of the
epigenetic phenomena in plant, and can be altered by environmental stress. In order to explore the relationship between DNA me-
thylation and low temperature stress response in tea plant, methylation sensitive amplified polymorphism (MSAP) and high per-
formance liquid chromatography (HPLC) were used to analyze the changes of DNA methylation level and pattern in this study.
The MSAP results showed that 905, 968, and 970 methylated bands were amplified with 50 selected primers in non-acclimated
sample (CK), fully acclimated and de-acclimated samples, with the methylation levels of 50.6%, 54.1%, and 54.2%, respectively.
DNA methylation levels in fully acclimated and de-acclimated samples were increased compared with CK. HPLC results were
similar with MSAP results. In addition, DNA demethylation and methylation were both occurred during cold acclimation, but the
DNA methylation level was increased more than the DNA demethylation level. These results indicated that DNA methylation may
participate in the response of cold acclimation in tea plant.
Keywords: Tea plant; Cold acclimation; DNA methylation; MSAP; HPLC
茶树原产于热带及亚热带, 是一种喜温暖气候
条件的叶用植物[1]。作为一种多年生植物, 茶树在其
一生中要经历多次的冬季低温胁迫。而能否安全越
冬是茶树能否存活以及茶叶种植北限的决定因素。
另一方面, 春季的“倒春寒”对茶芽的危害是影响茶
叶生产效益的一种非常重要的气象因子, 轻者影响
当年茶叶产量和品质, 重者导致茶树死亡。近年来,
随着全球气温的不稳定性, 预防气温特别是低温给
1048 作 物 学 报 第 41卷


茶树生长可能造成的伤害, 也愈来愈显示出其重要
性。怎样提高茶树的抗寒性, 已成为关系茶叶能否
正常生产的关键问题之一。因此研究茶树抗寒性的
机制具有重要的意义。现有研究结果表明, 茶树的
抗寒性需要通过一定时间和程度的低温驯化才能体
现出来, 在经过冷驯化之后, 茶树在形态结构、生理
生化以及基因表达等方面都发生一定的适应性变化,
从而能够忍受一定程度低温胁迫的影响[2-5]。一些与
茶树抗寒有关的基因也被分离出来[6-8], 然而对茶树
表观修饰与抗寒之间关系的研究尚未见报道。
表观遗传主要是研究没有 DNA序列变化的、可
遗传的基因表达的改变[9]。许多研究结果表明, 表观
遗传在植物生长发育和逆境胁迫响应过程中起着极
其重要的作用, 其中DNA甲基化是表观遗传学的重
要修饰形式之一[10]。DNA甲基化(DNA methylation)
是指在DNA甲基转移酶的作用下, 将甲基基团添加
到胞嘧啶的 5 位碳原子上, 而形成 5-甲基胞嘧啶
(5mC)的过程。DNA 甲基化现象在高等植物中普遍
存在 , 但在不同植物种类中甲基化水平存在差异 ,
一般基因组 DNA 有 30%~50%的胞嘧啶处于甲基化
状态[11]。作为表观遗传的重要修饰途径之一, DNA
甲基化与基因表达调控[12]、基因组印记[13]和转基因
沉默[14]等生物学过程密切相关。
非生物胁迫或生物胁迫均会引起植物基因组
DNA甲基化水平的改变。如潘雅姣等[15]发现水分胁
迫导致水稻基因组约 20%的 CCGG位点发生胞嘧啶
甲基化, 其中根部增加幅度尤为明显。Steward等[16]
发现玉米幼苗在遭受低温胁迫时, 根组织基因组出
现广泛的去甲基化。高桂珍等[17]发现油菜种子在热
胁迫处理后, 基因组DNA甲基化水平表现出下降趋
势, 同时有甲基化和去甲基化现象发生, 并以去甲
基化为主。Robert 等[18]发现将拟南芥暴露在致病或
无害的丁香假单胞菌菌株下或用水杨酸处理后, 拟
南芥基因组出现差异甲基化, 在防御基因附近表现
出甲基化水平降低。
甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术是目前用
于检测植物 DNA 甲基化的主要方法之一[19], 该技
术是在扩增片段长度多态性(AFLP)技术的基础上建
立的。采用对甲基化敏感的同裂酶 Hpa II和 Msp I
分别与 EcoR I 组合切割基因组 DNA。由于 Hpa II
和 Msp I能够识别相同的序列(5-CCGG-3), 但对甲
基化的敏感性不同, 因此能够通过切割产生的片段
反映出DNA序列中胞嘧啶的甲基化水平和状态, 能
够在全基因组范围内进行甲基化位点的扫描, 是当
前研究 DNA甲基化水平和模式的重要方法之一[20-24]。
高效液相色谱 (HPLC)方法主要是通过核酸酶将
DNA 降解为单个核苷酸后进行定量分析, 该方法能
够获得基因组胞嘧啶总体甲基化的程度[25]。本研究
利用 MSAP 结合 HPLC 技术, 通过分析茶树在自然
冷驯化过程中不同阶段叶片的 DNA 甲基化水平及
模式变化, 研究冷驯化诱导茶树抗寒性过程中 DNA
甲基化与茶树抗寒性之间的关系, 探讨DNA甲基化
参与茶树低温胁迫响应的可能分子机制, 以期为茶
树性状改良以及抗逆性提高等方面提供一定理论
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验材料为种植于中国农业科学院茶叶研究所
国家茶树改良中心的20年生特早生国家级茶树品种
龙井43。采用 TIANGEN 植物基因组快速提取试剂
盒提取茶树基因组 DNA。MSAP酶切所用到的 EcoR
I、Hpa II和 Msp I以及 HPLC酶解所用到的碱性磷
酸酶均购自 TaKaRa公司。HPLC分析所用的 C18色
谱柱(Supelcosil LC-18S)、标准品以及酶解所用的核
酸酶购自 Sigma 公司。聚丙烯酰胺凝胶配制所用的
尿素、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵
(APS)、丙烯酰胺以及 N,N’-亚双甲基丙烯酰胺均购
于生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 电导率测定
参照杨亚军等[3]的方法, 从 2013年 11月 2日开
始, 根据外界气温变化情况, 从 10 株茶树上采摘成
熟度一致的成熟、完整、无病虫害的茶树叶片, 混
合后分成 2 份, 一份用于电导率测定, 一份液氮速
冻后于–80℃保存备用。根据电导率测定结果, 选取
11月 2日(驯化前)、12月 19日(驯化后)和 2014年 2
月 20日(脱驯化) 3个时期的样品作为研究对象。
1.3 基因组 DNA提取
采用植物基因组快速提取试剂盒(TIANGEN)提
取茶树基因组 DNA, 采用 NanoDrop ND-2000 微量
核酸蛋白测定仪(Pittsburgh, PA, USA)测定 DNA 浓
度和纯度, 并用 1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,
于–20℃冰箱中保存备用。
1.4 DNA甲基化的 MSAP分析
参照 Zhao 等[26]的方法稍作修改进行 MSAP 分
析。采用双酶切组合 EcoR I/ Hpa II和 EcoR I/Msp I
第 7期 周艳华等: 冷驯化不同阶段茶树 DNA甲基化模式的变化 1049


进行酶切, 接头和扩增引物序列见表 1。取 700 ng
DNA用 2 U EcoR I在 37℃下酶切 3 h后 65℃灭活
30 min; 分别用 0.5 U Hpa II和 Msp I在 37℃下酶切
4 h后 80℃灭活 30 min; 将酶切产物用 5 pmol EcoR I
接头和 50 pmol Hpa II-Msp I接头, 1 U T4连接酶在
22℃连接 3 h后于 65℃灭活 10 min。取连接产物 4 μL
进行预扩增反应, 预扩增反应体系 20 μL, 包括连接
产物 4 μL, 10×PCR buffer 2 μL, 10 mmol L–1 dNTPs
1.5 μL, MgCl2 1.2 μL, 预扩增引物 E+A和 HM+T各
1 μL, 2.5 U rTaq酶。以 94℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 3
min, 循环 35次。将预扩增产物稀释 10倍后进行选
择性扩增, 除引物为选择性扩增引物外, 反应体系
同预扩增体系。PCR程序为 94℃ 30 s, 65℃ (每个
循环下降 0.7℃) 30 s, 72℃ 1 min, 共 13个循环; 接
着 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共 30个循环。
将选择性扩增产物变性后进行变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳, 分离后经银染显色, 拍照保存。统计扩增条带,
分别用 1和 0代表扩增条带的有无。
1.5 DNA甲基化水平和模式变化分析
参考潘雅姣等[15]的方法分析 DNA 甲基化水平
和模式变化。根据 Hpa II和 Msp I能够识别并切割
没有甲基化的 5-CCGG-3序列, 但却对胞嘧啶的不
同甲基化状态敏感性不同的特性, 分析酶切片段能
够反映酶切位点的甲基化状态以及基因组的甲基化
程度。Hpa II 能够切割单链内部或外部甲基化的胞
嘧啶, 对全甲基化不敏感; 而Msp I能够切割内部全
甲基化的胞嘧啶, 而对外部全甲基化的胞嘧啶不敏
感。Hpa II和 Msp I酶切产物的扩增条带有 4种类型,
当两条泳道均有带时记为类型 I, 表示没有发生甲
基化; 当 Hpa II有带而 Msp I无带时记为类型 II, 表
示单链 DNA发生外部甲基化; 当 Hpa II无带而Msp
I有带时记为类型 III, 表示双链 DNA发生内部甲基
化; 当 2 条泳道均无带时记为类型 IV, 表示双链
DNA发生外部甲基化。

表 1 MSAP所用的接头和引物序列
Table 1 Adapter and primer sequences for MSAP
序列 Sequence (5–3) 接头与引物
Adapter and primer EcoR I Hpa II/ Msp I
接头 Adapter CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTCTAC
GACGATGAGTCTAGAA
CGTTCTAGACTCATC
预扩增引物 Pre-amplification primer GTAGACTGCGTACCAATTCA (E+A) GATGAGTCTAGAACGGT (HM+T)
GTAGACTGCGTACCAATTCAGG (E+AGG) GATGAGTCTAGAACGGTAC (HM+TAC)
GTAGACTGCGTACCAATTCACA (E+ACA) GATGAGTCTAGAACGGTGG (HM+TGG)
GTAGACTGCGTACCAATTCACG (E+ACG) GATGAGTCTAGAACGGTCA (HM+TCA)
GTAGACTGCGTACCAATTCACT (E+ACT) GATGAGTCTAGAACGGTCG (HM+TCG)
GTAGACTGCGTACCAATTCATC (E+ATC) GATGAGTCTAGAACGGTCC (HM+TCC)
GATGAGTCTAGAACGGTCT (HM+TCT)
GATGAGTCTAGAACGGTTA (HM+TTA)
GATGAGTCTAGAACGGTTG (HM+TTG)
GATGAGTCTAGAACGGTTC (HM+TTC)
选择性扩增引物
Selective-amplification primer
GATGAGTCTAGAACGGTTT (HM+TTT)
E: EcoR I接头; HM: Hpa II/Msp I接头。E: EcoR I adapter; HM: Hpa II/Msp I adapter.

1.6 DNA甲基化的高效液相色谱(HPLC)分析
参照 Chakrabarty 等[27]报道的方法稍作修改进行
HPLC分析。取约 20 μg DNA, 用 ddH2O稀释后, 加入
5 U核酸酶 P1 (Sigma)和 0.595 U碱性磷酸酶(TaKaRa),
最后用酶解消化液(30 mmol L–1 NaCH3CO2, 0.1 mmol
L–1 ZnCl2, pH 5.3)补足到 200 μL。水解反应于 37℃进
行 3 h后, 加入 490 μL无水乙醇终止反应。11 000 × g
离心 15 min后, 将上清液转移至新的离心管中, 冷冻
干燥后用 1 mL ddH2O溶解并过 0.45 μm滤膜后进行
HPLC 分析。HPLC 在 C18 色谱柱上进行; 缓冲液为
50 mmol L–1 KH2PO4, pH 3.5; 流速为 0.8 mL min–1; 检
测波长为 285 nm; 时间为 30 min。5mdC(%) = 100×
[5mdC]/([5mdC]+[dC]), 式中[dC]和[5mdC]分别是 2种
形式 dC的含量, 数值由标准曲线计算得出。
1050 作 物 学 报 第 41卷


2 结果与分析
2.1 MSAP分析
2.1.1 不同冷驯化阶段茶树 DNA 甲基化水平变化
共筛选出 50 对能够稳定扩增的选择性扩增引物
对冷驯化过程中 3 个时期的茶树叶片进行 MSAP 分

析, 共扩增出 1789 条带, 每对引物组合扩增出的条带
数为 19~43条, 平均为 36条。3个时期样品各扩增的甲
基化条带数分别为 905、968 和 970, 甲基化比率为
50.6%、54.1%和 54.2%, 全甲基化条带数为 478、471
和 475, 全甲基化比率为 26.7%、26.3%和 26.6% (表 2)。

表 2 不同时期茶树 DNA甲基化水平变化
Table 2 Changes of DNA methylation level during different periods in tea plant
日期 Date (month/day) MSAP扩增条带类型
Types of MSAP bands 11/2 12/19 2/20
I 884 821 819
II 427 497 495
III 450 469 471
IV 28 2 4
扩增条带总数 Total amplified bands 1789 1789 1789
甲基化条带总数 Total methylated bands 905 968 970
甲基化条带比率 MASP (%) 50.6 54.1 54.2
全甲基化条带总数 Full methylated bands 478 471 475
全甲基化条带百分比 Full methylation ratio (%) 26.7 26.3 26.6

由表 2 可知, 茶树叶片冷驯化后的样品(12.19)
DNA 甲基化水平 (MSAP%)与对照相比升高 , 由
50.6%增加到 54.1%。而在脱驯化(2.20)后, 甲基化水
平与冷驯化样品大致相当, 并没有明显变化。上述
结果表明低温胁迫能够引起茶树 DNA 甲基化水平
的改变。全甲基化百分比在整个冷驯化过程中表现
出先减后增的趋势, 在低温胁迫时期(冷驯化后)全
甲基化水平最低, 说明甲基化水平升高的同时发生
了一定程度的去甲基化现象, 但是相对于 MSAP%
来说, 变化不明显。
2.1.2 低温胁迫过程中甲基化状态变化情况 甲
基化状态的变化主要是指甲基化带型的多态性变化,
即低温胁迫前后的甲基化模式发生改变。将统计的
多态性带型分为 2种类型, A类为去甲基化带型, 表
明冷驯化后, 低温胁迫诱导茶树基因组DNA甲基化
水平降低, 其中 A1、A2、A3为完全去甲基化, 即所
有被甲基化的胞嘧啶均发生去甲基化, A4、A5为部
分去甲基化, 即部分被甲基化的胞嘧啶发生去甲基
化; B类为甲基化带型, 表明低温胁迫导致茶树基因
组 DNA甲基化水平升高, 其中 B1、B2为重新甲基
化, 即胁迫前没有甲基化, 胁迫后出现甲基化位点,
B3 为超甲基化, 即在胁迫前甲基化位点的基础上,
胁迫后又有新的位点被甲基化(图 1)。
由表 3 可以看出, 以冷驯化前样品作为对照,
冷驯化后样品(低温胁迫时)和脱驯化样品所扩增出
的多态性条带数占扩增条带总数的百分比分别为
5.4%和 5.6%, 在扩增的多态性条带中 A型条带所占
百分比为 33%和 32%, B型条带占多态性条带总数百
分比为 67%和 68%。上述结果表明, 冷驯化以后, 茶
树基因组DNA同时发生甲基化和去甲基化, 但甲基
化水平明显高于去甲基化, 因此, 冷驯化提高了茶
树基因组 DNA的甲基化水平。
2.2 HPLC分析
根据 5种标准品的含量及峰面积(图 2), 获得各
标准品所对应的标准曲线(表 4)。各标准曲线的决定
系数(R2)均大于 0.999, 且标准品的出峰时间都有间
隔, 保证各标准品均能有效分开。
根据样品中胞嘧啶 C和 5-甲基胞嘧啶 5mC的
峰面积(图 3), 通过所对应的标准曲线求得各自的
含量 , 得到不同时期的 5-甲基胞嘧啶百分含量。冷
驯化前后不同时期的样品 5-甲基胞嘧啶的百分含
量在 49%~51%之间 , 其中在低温胁迫前 (未驯化
样品)甲基化胞嘧啶含量最低 , 而驯化后及脱驯化
样品的甲基化程度较对照升高 , 与 MSAP 的结果
一致(图 4)。HPLC 的结果证实了 MSAP 结果的可
靠性。
第 7期 周艳华等: 冷驯化不同阶段茶树 DNA甲基化模式的变化 1051



图 1 不同冷驯化阶段 MSAP扩增图谱
Fig. 1 MSAP patterns at different cold acclimation periods
H和 M分别表示 EcoR I/ Hpa II和 EcoR I/ Msp I酶切。A、B所示带型见表 3。
H and M indicate the enzyme combinations of EcoR I/ Hpa II and EcoR I/ Msp I. Banding patterns of A and B are reffered to Table 3.

表 3 低温胁迫过程中 DNA甲基化状态变化情况
Table 3 Variation of DNA mathylation pattern during cold acclimation
带型 Type
对照 CK 胁迫 Stress
甲基化状态 Methylation state (5–3) 日期 Date (month/day) 类型
Class
H M H M 对照 CK 胁迫 Stress 12/19 2/20
A1 0 0 1 1 CCGGGGCC CCGGGGCC 2 2
A2 1 0 1 1 CCGGGGCC CCGGGGCC 2 2
A3 0 1 1 1 CCGGGGCC CCGGGGCC 2 2
A4 0 0 1 0 CCGGGGCC CCGGGGCC 10 10
A5 0 0 0 1 CCGGGGCC CCGGGGCC 16 16
B1 1 1 0 1 CCGGGGCC CCGGGGCC 4 7
B2 1 1 0 0 CCGGGGCC CCGGGGCC 59 57
B3 1 0 0 0 CCGGGGCC CCGG GGCC 2 4
多态性条带总数 Total polymorphic bands 97 100
多态性比例 Polymorphism ratio (%) 5.4 5.6
A型条带占多态性条带总数百分比
Percentage of banding pattern A (%)
33 32
B型条带占多态性条带总数百分比
Percentage of banding pattern B (%)
67 68
H和 M分别表示 EcoR I/ Hpa II和 EcoR I/ Msp I酶切; C: 甲基化胞嘧啶; 1: 有带; 0: 无带。
H and M indicate the enzyme combinations of EcoR I/ Hpa II and EcoR I/ Msp I, respectively; C: methylated cytosine; 1: band present;
0: band absent.
1052 作 物 学 报 第 41卷



图 2 标准品液相色谱图
Fig. 2 Chromatogram of standards

表 4 各标准品的保留时间和标准曲线
Table 4 The retention time and standard curve of each standard nucleoside
核苷
Nucleoside
保留时间
Retention time (min)
标准曲线
Standard curve
决定系数
R²
2-脱氧胞苷 dC 5.409±0.013 y = 3E–07x + 0.0403 1
5-甲基胞嘧啶 5mdC 6.275±0.015 y = 3E–07x + 0.0412 1
2-脱氧鸟苷 dG 12.288±0.048 y = 6E–07x + 0.0422 1
2-脱氧胸苷 dT 15.259±0.064 y = 8E–07x + 0.0435 1
2-脱氧腺苷 dA 19.248±0.054 y = 3E–06x + 0.0593 0.9993
y: 峰面积; x: 含量; R2: 决定系数。y: area; x: content; R2: decision coefficient.

图 3 12月 19日样品的液相色谱图
Fig. 3 Chromatogram of tea plant sample at Sept. 19

3 讨论
高等植物的 DNA 甲基化比例因植物种类和组
织而异, 不同植物之间存在较大差异, 以低于 50%
为多[15, 28-29]。本试验中利用 MSAP技术和 HPLC技
术相结合, 首次检测了茶树的 DNA 甲基化水平, 超
过 49%, 高于水稻[15]、拟南芥[30](35%~43%)、棉花[29]
(41%)等所报道的 DNA 甲基化水平, 而与牡丹[31]、
黑麦[32]等基因组甲基化水平接近, 反映了不同物种
基因组间 DNA甲基化水平存在差异。低温是影响植
第 7期 周艳华等: 冷驯化不同阶段茶树 DNA甲基化模式的变化 1053



图 4 以高效液相色谱法检测不同时期 5mC百分率的结果
Fig. 4 HPLC result of 5mC% at different stages

物生长和分布范围的重要环境因素, 研究表明, 植
物的抗寒性是在一段时间的低温驯化基础上获得的,
这种抗寒性与植物本身的遗传性相关, 在低温驯化
过程中某些与抗寒相关的基因发生变化从而对低温
做出响应[33], 目前已在拟南芥[34]、小麦[35]等多个物
种中得到证实, 茶树上也通过转录组测序等技术分
离出一大批与冷驯化相关的基因, 这些基因在经过
冷驯化后上调或下调表达[5]。基因表达的改变, 涉及
许多调控机制, 其中DNA甲基化是一个调控基因功
能的重要手段[29]。近年来已有许多关于低温胁迫与
DNA甲基化的研究报道, 但不同物种的研究结果有
一定差异, 表现出物种(品种)、组织等的特异性。
Burn等 [36]发现, 低温处理后, 拟南芥的甲基化程度
降低, 而Zhang等[37]则发现, 草莓在低温诱导休眠过
程中, 甲基化程度表现出明显的上升趋势。Pan等[38]
对低温胁迫下水稻基因组DNA甲基化研究发现, 处
于苗期的耐寒品种LTH只在根部检测到甲基化的明
显升高, 而在圆锥花序则发生去甲基化; 处于孕穗
期的低温敏感品种IR64, 低温胁迫后在叶片中表现
出甲基化水平升高, 而圆锥花序则出现去甲基化。
Mayer等[39]发现 4个品种大麻在经过低温驯化后, 甲
基化水平都表现出不同程度的提高, 但 2 个品种恢
复到未驯化的水平, 1个品种仍然保持较高的甲基化
水平, 另外 1个品种的甲基化程度较对照降低, 表现
出明显的品种特异性。本研究利用MSAP技术分析发
现, 与对照(未驯化样品)相比, 冷驯化样品和脱驯化
样品其基因组DNA同时发生甲基化和去甲基化, 但
总体呈现甲基化水平增加趋势, 与Mayer等[39]的研究
结果类似。这些甲基化或去甲基化位点可能参与冷
驯化过程相关表达基因的调控, 从而参与冷驯化诱
导茶树抗寒性的提高[5]。HPLC检测到的结果也证实
了MSAP结果的可靠性。这些结果说明DNA甲基化
与茶树的抗寒性密切相关。
DNA 甲基化作为一种可遗传的遗传变异, 对基
因的表达具有调控作用, 这种调控作用又可以在世
代间稳定遗传。通过分析甲基化的作用位点序列信
息, 可以鉴定出相关基因参与某种生命活动的可能
功能, 从而为植物育种服务[40]。本研究发现了茶树
在冷驯化过程中, 其DNA甲基化水平和模式都发生
了变化, 证明DNA甲基化与茶树冷驯化诱导抗寒性
有一定的关系。但是这种关系还需要结合具体基因
的表达情况以及特定基因位点的甲基化变化情况 ,
才能得出更准确的结论。因此, 后续还需要对分离
到的差异片段进行测序与功能验证, 为从表观遗传
学方面揭示茶树冷驯化诱导抗寒性的机制提供参考,
也可以利用这些基因的信息, 开发抗寒相关的分子
标记, 用于茶树抗寒育种的早期鉴定。
4 结论
茶树在冷驯化的不同时期, 其基因组 DNA 同
时发生甲基化或去甲基化, 并以甲基化为主。与冷
驯化前相比, 茶树在驯化后 DNA 甲基化水平明显
增加, 脱驯化阶段则维持较高的甲基化水平, 表明
DNA 甲基化与茶树冷驯化诱导抗寒性之间的确存
在密切关系。
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