全 文 ：［收稿日期］ 20140725(008)
［基金项目］ 山东省中医药科技计划项目(2013-082)
［通讯作者］ * 谷民举，硕士，主管中药师，从事中药制剂工艺及质量标准研究，Tel:0531-68617982，E-mail:1056288707@ qq． com
星点设计-效应面法优化荆芥穗黄酮类成分的提取工艺
谷民举* ，鞠建峰，朱宗敏
(山东中医药大学 附属医院，济南 250011)
［摘要］ 目的:优选荆芥穗黄酮类成分的提取工艺，为该药材的资源开发提供参考。方法:选择乙醇体积分数、提取时间
及乙醇用量为自变量，橙皮苷、木犀草素、芹菜素提取量的总评“归一值”为因变量，通过星点试验优选提取工艺，运用 Design-
Expert 8. 0 软件对自变量各水平进行多元线性回归和二项式拟合，利用效应面法优选提取工艺并进行预测分析。采用 HPLC
测定橙皮苷、木犀草素、芹菜素含量，流动相乙腈(A)-0. 4%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0 ～ 20 min，5% ～ 20% A;20 ～ 50 min，
20% ～ 30%;50 ～ 60 min，30% ～5%A)，检测波长 283 nm。结果:最佳提取工艺为加 15 倍量 73%乙醇回流提取 2 次，每次 2 h;
橙皮苷、木犀草素、芹菜素提取量分别为 3. 991，1. 307，0. 589 mg·g －1，总评“归一值”0. 925 3，与预测值的偏差 － 2. 14%。结
论:优选的提取工艺简单易行、准确度高，适用于荆芥穗总黄酮的工业化生产。
［关键词］ 荆芥穗;总黄酮;橙皮苷;木犀草素;芹菜素
［中图分类号］ Ｒ283. 6;Ｒ284. 1;Ｒ284. 2 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)08-0029-05
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015080029
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20150225． 1607． 005． html
［网络出版时间］ 2015-02-25 16:07
Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Schizonepetae Spica by Central Composite Design-
response Surface Methodology GU Min-ju* ，JU Jian-feng，ZHU Zong-min (Affiliated Hospital of Shandong
University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extraction process of flavonoids from Schizonepetae Spica and
provide a reference for development of this medicinal herb． Method:Ethanol concentration， the amount of
ethanol and extraction time were selected as independent variables，overall desirability of extracting amounts of
hesperidin，luteolin and apigenin as dependeng variable，data of overall desirabilities were fitted to a second-order
polynomial equation and regressed by multiple linear，response surface methodology was used to optimize extraction
technology and predictive analyze． HPLC was adopted to determine contents of hesperidin，luteolin and apigenin
with mobile phase of acetonitrile-0. 4% phosphoric acid solution for gradient elution and detection wavelength of
283 nm． Ｒesult:Optimal extraction technology was as following:extracted 2 times with 15-fold the amount of
73% ethanol for 2 h per time;extracting amounts of hesperidin， luteolin and apigenin were 3. 991，1. 307，
0. 589 mg·g －1，respectively． Overall desirability was 0. 925 3，whose deviation was － 2. 14% by comparing with
the predictive value． Conclusion:This optimized extraction technology is convenient，accurate and suitable for
industrial production of total flavonoids from Schizonepetae Spica．
［Key words］ Schizonepetae Spica;total flavonoids;hesperidin;luteolin;apigenin
荆芥穗功效解表散风、透疹，用于治疗感冒、头
痛、麻疹、疮疡初起等证［1］。目前已从该药材中分
离出了挥发油、单萜苷、黄酮、有机酸、三萜、甾体等
化学成分［2-7］;其黄酮类成分木犀草素、橙皮苷具有
抗炎抑菌抗病毒活性，芹菜素具有解痉、抗胃溃疡作
用。现代药理研究表明荆芥穗具有抗炎、消炎、抑制
肿瘤细胞增殖、抗过敏和抗补体作用［8-10］。荆芥穗
是银翘散的重要组成药物，黄酮类成分是该方主要
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的抗流感病毒有效部位［11-12］。
目前针对荆芥穗挥发油的研究报道较多［13-17］，
关于黄酮类等其他成分的研究并不全面［18-19］。近
年以多指标成分表征中药品质已成为药材质量控制
的主要手段［20］，中药提取工艺的优化亦应以多成分
评价为导向。正交试验或均匀设计法优化中药提取
工艺时，虽具有简便、试验次数较少等优点，但精度
较低。本实验以橙皮苷、木犀草素、芹菜素提取量为
综合评价指标，在单因素试验基础上，采用星点设
计-效应面法优化荆芥穗黄酮类成分提取工艺，为荆
芥穗质量的全面控制提供参考。
1 材料
1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，
AB135-S型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
橙皮苷、木犀草素、芹菜素对照品(中国食品药品检
定研究院，批号分别为 110721-200613，111520-
200504，111901-201102)，甲醇、乙腈和磷酸为色谱
纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。荆芥穗购自
山东中医药大学附属医院，经山东中医药大学生药
系李峰教授鉴定为唇形科植物荆芥 Schizonepeta
tenuisfolia的干燥花穗。
2 方法与结果
2. 1 橙皮苷、木犀草素、芹菜素的含量测定
2. 1. 1 对照品溶液的制备 分别精密称取橙皮苷、
木犀草素、芹菜素对照品 21. 16，11. 26，8. 86 mg，分
别加甲醇溶解并定容至 10 mL 量瓶中，得对照品贮
备液。分别精密吸取各贮备液 1 mL 置于 10 mL 量
瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成 211. 6，112. 6，
88. 6 mg·L －1混合对照品溶液，备用。
2. 1. 2 供试品溶液的制备［18-19］ 精密称取荆芥穗
粗粉(过 40 目筛)约 1 g，加 70%乙醇 20 mL回流提
取 2 次，每次 2 h，合并提取液，置于 100 mL量瓶中，
加 70%乙醇定容至刻度，即得。
2. 1. 3 色谱条件 ZOＲBAX SB-C18色谱柱(4. 6
mm ×250 mm，5 μm) ，流动相乙腈(A)-0. 4%磷酸
溶液(B)梯度洗脱(0 ～ 20 min，5% ～ 20% A;20 ～ 50
min，20% ～30%;50 ～ 60 min，30% ～5%A)，检测波
长 283 nm，柱温 30 ℃，流速 1. 0 mL·min －1，进样量
10 μL。见图 1。
2. 1. 4 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液
适量，加甲醇稀释成系列对照品溶液，按 2. 1. 3 项下
色谱条件测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐
标，得橙皮苷、木犀草素及芹菜素回归方程分别为
Y = 14. 90X － 3. 78(r = 0. 999 8)，Y = 4 220. 52X +
A．对照品;B．供试品;1. 橙皮苷;2. 木犀草素;3. 芹菜素
图 1 荆芥穗 HPLC
Fig． 1 HPLC of Schizonepetae Spica
27. 86(r =0. 999 8) ，Y = 13. 84X － 5. 56(r = 0. 999 6) ，
线性范围依次为 2. 115 ～ 211. 5，1. 124 ～ 112. 4，
0. 884 ～ 88. 4 mg·L －1。
2. 1. 5 精密度试验 精密量取混合对照品溶液
1 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按
2. 1. 3 项下色谱条件连续进样 6 次，结果，橙皮苷、
木犀草素、芹菜素峰面积的 ＲSD 分别为 0. 8%，
1. 0%，0. 9%，表明仪器精密度良好。
2. 1. 6 稳定性试验 精密称定荆芥穗粗粉 1. 0 g，
按 2. 1. 2 项下方法制备供试品溶液，分别于 0，2，4，
8，10，12 h 按 2. 1. 3 项下色谱条件测定，结果橙皮
苷、木犀草素、芹菜素峰面积的 ＲSD 分别为 2. 8%，
1. 7%，1. 3%，表明供试品溶液在 12 h内稳定。
2. 1. 7 重复性试验 取同一样品，按 2. 1. 2 项下方
法平行制备 6 份供试品溶液，按 2. 1. 3 项下色谱条
件测定，计算橙皮苷、木犀草素、芹菜素质量分数分
别为 3. 98，1. 32，0. 56 mg·g －1，ＲSD 依次为 2. 4%，
1. 3%，1. 8%，表明该方法重复性良好。
2. 1. 8 加样回收率试验 分别精密称取同一批荆
芥穗粗粉 0. 5 g，共 6 份，各精密加入 2. 1. 1 项下混
合对照品溶液 5 mL，按 2. 1. 2 项下方法制备供试品
溶液，计算橙皮苷、木犀草素、芹菜素平均加样回收
率分别为 97. 83%，96. 08%，97. 06%，ＲSD 依次为
1. 5%，2. 4%，1. 9%。
2. 2 单因素试验考察 荆芥穗黄酮类成分易溶于
乙醇，故采用乙醇回流法，因提取次数为非连续变
量，回归处理较困难，从节约成本和工业生产的实际
考虑，提取数定为 2 次。
2. 2. 1 乙醇体积分数 准确称取荆芥穗粗粉 5 份，
每份 50 g，加 10 倍量体积分数分别为的 50%，60%，
70%，80%，90%乙醇提取 2 次，每次 120 min，结果
橙皮苷提取量分别为 3. 213，3. 424，3. 988，3. 825，
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3. 673 mg·g －1;木犀草素提取量 1. 189，1. 353，
1. 332，1. 236，1. 201 mg·g －1;芹菜素提取量 0. 478，
0. 521，0. 598，0. 532，0. 482 mg·g －1。
2. 2. 2 提取时间 准确称取荆芥穗粗粉 5 份，每份
50 g，加 10 倍量 70%乙醇提取 2 次，提取时间分别
为 30，60，120，180，240 min。结果橙皮苷提取量分别为
2. 875，3. 213，3. 981，3. 985，3. 988 mg·g －1;木犀草素提取
量 0. 900，1. 204，1. 345，1. 349，1. 355 mg·g －1;芹菜素提
取量 0. 412，0. 528，0. 588，0. 596，0. 590 mg·g －1。
2. 2. 3 乙醇用量 准确称取荆芥穗粗粉 5 份，每份
50 g，分别加 5，10，15，20，25 倍量 70%乙醇回流提
取 2 次，每次 2 h。结果橙皮苷提取量分别为 2. 755，
3. 312，3. 979，3. 981，3. 984 mg·g －1，木犀草素提取量
0. 945，1. 312，1. 345，1. 351，1. 354 mg·g －1;芹菜素提
取量 0. 400，0. 525，0. 586，0. 594，0. 589 mg·g －1。
2. 3 提取工艺优选
2. 3. 1 星点试验设计 在预试验基础上，选取乙醇
体积分数、提取时间和乙醇用量为自变量，以橙皮
苷、木犀草素、芹菜素提取量的总评“归一值”
(overalldesir-ability，OD)为评价指标，根据 Hassan
法［21-22］对各个指标进行归一化处理。各指标计算
公式为 di =(Yi － Ymin)/(Ymax － Ymin)，式中 Yi 为实
测值，Ymin和 Ymax指每一指标在不同次试验中测得的
最小值和最大值。OD =(d1 × d2…… × dn)
1 /n，n 为
指标数。根据中心组合试验设计原理对各因素均设
计 5 个水平，分别用代码值 － 1. 682，－ 1，0，1，1. 682
表示，见表 1。准确称取荆芥穗粗粉 20 份，每份
50 g，根据试验设计方案回流提取，按 2. 1. 3 项下色
谱条件测定，试验安排及结果见表 2。
表 1 荆芥穗总黄酮提取工艺星点试验因素与水平编码
Table 1 Factors-levels coding of central composite test for
extraction process of total flavonoids from Schizonepetae Spica
水平 X1 乙醇体积分数 /% X2 提取时间 /h X3 乙醇用量 /倍
－ 1. 682 50 1 5
－ 1 58. 11 1. 41 9. 05
0 70 2 15
1 81. 89 2. 59 20. 95
1. 682 90 3 25
表 2 荆芥穗总黄酮提取工艺星点试验分析
Table 2 Central composite test analysis of extraction process for total flavonoids from Schizonepetae Spica
No． X1 X2 X3
橙皮苷
/mg·g － 1
木犀草素
/mg·g － 1
芹菜素
/mg·g － 1
OD
1 － 1 － 1 － 1 3. 278 1. 317 0. 518 0. 128
2 1 － 1 － 1 3. 573 1. 299 0. 533 0. 396
3 － 1 1 － 1 3. 316 1. 332 0. 532 0. 282
4 1 1 － 1 3. 647 1. 306 0. 538 0. 483
5 － 1 － 1 1 3. 283 1. 323 0. 520 0. 157
6 1 － 1 1 3. 612 1. 311 0. 534 0. 433
7 － 1 1 1 3. 587 1. 353 0. 524 0. 366
8 1 1 1 3. 721 1. 320 0. 534 0. 489
9 － 1. 682 0 0 3. 213 1. 198 0. 528 0. 000
10 1. 682 0 0 3. 873 1. 287 0. 596 0. 785
11 0 － 1. 682 0 3. 678 1. 195 0. 571 0. 000
12 0 1. 682 0 3. 988 1. 342 0. 584 0. 919
13 0 0 － 1. 682 3. 356 1. 205 0. 516 0. 000
14 0 0 1. 682 3. 977 1. 334 0. 584 0. 898
15 0 0 0 3. 971 1. 337 0. 585 0. 905
16 0 0 0 3. 974 1. 341 0. 582 0. 899
17 0 0 0 3. 969 1. 343 0. 583 0. 907
18 0 0 0 3. 961 1. 339 0. 586 0. 912
19 0 0 0 3. 982 1. 337 0. 583 0. 899
20 0 0 0 3. 981 1. 334 0. 585 0. 901
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2. 3. 2 模型拟合及方差分析 将表 2 中数据用
Design-Expert 8. 0 软件进行响应面试验分析，以 OD
为响应值分别对各自变量进行多元线性回归和二项
式拟合，得拟合方程 Y = 0. 91 + 0. 16X1 + 0. 15X2 +
0. 12X3 － 0. 027X1X2 － 8. 75 × 10
－3 X1X3 +
3. 00 × 10 －3X2X3 － 0. 19X
2
1 － 0. 17X
2
2 － 0. 17X
2
3，方差
分析见表 3。
表 3 响应面拟合回归方程的方差分析
Table 3 Variance analysis of fitting regression equation of response
surface
方差来源 SS f MS F P
模型 2. 04 9 0. 23 5. 46 0. 007 0
X1 0. 35 1 0. 35 8. 46 0. 015 6
X2 0. 31 1 0. 31 7. 43 0. 021 3
X3 0. 20 1 0. 20 4. 90 0. 051 2
X1X2 6. 05 × 10 －3 1 6. 05 × 10 －3 0. 15 0. 710 5
X1X3 6. 13 × 10 －4 1 6. 13 × 10 －4 0. 02 0. 905 7
X2X3 7. 20 × 10 －5 1 7. 20 × 10 －5 1. 74 × 10 －3 0. 967 6
X21 0. 54 1 0. 54 13. 10 0. 004 7
X22 0. 42 1 0. 42 10. 10 0. 009 8
X23 0. 44 1 0. 44 10. 55 0. 008 8
残差 0. 41 10 0. 04
失拟性 0. 41 5 0. 08 6. 51 0. 054 7
纯误差 1. 33 × 10 －4 5 2. 66 × 10 －5
总差 2. 45 19
方差分析表明二次多项回归模型具有极显著
性，在所选试验条件下，各自变量的交互项均无显著
性差异。二项式回归方程失拟检验不显著，说明未
知因素对试验结果干扰很小，该模型拟合程度很好，
试验误差小。根据回归方程作出不同因子的响应面
分析图，见图 2。
2. 3. 3 最佳工艺条件的预测与检验 通过回归模
型的预测，初步得到最佳提取工艺为乙醇体积分数
72. 80%，乙醇用量 14. 47 倍，提取时间 2. 14 h，此时
预测橙皮苷、木犀草素、芹菜素提取量分别为
4. 007，1. 312，0. 587 mg·g －1，OD 0. 945 5。结合实
际生产情况，确定最佳工艺参数为加 15 倍量 73%
乙醇提取 2 次，每次 2 h。称取荆芥穗粗粉 50 g，共
3 份，按优选的工艺条件进行验证试验，结果橙皮苷
提取量分别为 3. 987，3. 992，3. 994 mg·g －1，木犀草
素提取量 1. 307，1. 314，1. 299 mg·g －1，芹菜素提取
量 0. 588，0. 587，0. 591 mg·g －1，实测 OD 0. 925 3，与
预测值的偏差 － 2. 14%，说明该二项式拟合效果良
图 2 乙醇用量、乙醇体积分数及提取时间相互作用对荆芥穗总黄酮
提取工艺影响的响应面
Fig． 2 Ｒesponse surfaces of effects of interaction among extraction
time，ethanol amount and concentration on extraction process of total
flavonoids from Schizonepetae Spica
好，建立的数学模型具有良好的预测性，优选的工艺
条件重复性较好。
3 讨论
本文采用 HPLC-DAD 检测器，利用 DAD 检测
器全波长扫描(200 ～ 400 nm)，结果表明在 283 nm
处 3 个待测成分均有较大紫外吸收，响应高且分离
效果良好。综合考虑各色谱峰的响应和干扰因素，
选择 283 nm作为检测波长。流动相分别考察了甲
醇、乙腈、水和不同体积分数磷酸进行洗脱，结果发
现乙腈和 0. 4%磷酸洗脱时，各色谱峰分离度及峰
形均较好。通过考察流速和柱温对峰形的影响，最
终确定流速 1 mL·min －1，柱温 30 ℃。
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荆芥(穗)历版《中国药典》均以挥发油含量为
质量控制指标。若单以挥发油含量为质量控制指
标，市售药材中有较多是不合格的，因此有必要对荆
芥(穗)的质量控制指标进行补充。本文采用星点
设计-响应面法优化荆芥穗中橙皮苷、木犀草素、芹
菜素提取工艺，利用 HPLC测定这 3 种成分的含量，
为荆芥(穗)的质量控制提供实验依据。
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［责任编辑 刘德文］
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第 21 卷第 8 期
2015 年 4 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 21，No． 8
Apr．，2015