全 文 ：收稿日期:2014-07-04
基金项目:中国药典 2015版一部标准研究项目(Z18) ;湖湘青年科技创新创业平台人才项目(2013) ;湖南省十二五重点学科药学学科资助
作者简介:李洪权(1989-) ，男，在读硕士研究生，专业方向:中药药效物质基础及其质量标准化研究;E-mail:lihongquan33@ 163. com。
* 通讯作者:林丽美，0731-88458230，E-mail:lizasmile@ 163. com。
水线草 UPLC指纹图谱的建立及应用
李洪权，曹 艺，柏玉冰，夏伯候，林丽美* ，廖端芳
(湖南中医药大学 /湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心 /中药有毒物质防控技术湖南省
工程实验室，湖南 长沙 410208)
摘要 目的:建立不同产地水线草的超高效液相色谱法(UPLC)指纹图谱，并对其混淆品白花蛇舌草进行鉴别
应用。方法:采用 UPLC法，色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm) ，以甲醇-1%冰醋酸梯度
洗脱，柱温 30 ℃，流速 0. 2 mL /min，检测波长 254 nm。指纹图谱采用相似度分析和主成分分析。结果:建立了水线
草药材的专属性指纹图谱，确定了 15 个共有峰。各产地水线草药材指纹图谱相似度均超过 0. 85。结论:该指纹图
谱重复性好，简便可靠，可用于水线草药材的专属性鉴别，有效区别水线草及其混淆品白花蛇舌草。
关键词 水线草;白花蛇舌草;UPLC指纹图谱;相似度评价;聚类分析;主成分分析
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)04-0735-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 04. 020
UPLC Fingerprint of Oldenlandia corymbosa
LI Hong-quan，CAO Yi，BAI Yu-bing，XIA Bo-hou，LIN Li-mei，LIAO Duan-fang
(Hunan University of Chinese Medicine /Hunan Engineering Center for Ｒapid Test and Ｒemoval of Toxic and Harmful Substances in
Chinese Medicine /Hunan Engineering Laboratory for Prevention and Control Technology of Toxic Substances in Chinese Medicine，
Changsha 410208，China)
Abstract Objective:To establish the UPLC fingerprint of Oldenlandia corymbosa from different regions and to distinguish it from
Oldenlandia diffusa. Methods:UPLC procedure was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm)column
and eluted with a mobile phase consisted of methanol-1% acetic acid at a flow rate of 0. 2 mL /min. The column temperature was 30 ℃
. The detection wavelength was 254 nm. A matrix was constructed for similarity evaluation，cluster analysis and principle component a-
nalysis. Ｒesults:The collected samples had a good similarity. A specificity fingerprint chromatogram was produced and 15 common peaks
were designated. Samples were divided into four groups. Conclusion:It is a reliable and available method for specific identification of
Oldenlandia corymbosa and for distinguishing Oldenlandia corymbosa and Oldenlandia diffusa.
Key words Oldenlandia corymbosa L.;Oldenlandia diffusa (Willd.)Ｒoxb.;UPLC fingerprint;Similarity evaluation;Cluster a-
nalysis;Principle component analysis
水线草为茜草科耳草属植物水线草 Oldenlandia
corymbosa L. 的干燥全草。气微，味微苦，具有清热
解毒之功效，主治疟疾、肠痈、肿毒、烫伤等病
症〔1，2〕。现代药理学研究表明，水线草能抗皮下植
入肿瘤，显著促进白细胞放射性损伤后的复原，并且
对体外培养的人肿瘤细胞增殖有抑制作用〔3〕。水
线草与白花蛇舌草 Oldenlandia diffusa (Willd. )
Ｒoxb. 外部形态极为相似，难以辨认，导致市场和临
床上常出现两种药材混淆使用的现象〔4〕。目前，水
线草药材仅被收录于《广东省中药材标准》〔1〕。本
课题组采用 UPLC 方法，建立不同产地水线草的指
纹图谱，并对其混淆品白花蛇舌草进行鉴别应用，以
期为实现水线草药材质量的整体控制奠定基础。
1 材料
1. 1 药材 14 份不同产地的水线草及 8 份湖南长
沙市场上购买的白花蛇舌草药材均由湖南中医药大
学药学院药用植物教研室刘塔斯教授和中药鉴定教
研室龚力民副教授共同鉴定为茜草科耳草属植物水
线草 Oldenlandia corymbosa L．的干燥全草和茜草科
耳草属植物白花蛇舌草 Oldenlandia diffusa (Willd．)
Ｒoxb．的干燥全草，具体信息见表 1、2。
1. 2 仪器与试剂 SK3300H 型超声波清洗器(上
海科导超声仪器有限公司) ;T-214 型电子分析天平
(Denver 公司) ;Waters Acquity UPLC H-Class 超高
效液相色谱系统，Empower 工作站，含四元梯度泵、
自动进样器、紫外检测器(Waters 公司)。甲醇(色
谱纯，TEDIA公司) ;冰醋酸(色谱纯，天津市化学试
剂研究所) ;水为怡宝纯净水。
·537·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 4 期 2015 年 4 月
鸡矢藤苷甲酯对照品为实验室自制，质量分数
为 98. 6%。
表 1 水线草药材来源
样品编号 采集地点 采集时间
S1 云南丽江玉龙县 2013-08-25
S2 云南临沧凤庆县 2013-09-13
S3 云南临沧孟定县 2013-09-15
S4 云南临沧双江县 2013-09-12
S5 云南丽江永胜县 2013-08-20
S6 广东云浮新兴县 2013-07-25
S7 广东云浮云安县 2013-07-17
S8 广西玉林北流市 2013-08-11
S9 广西玉林博白县 2013-08-07
S10 广东云浮罗定市 2013-07-28
S11 广东中山五桂山镇 2012-12-18
S12 广东广州市天河区 2013-01-01
S13 广东广州顺德区 2012-11-29
S14 广西玉林市贵港 2013-08-05
表 2 白花蛇舌草药材来源
样品编号 来源 购买时间
S1 养天和大药房 2013-06
S2 药海堂大药房 2013-06
S3 湖南中医附一药房 2013-06
S4 菁苹果大药房 2013-06
S5 老百姓大药房 2013-06
S6 顺康大药房 2013-06
S7 九芝堂大药房 2013-06
S8 益丰大药房 2013-06
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm
×2. 1 mm，1. 7 μm)色谱柱，以甲醇(A)-1%冰醋酸
(B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序见表 3;检测
波长:254 nm;流速:0. 2 mL /min;柱温:30 ℃;进样
量:2 μL。
表 3 梯度洗脱程序
时间 /min A /% B /%
0 2 98
23 20 80
30 26 74
35 26 74
60 50 50
2. 2 对照品溶液的制备 取鸡矢藤苷甲酯对照品
约 10 mg，精密称定，置 10 mL 量瓶中，加 70%甲醇
适量，稀释至刻度，摇匀，即得。
2. 3 供试品溶液的制备 精密称取样品细粉 1. 0
g，置 100 mL 具塞锥形瓶中，准确加入 70%甲醇 15
mL，称定重量，超声(160 W，59 kHz)提取 45 min，取
出放冷至室温，加 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，
滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度试验:取同一水线草样品供试品溶
液，按“2. 1”项下色谱条件连续进样 6 次，记录色谱
图。以 4 号峰为参照峰，计算 15 个共有峰的相对保
留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间的
ＲSD在 0. 04% ～ 0. 20%之间，相对峰面积的 ＲSD 在
0. 6% ～4. 0%之间。结果表明仪器精密度良好。
2. 4. 2 重复性试验:取同一批水线草药材 6 份，按
“2. 3”项下方法制备供试品溶液，记录色谱图。考
察样品中 15 个共有峰的相对保留时间和相对峰面
积。各共有峰相对保留时间的 ＲSD 在 0. 10% ～
0. 69%之间，相对峰面积的 ＲSD在 1. 8% ～ 4. 7%之
间。结果表明方法重复性良好。
2. 4. 3 稳定性试验:取同一水线草样品供试品溶
液，分别于 0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，以各共有
峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。各共有
峰相对保留时间的 ＲSD在 0. 09% ～0. 50%之间，相
对峰面积的 ＲSD 在 1. 7% ～ 4. 5%之间。结果表明
供试品溶液在 24 h内稳定性良好。
2. 5 样品测定 取水线草药材样品 14 批及白花
蛇舌草药材样品 8 批，按“2. 3”项下方法制备供试
品溶液，“2. 1”项下色谱条件测定，并比较 5 批水线
草和 8 批白花蛇舌草 UPLC 指纹图谱(见图 1，自下
而上:水线草样品 1 ～ 5 及白花蛇舌草样品 1 ～ 8)。
2. 6 指纹图谱的建立
2. 6. 1 水线草 UPLC对照指纹图谱的建立:取对照
品和水线草药材样品 14 批，按“2. 3”项下方法制备
供试品溶液，“2. 1”项下色谱条件进行测定，记录
UPLC图，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系
统”(2. 0 版)进行分析，得到 14 批水线草样品的
UPLC对照指纹图谱，共有 15 个共有峰，见图 2。其
中以 4 号峰鸡矢藤苷甲酯为参照峰(S) ，其余各共
有峰与 4 号峰的相对峰面积见表 4。鸡矢藤苷甲酯
对照品溶液的 UPLC图见图 3。
2. 6. 2 指纹图谱的相似度评价:14 批水线草样品
相似度的计算结果依次为 0. 977、0. 906、0. 905、
0. 954、0. 918、0. 944、0. 909、0. 867、0. 924、0. 941、
0. 958、0. 884、0. 853、0. 789，除 8、12、13 和 14 号水
线草样品的相似度低于 0. 9 之外，其余 11 批样品相
似度均大于 0. 9，表明总体上水线草各批次相似性
较好。
·637· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 4 期 2015 年 4 月
图 1 5 批水线草及 8 批白花蛇舌草样品的 UPLC指纹图谱
图 2 水线草样品的 UPLC指纹图谱及对照指纹图谱(示共有峰)
图 3 鸡矢藤苷甲酯对照品 UPLC图
2. 7 主成分分析 以水线草和白花蛇舌草每个批
次药材主要色谱峰的峰面积为指标，采用 MATLAB
7. 0 数据分析软件，对 14 批水线草和 8 批白花蛇舌
草样品进行主成分分析。图 4 为 14 批水线草和 8
批白花蛇舌草样品的散点图，其中水线草样品(S1
～ S14)集中分布于图的右侧，白花蛇舌草样品(S1
～ S8)集中分布于图的左侧，与聚类分析的分类结
果一致。
主成分个数提取原则为主成分的特征值大于 1
的前 n个主成分。由表 5 可知，从特征值大小来看，
λ1 = 7. 7975，λ2 = 4. 0282，λ3 = 1. 2807，λ4 = 1. 0185，其
他的小于 1;从贡献率来看，λ1 的贡献率为
51. 98%，λ2 的贡献率为 26. 85%，λ3 的贡献率为
8. 54%，λ4 的贡献率为 6. 79%，4 个特征值主成分
累计贡献率为 94. 16%，基本可以表征原始因子代
表的全部信息。
3 讨论
基于上述优化后的提取工艺和检测条件，对水
线草进行指纹图谱研究，14 批水线草药材的指纹图
谱相似度大多数达 0. 85 以上，由此表明水线草的质
量具有一定的稳定性。同时，将此条件检测白花蛇
舌草，发现 15 个共有峰构成水线草特征性的指纹图
谱与白花蛇舌草存在明显主峰差异，说明此特征指
纹图谱可以明显区分水线草和白花蛇舌草。因此，
·737·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 4 期 2015 年 4 月
表 4 水线草 UPLC指纹图谱共有峰相对峰面积
峰号
样品编号
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14
1 2. 10 0. 42 0. 51 0. 30 0. 46 1. 77 0. 42 0. 95 2. 27 0. 32 3. 11 0. 93 0. 93 0. 96
2 2. 60 0. 58 0. 90 0. 72 0. 55 2. 16 0. 83 1. 26 2. 45 0. 62 1. 25 1. 35 1. 34 1. 36
3 0. 29 0. 26 0. 39 0. 22 1. 31 1. 76 0. 27 0. 82 2. 79 0. 20 3. 37 0. 91 0. 88 0. 86
4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
5 1. 28 0. 38 0. 30 0. 17 0. 12 0. 76 0. 32 0. 39 0. 92 0. 26 0. 50 0. 42 0. 42 0. 40
7 3. 83 0. 59 0. 83 0. 42 0. 14 1. 76 0. 50 0. 86 1. 96 0. 41 1. 90 0. 93 0. 92 0. 96
8 3. 99 0. 20 0. 46 0. 22 0. 08 0. 90 0. 19 0. 47 0. 99 0. 15 1. 26 0. 52 0. 50 0. 52
9 11. 00 2. 36 3. 26 1. 90 0. 59 6. 04 1. 96 2. 93 7. 52 1. 48 8. 00 3. 12 3. 12 3. 06
10 10. 60 2. 98 3. 34 2. 20 1. 23 5. 41 2. 61 2. 97 5. 74 2. 09 6. 35 3. 12 2. 86 3. 06
11 7. 71 1. 83 4. 25 2. 67 0. 19 3. 36 1. 53 1. 56 2. 81 1. 11 2. 97 1. 65 1. 65 1. 60
12 5. 34 0. 48 1. 78 0. 29 0. 29 1. 10 0. 45 0. 72 1. 40 0. 43 2. 25 0. 78 0. 79 0. 76
13 2. 67 0. 54 1. 37 1. 03 0. 21 1. 41 0. 52 0. 77 0. 55 0. 38 1. 22 0. 67 0. 27 0. 25
14 2. 28 0. 44 1. 10 0. 73 0. 07 1. 10 0. 36 0. 64 0. 97 0. 25 0. 85 0. 44 0. 67 0. 67
15 2. 08 0. 33 0. 63 0. 69 0. 30 0. 53 0. 29 0. 54 0. 44 0. 25 1. 24 0. 57 0. 57 0. 28
图 4 水线草和白花蛇舌草药材样品的主成分分析图
注:1 ～ 14 分别代表 14 批水线草药材样品;15 ～ 22 分别
代表 8 批白花蛇舌草药材样品
本实验所建立的水线草指纹图谱可作为该药材的特
征指纹图谱，所建立的方法重复性好，专属性强，可
以作为水线草的鉴别方法，用于水线草药材质量评
价研究。
表 5 主成分分析数据
主成分 特征值 贡献率 /% 累计贡献率 /%
1 7. 7975 51. 98 51. 98
2 4. 0282 26. 85 78. 83
3 1. 2807 8. 54 87. 37
4 1. 0185 6. 79 94. 16
从主成分分析的结果来看，水线草药材与白花
蛇舌草药材明显分为两类，表明两者具有明显的差
异性;同时，14 批水线草的分析结果显示，不同产地
采集的水线草样品显示出良好的一致性。
参 考 文 献
［1］广东省食品药品监督管理局 . 广东省中药材标准［S］．
第一册 . 广州:广东科技出版社，2011:60.
［2］江苏新医学院 . 中药大辞典［M］．上册 . 上海:上海人
民出版社，1977:535.
［3］ Takagi S，Yamaki M，Masuda K，et al. Studies on the herb
medical materials used for some tumors.Ⅱ. On the constit-
uents of Hedyotis corymbosa Lam［J］． Yakugaku Zasshi，
1981，101 (7) :657-659.
［4］范榕，谢敏 . 白花蛇舌草与伞房花耳草的鉴别［J］． 海
峡药学，1995，7 (1) :77-78.
·837· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 4 期 2015 年 4 月