全 文 ：基金项目:《中国药典》2015 版一部标准研究资助项目(Z18) ;长沙市科技计划资助项目(k1406039-31) ;湖湘青年科技创新创业平台人才项目
资助项目(2013) ;湖南省十二五重点学科药学学科资助项目;湖南中医药大学青年教师基金资助项目(998200)
作者简介:谢嘉驰，女，硕士研究生 研究方向:中药有效活性成分研究 * 通讯作者:林丽美，女，副教授 研究方向:中药药效物质基
础及其质量标准化研究 Tel:(0731)88458230 E-mail:lizasmile@ 163. com
·论 著·
水线草和白花蛇舌草 HPLC特征图谱研究
谢嘉驰1，2，3，柏玉冰1，2，3，李洪权1，2，3，周亚敏1，2，3，夏伯候1，2，3，李亚梅1，2，3，肖冰梅1，林丽美1，2，3* ，廖端
芳1，2，3(1. 湖南中医药大学，长沙 410208;2. 湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心，长沙 410208;3. 中药有毒物质防控技
术湖南省工程实验室，长沙 410208)
摘要:目的 建立不同产地中药材水线草与白花蛇舌草的 HPLC特征图谱，用以区分水线草与白花蛇舌草。方法 采用 HPLC
分析，色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，以甲醇-水为流动相系统进行梯度洗脱，流速 1. 0 mL·
min －1，检测波长 254 nm，柱温 30 ℃;采用《中药指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价;采用 Matlab7. 0 软件进行主成分
分析和聚类分析。结果 分别得到水线草和白花蛇舌草的 HPLC特征图谱，经比较，两者共有峰为 8 个，分别为 a ～ h;特征峰
水线草中峰为 7 ～ 12，白花蛇舌草中峰为 1 ～ 6;相似度分析结果显示，不同来源水线草相似度值在 0. 733 ～ 0. 984 之间，不同来
源白花蛇舌草相似度值在 0. 873 ～0. 951之间;主成分分析和聚类分析将供试药材分为 3类:自采水线草、自采白花蛇舌草及购买
白花蛇舌草。结论 该方法可以快速简便地区分中药材水线草和白花蛇舌草，可为两者的质量控制及临床使用提供参考。
关键词:水线草;白花蛇舌草;高效液相色谱法;特征图谱;主成分分析;聚类分析
doi:10. 11669 /cpj. 2016. 01. 005 中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2016)01 － 0015 － 05
Comparative Study on HPLC Specific Chromatogram of Oldenlandia corymbosa Linn. And Oldenlan diadif-
fusa (Willd. )Ｒoxb.
XIE Jia-chi1，2，3，BAI Yu-bing1，2，3，LI Hong-quan1，2，3，ZHOU Ya-min1，2，3，XIA Bo-hou1，2，3，LI Ya-mei1，2，3，XIAO
Bing-mei1，LIN Li-mei1，2，3* ，LIAO Duan-fang1，2，3(1. Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China;2.
Hunan Engineering Center for Ｒapid Test and Ｒemoval of Toxic and Harmful Substances in Chinese Medicine，Changsha 410208，Chi-
na;3. Hunan Engineering Laboratory for Prevention and Control Technology of Toxic Substances in Chinese Medicine，Changsha
410208，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To establish the HPLC specific chromatogram of Oldenlandia corymbosa Linn. and Oldenlan diadiffusa
(Willd.)Ｒoxb. in different regions so as to distinguish these two traditional Chinese medicinal materials. METHODS HPLC was
performed on an Agilent Eclipse XDB-C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)column with mobile phase consisting of methanol-water at a flow
rate of 1 mL·min －1，column temperature at 30 ℃ and detection wavelength at 254 nm. Similarity evaluation system for chromato-
graphic fingerprint of TCM was used to conduct similarity evaluation and Matlab7. 0 software was used for principal component and clus-
ter analysis. ＲESULTS Oldenlandia corymbosa Linn. and Oldenlan diadiffusa (Willd. )Ｒoxb. had eight common peaks，namely，
a － h;the characteristic peaks of O. corymbosa were 7 to 12，while the characteristic peaks of O. diffusa were 1 to 6. The similarity
values of O. corymbosa and O. diffusa collected from different sources were 0. 733 － 0. 984 and 0. 873 － 0. 951，respectively. Accord-
ing to the principal components analysis and cluster analysis，the tested samples were classified into three categories:O. corymbosa
collected from wild，O. diffusa collected from wild and purchased O. diffusa. CONCLUSION The established method is reliable
and rapid to distinguish the two kinds of easily confused traditional Chinese medicinal materials and also can offer reference for their
quality control and clinical use.
KEY WOＲDS:Oldenlandia corymbosa Linn.;Oldenlan diadiffusa (Willd.)Ｒoxb.;HPLC;specific chromatogram;cluster analysis;
principle component analysis
·51·
中国药学杂志 2016 年 1 月第 51 卷第 1 期 Chin Pharm J，2016 January，Vol. 51 No. 1
水线草(Oldenlan diacorymbosa Linn. )和白花蛇
舌草［Oldenlan diadiffusa(Willd. )Ｒoxb.］同为茜草
科耳草属草本植物，两者外部形态极为相似［1］，因
此临床上常有意或无意地将两者混淆 /互用。但是，
已有研究表明，二者化学成分不同［2-4］，白花蛇舌草
主要含有三萜、蒽醌、黄酮以及环烯醚萜，而水线草
则主要含有环烯醚萜、三萜、二萜和内酯类。在药理
活性方面，两者也存在差异［5］，相对于白花蛇舌草
在临床上应用于多种癌症，水线草更侧重于保肝和
抗肝癌［6-7］。因此，互用 /混用有可能会影响其临床
疗效，甚至是用药安全。为此，目前已有 rDNA ITS
序列分析［8］、FT-IＲ谱［9］、荧光显微法［10］、褶合光谱
法［11］、紫外谱线组法［12］等对两者将进行鉴别。同
时也有 HPLC对两药材进行比较，如弱极性和中等
极性组分指纹谱［13］、非强极性组特征谱［14］以及全
组分指纹图谱［15］，但研究对象主要是白花蛇舌草，
均只采用少数水线草样品作为参考。
而本实验组采用 HPLC对自采水线草、自采白花
蛇舌草和购买白花蛇舌草三类样品建立特征图谱及
区分，以期进一步扩展水线草和白花蛇舌草的鉴别方
法，为二者的质量控制提供更为科学的依据。
1 仪器与试药
T － 214 型万分之一电子分析天平(北京赛多利
斯仪器系统有限公司) ;SK3300H 型超声波清洗器
(上海科导超声仪器有限公司) ;Waters 2695-2996
HPLC系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进
样器(Waters 公司) ，微孔滤膜(上海安普科学仪器
有限公司)。甲醇，乙腈，冰乙酸为色谱纯，自制双
蒸馏水。对照品鸡矢藤苷甲酯(实验室自制，经
HPLC测定其纯度为 98. 6%)。
19 批药材购自药材市场或产地采集，由湖南中
医药大学药学院药用植物学教研室王智老师和中药
鉴定学教研室龚力民老师共同鉴定为茜草科耳草属
草本植物水线草(Oldenlan diacorymbosa Linn. )和白
花蛇舌草［Oldenlan diadiffusa (Willd. )Ｒoxb.］的干
燥全草，样品信息见表 1。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱为 Agilent Eclipse XDB C18柱(4. 6 mm ×
250 mm，5 μm) ，以甲醇(A)-水(B)为流动相进行梯
度洗脱，洗脱程序为 0 ～ 25 min、2%→20% A，25 ～
30 min、20%→26% A，30 ～ 35 min、26% A，35 ～ 60
min、26%→50%A，流速为 1. 0 mL· min －1，柱温 30
℃，检测波长 254 nm，进样体积 7 μL。
2. 2 供试品制备
药材粉碎，过 60 目筛，取粉末约 1 g，精密称定，
置于 100 mL 具塞三角瓶中，加入体积分数 75%甲
醇 25 mL，称重，超声 30 min，取出，放冷至室温，体
积分数 75%甲醇补重，过 0. 22 μm 微孔滤膜，取续
滤液进样分析。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 精密度实验 水线草药材(S1)和白花蛇舌
表 1 不同来源的水线草和白花蛇舌草
Tab. 1 Different sources of O. corymbosa and O. diffusa
No. Sample name Source(in Chinese) Collection time Collection personnel
S1 O. corymbosa Suburbs of Guangxi (广西城郊) 2014. 8 ZHOU Ya-min
S2 O. corymbosa Panyu Guangdong (广州番禺) 2014. 8 ZHOU Ya-min
S3 O. corymbosa Yunfu Yunan Guangdong (广东云浮云安县) 2014. 8 ZHOU Ya-min
S4 O. corymbosa Yunnan，August (云南 8 月份) 2014. 8 ZHOU Ya-min
S5 O. corymbosa Yunfu Xinxing Guangdong (广东云浮新兴县) 2014. 8 ZHOU Ya-min
S6 O. corymbosa Bozhou Anhui (安徽亳州) 2014. 8 ZHOU Ya-min
S7 O. corymbosa Licang Shuangjiang Yunnan (云南临沧双江县) 2014. 8 BAI Yu-bing
S8 O. corymbosa Lincang Fengqing Yunnan (云南临沧凤庆县) 2014. 8 BAI Yu-bing
S9 O. corymbosa Baise Guangxi，July (广西百色 7 月份) 2014. 7 BAI Yu-bing
S10 O. corymbosa Yunnan，July (云南 7 月份) 2014. 7 BAI Yu-bing
S11 O. corymbosa Guizhou，July (贵州 7 月份) 2014. 7 BAI Yu-bing
S12 O. diffusa Qidong Hengyang (衡阳祁东县) 2014. 8 BAI Yu-bing
S13 O. diffusa North of the city Yulin Guangxi (广西玉林城北) 2014. 8 LI Hong-quan
S14 O. diffusa Churentang pharmacy (楚仁堂大药房) 2014. 8 LI Hong-quan
S15 O. diffusa Xingping pharmacy(杏平大药房) 2014. 8 LI Hong-quan
S16 O. diffusa Kunming Yunnan(云南昆明) 2014. 8 LI Hong-quan
S17 O. diffusa Fujian (福建) 2014. 8 XIE Jia-chi
S18 O. diffusa Haikou Hainan (海南海口) 2014. 8 XIE Jia-chi
S19 O. diffusa Jiuzhitang pharmacy (九芝堂大药房) 2014. 8 XIE Jia-chi
·61· Chin Pharm J，2016 January，Vol. 51 No. 1 中国药学杂志 2016 年 1 月第 51 卷第 1 期
草(S12) ，按“2. 2”项下方法分别制备供试品各 1
份，按“2. 1”项下色谱条件，分别连续进样 6 次，记
录色谱图。水线草以鸡矢藤苷甲酯峰作为参照峰，
计算 14 个共有峰的相对保留时间的 ＲSD 值为
0. 34%，相对峰面积的 ＲSD值为 4. 45%。白花蛇舌
草以 S12 峰作为参照峰，相对保留时间的 ＲSD 值为
0. 42%，相对峰面积的 ＲSD 值为 4. 53%。结果表
明，该仪器的精密度良好。
2. 3. 2 重复性实验 取水线草药材(S1)和白花蛇
舌草(S12) ，按“2. 2”项下方法分别制备供试品各 6
份，按“2. 1”项下色谱条件，分别依次进样 6 次，记
录色谱图。水线草以鸡矢藤苷甲酯峰作为参照峰，
计算 14 个共有峰的相对保留时间的 ＲSD 值为
0. 35%，相对峰面积的 ＲSD值为 4. 10%。白花蛇舌
草以 S12 峰作为参照峰，相对保留时间的 ＲSD 值为
0. 32%，相对峰面积的 ＲSD 值为 4. 43%。结果表
明，该方法的重复性良好。
2. 3. 3 稳定性实验 取水线草药材(S1)和白花蛇
舌草(S12) ，按“2. 2”项下方法分别制备供试品各 1
份，按“2. 1”项下色谱条件，分别在 0、3、9、18、24 h
进样，记录色谱图。水线草以鸡矢藤苷甲酯峰作为
参照峰，计算 14 个共有峰的相对保留时间的 ＲSD
值为 0. 48%，相对峰面积的 ＲSD 值为 4. 83%。白
花蛇舌草以 S12 峰作为参照峰，相对保留时间的
ＲSD值为 0. 50%，相对峰面积的 ＲSD 值为 4. 66%。
结果表明，供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 4 特征图谱建立与分析
2. 4. 1 特征图谱建立 按“2. 1”项下色谱条件，建
立了水线草与白花蛇舌草特征图谱及鸡矢藤甲酯对
照品图谱，分别见图 1、2、3。从图 3 水线草与白花
蛇舌草参照图谱(“中药指纹图谱相似度评价系统”
处理后的共有模式)可以看出，两者存在 8 个共有
峰，分别为峰 a ～ h。且存两者各自的特征峰，水线
草中的为峰 7 ～ 12，白花蛇舌草中为峰 1 ～ 6。但是
在保留时间为 14 min 后可见水线草和白花蛇舌草
存在明显差异，水线草中的特征峰峰 7(鸡矢藤苷甲
酯对照峰)、峰 8、峰 9、峰 10、峰 11 和峰 12，白花蛇
舌草的特征峰峰 1、峰 2、峰 3、峰 4、峰 5 和峰 6，这些
特征峰均可以作为两者区分的依据。
2. 4. 2 相似度分析 用分析方法建立表 1 中 19 批
药材的 HPLC特征图谱，将 11 批水线草和 8 批白花
蛇舌草两类特征图谱分别导入《中药指纹图谱相似
度评价系统》(2. 0 版)软件，分别进行峰匹配(图 1、
2)和相似度计算，11 批水线草特征图谱的相似度，
图 1 水线草特征 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC Chromatograms of O. corymbosa
图 2 白花蛇舌草特征 HPLC图谱
Fig. 2 HPLC Chromatograms of O. diffusa
图 3 水线草与白花蛇舌草参照图谱比较
Fig. 3 Ｒeference chromatograms of O. corymbosa and O. dif-
fusa
除 1 批相似度为 0. 737 外，其余 10 批均在
0. 957 ～ 0. 984之间，8 批白花蛇舌草在 0. 873 ～
0. 951 之间(表 2)。说明，不同来源的水线草相似
高，不同来源的白花蛇舌草相似度也较高，可用于两
种药材的比较。
2. 4. 3 系统聚类分析 以水线草和白花蛇舌草每
个批次药材主要色谱峰 (图 2 和图 3 中峰 a ～ n)的
峰面积为指标，使用 MATLAB7. 0 数据分析软件，采
用欧氏距离对 11 批水线草和 8 批白花蛇舌草样品
进行聚类分析。结果如图 4 所示，从图 4 中可看出，
样品的聚类结果理想，水线草样品除样品 1 外，总体
分为一类(样品 2 ～ 11)和相似度分析结果符合，白
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中国药学杂志 2016 年 1 月第 51 卷第 1 期 Chin Pharm J，2016 January，Vol. 51 No. 1
表 2 水线草和白花蛇舌草样品相似度分析结果
Tab. 2 Similarity analysis results of O. corymbosa and O. dif-
fusa
No.
Similarity
value
No.
Similarity
value
No.
Similarity
value
No.
Similarity
value
S1 0. 737 S6 0. 970 S11 0. 976 S16 0. 951
S2 0. 963 S7 0. 955 S12 0. 884 S17 0. 884
S3 0. 965 S8 0. 966 S13 0. 873 S18 0. 873
S4 0. 965 S9 0. 957 S14 0. 937 S19 0. 884
S5 0. 975 S10 0. 984 S15 0. 942
花蛇舌草样品整体分为 4 类，样品 17 为一类，样品
16 和 18 分为一类，样品 12 和 13 分为一类，样品
14、15 和 19 分为一类(样品 12 ～ 19) ;其中样品 14、
15 和 19 与水线草分为一大类，且从样品来源可知，
此 3 个样品(14、15、19)为购买品，非自采，因此可
能为水线草和白花蛇舌草混品。
2. 4. 4 主成分分析 以水线草和白花蛇舌草每个
批次药材主要色谱峰(图 2 和图 3 中峰 a ～ n)的峰
面积为指标，采用 MATLAB7. 0 数据分析软件，对 11
批水线草和 8 批白花蛇舌草样品进行主成分分析。
11 批水线草和 8 批白花蛇舌草样品的散点图(图
5) ，其中部分水线草样品(样品 2 ～ 11)和部分白花
蛇舌草样品(样品 14、15、19)集中分布于图的左侧，
其余水线草(样品 1)和白花蛇舌草样品(样品 12 ～
13、16 ～ 18)集中分布于图的右侧，与聚类分析的分
类结果一致。
3 讨 论
3. 1 提取条件的考察
比较甲醇、体积分数 75%甲醇、体积分数 50%
甲醇、乙醇、体积分数 75%乙醇、体积分数 50%乙醇
6 种提取溶剂，以体积分数 75%甲醇提取的样品色
谱峰个数最多，峰面积较大，故选择体积分数 75%
甲醇;比较体积分数 75%甲醇 10、15、20、25 和 30
mL 5 种不同提取体积，以 25 mL 体积分数 75%甲醇
峰面积最大，故选择 25 mL 体积分数 75%甲醇最
好;比较超声、回流两种不同提取方法提取，超声峰
面积提取明显高于回流，并且此方法操作简单、快速
方便，故选择超声提取方法;比较不同提取时间 15、
30、45 和 60 min 4 种不同提取时间，结果表明，30
min后提取率基本一致，故选择 30 min。
3. 2 色谱条件优化
比较甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0. 1%冰乙酸水和
乙腈-0. 1%冰乙酸水 4 个流动相系统，结果发现，
图 4 水线草与白花蛇舌草的聚类分析图
1 ～11 －分别代表 11批水线草样品;12 ～19 －分别代表 8批白花蛇舌草样品
Fig. 4 Cluster analysis of O. corymbosa and O. diffusa
1 － 11 － samples of O. corymbosa;12 － 19 － samples of O. diffusa
图 5 水线草与白花蛇舌草的主成分分析图
1 ～ 11 －分别代表 11 批水线草样品;12 ～ 19 －分别代表 8 批白花蛇舌草样品
Fig. 5 Principal component analysis of O. corymbosa and O.
diffusa
1 － 11 － samples of O. corymbosa;12 － 19 － samples of O. diffusa
采用甲醇-水流动相系统，各峰的分离度较好，且基
线平稳，有利于指纹图谱的分析，故选择采用甲醇-
水系统作为流动相系统;比较不同检测波长，在 254
nm波长下，色谱图基线噪音比较低，特征峰响应值
较高，色谱图信息比较完全，故选择 254 nm 作为检
测波长。
3. 3 特征图谱分析
通过比较二者的 HPLC 特征图谱的共有峰模
式，其中共有峰表现出不同样品及不同产地的水线
草与白花蛇舌草具有共有性，非共有峰的差异则表
现出二者各自的特异性。比较二者的相似度分析，
水线草和白花蛇舌草相似度不同;比较主成分和聚
类分析，供试药材分为三类:自采水线草、自采白花
蛇舌草及购买的白花蛇舌草。因此，该方法快速简
便地区分水线草和白花蛇舌草。
·81· Chin Pharm J，2016 January，Vol. 51 No. 1 中国药学杂志 2016 年 1 月第 51 卷第 1 期
3. 4 建议
2010 年版《中国药典》收载了白花蛇舌草的植
物来源，没有提及质量标准要求，对于控制药材质量
有待完善。《中国药典》也未收录水线草药材质量
标准，鸡矢藤苷甲酯是水线草特有的化学成分，可作
为指标成分来控制水线草的质量。由于两者基原相
近，性状相似，一般方法较难分辨，导致多数地区把
白花蛇舌草药材与水线草互为混用。为正确分辨和
区分它们，保障临床用药的质量和安全，建立水线草
与白花蛇舌草特征图谱，对二者进行比较研究，找出
不同样品、不同产地和来源的化学成分上差异，为完
善白花蛇舌草和水线草质量标准提供实验依据。并
且应增加白花蛇舌草和水线草主要色谱峰或共有峰
的 LC-MS鉴定，为质量标准的建立提供科学支撑。
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