全 文 ：中国当代医药 2015 年 3 月第 22 卷第 8 期
CHINA MODERN MEDICINE Vol. 22 No. 8 March 2015
·论 著·
水线草为茜草科耳草属草本植物水线草 [Hedy- otis corymbosa（L.）Lam.]的干燥全草。 夏、秋两季采收，
鲜用或晒干。 清热解毒，治疟疾、肠痈、肿毒、烫伤[1]。
近年来，水线草应用于中医理论指导下癌症的治
疗，但目前水线草的质量标准仅收录于地方标准《广
东省中药材标准》[2]，其质量可能难以得到有效控制。因
此，为了有效地控制水线草质量，本课题组对其进行
质量标准提升研究，由地方标准提升为国家标准。
水线草熊果酸和齐墩果酸含量测定
李洪权 1，2，3 柏玉冰 1，2，3 周亚敏 1，2，3 谢嘉驰 1，2，3 夏伯候 1，2，3 林丽美 1，2，3▲
1.湖南中医药大学，长沙 410208；2.湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心，长沙 410208；
3.中药有毒物质防控技术湖南省工程实验室，长沙 410208
[摘要] 目的 制订水线草 2015版《中国药典》含量测定项中熊果酸和齐墩果酸的含量标准。 方法 采用 RP-HPLC
法，以 Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈∶甲醇∶0.5%冰醋酸（5∶12∶83）为流动相系统洗脱，流速
1 ml/min，检测波长 210 nm，柱温 25℃。 结果 熊果酸在 0.01104~1.104 μg/μl 线性关系良好（r2=0.9994），平均加
样回收率为 99.54%，RSD%为 1.14%；齐墩果酸在 0.011~1.10 μg/μl 线性关系良好（r2=0.9992），平均加样回收率为
99.06%，RSD%为 0.70%；15 批水线草药材中熊果酸的含量均＞0.3%，齐墩果酸的含量均＞0.1%，结果符合原标准
《广东省中药材标准》要求，建议沿用原标准：水线草中齐墩果酸和熊果酸总含量应≥0.08%。 结论 该标准能有
效保证水线草中齐墩果酸和熊果酸的含量和水线草的质量。
[关键词] 水线草；熊果酸；齐墩果酸；高效液相色谱法；含量测定
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）03（b）-0012-05
Content determination of ursolic acid and oleanolic acid in Hedyotis corm-
bosa(L.)Lam.
LI Hong-quan1，2，3 BAI Yu-bing1，2，3 ZHOU Ya-min1，2，3 XIE Jia-chi1，2，3 XIA Bo-hou1，2，3 LIN Li-mei1，2，3▲
1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2.Research Center of Engineering Technology for
Rapid Test and Remove of Chinese Medicine Harmful Substance in Hunan Province,Changsha 410208,China;3.Engi-
neering Laboratory for Prevention and Control Technology of Chinese Medicine Toxic Substance in Hunan Province,
Changsha 410208,China
[Abstract] Objective To develop a content determination standard of ursolic acid and oleanolic acid in Hedyotis
corymbosa(L.)Lam. for Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. Methods HPLC procedure was performed on an Agilent-C18
(4.6 mm×250 mm,5 μm)column and eluted with a mobile phase consisted of acetonitrile ∶methanol ∶0.5% acetic acid
(5∶12∶83)at a flow rate of 1 ml/min.The column temperature was 25 ℃.The detection wavelength was 210 nm. Results
Ursolic acid:the calibration curve showed a good linearity(r2=0.9994)within test range from 0.01104 to 1.104 μg/μl.And
the average recovery was 99.54% with RSD 1.14%.Oleanolic acid:the calibration curve showed a good linearity (r2=
0.9992)within test range from 0.011 to 1.10 μg/μl.And the average recovery was 99.06% with RSD 0.70%.The content
range of ursolic acid and oleanolic acid in 15 batches of Hedyotis corymbosa (L.)Lam. was more than 0.3% and 0.1%
respectively.This results conformed to the requirements of the original standard on the Standard of Traditional Chinese
Medicine of Guangdong Province.So,it suggested that extended the original standard:the total content of oleanolic acid
and ursolic acid in Hedyotis corymbosa (L.)Lam. were more than 0.08%. Conclusion The standard can effectively guar-
antee the content of oleanolic acid and ursolic acid in Hedyotis corymbosa (L.)Lam. and the quality of Hedyotis corym-
bosa(L.)Lam.
[Key words] Hedyotis corymbosa(L.)Lam.;Ursolic acid;Oleanolic acid;HPLC;Content determination
[基金项目] 湖湘青年科技创新创业平台人才项目（2013）；
湖南省十二五重点学科药学学科资助项目（2012）
[作者简介] 李洪权(1989-)，男，硕士，主要从事中药药效物
质基础及质量标准化研究
▲通讯作者：林丽美，硕士生导师，主要从事中药药效物质基
础及质量标准化研究
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水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
水线草
广东肇庆鼎山湖
广东云浮云安县
广东清远连州县
广东云浮罗定市
广东云浮新兴县
广西玉林容县
广西玉林陆川县
广西玉林北流市
广西玉林贵港县
广西玉林博白县
云南丽江玉龙县
云南临沧凤庆县
云南临沧孟定县
云南临沧双江自治县
云南丽江永胜县
2013-7-20
2013-7-17
2013-7-21
2013-7-28
2013-7-25
2013-8-10
2013-8-1
2013-8-11
2013-8-5
2013-8-7
2013-8-25
2013-9-13
2013-9-15
2013-9-12
2013-8-20
谢文剑
李洪权
谢文剑
李洪权
柏玉冰
曹艺
严东
李洪权
刘应蛟
周俊成
晏萌艺
谢文剑
柏玉冰
曹艺
严东
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
王智/龚力民
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
含量测定
编号 药材名称 收集地点 时间 收集人 鉴定人 用途
表 1 水线草和白花蛇舌草药材信息
熊果酸和齐墩果酸作为水线草主要成分，据目前
的研究表明两者具有很好的抗肿瘤活性 [3-10]，因此选
择两者作为含量测定指标性成分，能很好地体现水线
草抗癌的主要临床作用。 目前，关于水线草中的熊果
酸和齐墩果酸的含量测定[11-12]均未体现其道地性——
水线草主产于广东、广西和云南三省 [13]。 本研究中选
择这 3个主产区的 15个样品进行含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
SK3300H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有
限公司）；T-214 型电子分析天平（Denver 公司）；Wa-
ters2695-2996 高效液相色谱系统，Empower 工作站，
含四元梯度泵、自动进样器（Waters公司）；Varian-400
型磁共振仪（Varian 公司）；LCQ Advantage 型质谱仪
（Thermo Finnigan 公司）。
1.2 试剂与药材
冰乙酸（色谱纯，天津市化学试剂研究所）；甲醇、
乙腈（色谱纯，Tedia 公司）；水为怡宝纯净水；对照品
齐墩果酸和熊果酸（自制，采用面积归一化法计算纯
度分别为 98.5%、99.3%）；含量测定水线草药材 15批。
药材均由湖南中医药大学药学院药用植物教研室王
智老师和中药鉴定教研室龚力民老师共同鉴定水线
草鉴定为茜草科耳草属草本植物水线草的干燥全草，
具体药材信息见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以
乙腈（A）-甲醇（B）-0.5%冰醋酸（C）为流动相系统进行
等度洗脱（0～20 min，5%A；12%B；83%），流速 1 ml/min；
检测波长 210 nm；柱温 25 ℃，进样量 10 μl。
2.2 对照品溶液的制备
取对照品熊果酸约 5 mg，精密称定，置于 5 ml 量
瓶中，加甲醇适量，稀释至刻度线，摇匀，即得。
取对照品齐墩果酸约 5 mg，精密称定，置于 5 ml
量瓶中，加甲醇适量，稀释至刻度线，摇匀，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品粉末（过四号筛，下同）约 1.0 g，精密称
定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 15 ml，密塞，称定
重量，超声处理（功率 160 W，频率 59 kHz）45 min，放
冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，
取续滤液，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度考察 精密吸取同一份水线草供试品溶
液，在上述色谱条件下，连续进样 6 次，记录熊果酸和
齐墩果酸峰面积。 结果表明，峰面积的 RSD 分别为
0.34%和 0.77%，符合要求。
2.4.2 重复性考察 称取水线草粉末 6 份，按“供试品
溶液的制备”项下操作，在上述色谱条件下进样分析，
计算熊果酸和齐墩果酸峰面积 ，RSD 为 1.77%和
1.54%，符合要求。
2.4.3 稳定性考察 取水线草供试品溶液，于室温下放
置，分别在 0、4、8、12、16、20 h 进样分析，计算熊果酸
和齐墩果酸峰面积，其 RSD 分别为 1.03%和 0.78％。
结果表明，水线草溶液在 20 h内稳定性良好。
2.4.4 线性考察 分别取对照品熊果酸、齐墩果酸约 5 mg，
精密称定，置于 5 ml 量瓶中，加甲醇适量，稀释至刻
度线，摇匀，得熊果酸、齐墩果酸对照品溶度分别为
1.104、1.10 μg/μl。 精密吸取浓度为 1.104 μg/μl 的熊
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果酸对照品溶液稀释至浓度分别为 0.01104、0.02208、
0.0552、0.1104、0.552、1.104 μg/μl 的溶液，吸取浓度
为 1.10 μg/μl 的齐墩果酸对照品溶液稀释至浓度分
别为 0.011、0.022、0.0552、0.11、0.55、1.10 μg/μl 的溶
液按“2.1”色谱条件进行测定，并记录峰面积。 以峰面
积为纵坐标，进样量为横坐标，计算回归方程。 在
0.01104~1.104 μg/μl 内，熊果酸的线性方程为 Y=
4.5×106X+18888.7（r2=0.9994）；在 0.011~1.10 μg/μl内，
齐墩果酸的线性方程为 Y=4.6×106X+13607（r2=0.9992）
（图 1、图 2）。
图 1 熊果酸的线性
图 2 齐墩果酸的线性
2.4.5 回收率试验 分别精密称取同一产地的水线草
粉末 6 份，约 0.5 g，精密称定，置于 100 ml 具塞三角
瓶中，精密加入甲醇 13.5 ml，然后每份精密加入熊果
酸甲醇溶液（1.104 mg/ml）1.5 ml于三角瓶中。按照正文
制备供试品溶液，进行测定，计算回收率，结果见表 2。
从表 2 可知，熊果酸平均回收率为 99.54%，RSD 为
1.14%，符合要求。
表 2 熊果酸回收率测定结果
分别精密称取同一产地的水线草粉末 6 份，约
0.5 g，精密称定，置于 100 ml 具塞三角瓶中，精密加
入甲醇 14.4 ml，然后每份精密加入齐墩果酸甲醇溶液
（1.10 mg/ml）0.6 ml 于三角瓶中。 按照正文制备供试
品溶液，进行测定，计算回收率，结果见表 3。 从表 3可
知，齐墩果酸平均回收率为 99.06%，RSD 为 0.70%，
符合要求。
表 3 齐墩果酸回收率测定结果
2.4.6 样品熊果酸和齐墩果酸的含量检测 取不同采
集地水线草粉末，每个产地称 2 份，每份约 1.0 g，精
密称定，置 100 ml 具塞锥形瓶中，加入甲醇 15 ml，称
定重量，密塞超声 45 min（功率 160 W，频率 59 kHz），
放冷后，用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液分析，分析
时每份样品进样 2 次。 在上述色谱条件下进行测定，
采用外标法计算，结果见表 4。
表 4 水线草中熊果酸和齐墩果酸的含量（%）
3 讨论
3.1 药源的确定
在水线草产地来源的选择上，以前的研究[11-12，14-18]
中所用药材均没有选择转产区不同产地的药材，不具
有代表性，无法为药典标准提供参考。本实验中，对主
产区的 15个不同来源的水线草进行熊果酸和齐墩果
酸的含量测定，填补了这一空白，为水线草药源的选
择提供了参考，为水线草药典标准研究提供了依据。
3.2 提取条件的优化
对不同提取方式超声、回流提取进行考察，超声
峰面积提取明显高于回流，且经多次提取，回流提取
熊果酸和齐墩果酸峰面积变化较大，故选择方法操作
简单、快速方便的超声提取法。对不同提取溶剂甲醇、
1
2
3
4
5
6
0.5003
0.5002
0.5004
0.5001
0.5007
0.5005
0.6899
0.6897
0.6900
0.6896
0.6904
0.6901
0.6600
0.6600
0.6600
0.6600
0.6600
0.6600
1.3257
1.3488
1.3289
1.3458
1.3300
1.3444
98.21
99.93
98.44
99.72
98.49
99.58
99.06 0.70
编号
样品量
（g）
理论量
（mg）
加入量
（mg）
实测量
（mg）
回收率
（%）
平均回收率
（%）
RSD
（%）
1
2
3
4
5
0.1379
0.1493
0.1764
0.1693
0.1695
0.3562
0.3901
0.5354
0.4855
0.4515
6
7
8
9
10
0.1219
0.1292
0.1178
0.1428
0.1166
0.3208
0.5011
0.4061
0.4573
0.3951
11
12
13
14
15
0.1576
0.1795
0.1133
0.1527
0.1107
0.4907
0.5116
0.4133
0.4398
0.4623
编号 齐墩果酸 熊果酸 编号 齐墩果酸 熊果酸 编号 齐墩果酸 熊果酸
1
2
3
4
5
6
0.5003
0.5002
0.5004
0.5001
0.5007
0.5005
1.7821
1.7817
1.7824
1.7814
1.7835
1.7828
1.6560
1.6560
1.6560
1.6560
1.6560
1.6560
3.4078
3.4968
3.4391
3.4147
3.3721
3.4041
99.12
101.72
100.02
99.34
98.04
98.99
99.54 1.14
编号
样品量
（g）
理论量
（mg）
加入量
（mg）
实测量
（mg）
回收率
（%）
平均回收率
（%）
RSD
（%）
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
进样量（mg/ml）
y=4,557,285.0612x+18,888.7086
r2=0.9994
峰
面
积
（ A
U×
S）
y=4,666,635.2281x+13,607.0164
r2=0.9992
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
峰
面
积
（ A
U×
S）
进样量（mg/ml）
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75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇进行考
察结果表明，以甲醇提取的样品齐墩果酸和熊果酸峰
面积均最大，故提取溶剂选择甲醇。 对不同提取时间
15、30、45、60 min 的考察结果表明，30 min 后各时间
点的提取率基本一致，故选择超声时间为 30 min，所
以确定用甲醇超声提取 30 min 为提取方法。 对不同
提取体积 10、15、20、25 ml进行考察，发现换算峰面积
以 15 ml最大，所以确定最佳提取体积为 15 ml。
3.3 色谱条件优化
由于齐墩果酸和熊果酸属于同分异构体，两者结
构相似，极性相近，因此常规的两相分离系统很难对
两者进行分离[19]。 目前关于水线草中齐墩果酸和熊果
酸的含量测定有薄层色谱法、高效液相色谱法，但是
这些方法在条件上没有明确齐墩果酸和熊果酸是否
被分离开，所测结果不具有说服力，而本研究中特针
对此问题对分离条件进行了探索。本实验经过考察甲
醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-水三个不同的系统，发
现乙腈-甲醇-水系统分离度最佳， 但是峰形较差，因
此加冰醋酸改善峰形[20]，最终确定乙腈-甲醇-0.5%酸
水的流动相系统。
本实验使用 Waters的 PDA检测器进行紫外区全
波长扫描，在 210 nm 波长下，色谱图基线噪声比较
低，特征峰响应面较高，色谱图信息比较完全。综合比
较后，选择 210 nm作为本实验的检测波长。由于齐墩
果酸和熊果酸紫外吸收值较低 [21]，因此本实验条件选
择 210 nm的末端吸收。
3.4 检测结果
基于上述优化后的提取工艺和检测条件，实验结
果发现 ，6 个采集地水线草药材齐墩果酸含量在
0.15%～0.2%之间，所占总样品量的 40%；9个采集地水
线草药材齐墩果酸含量在 0.1%～0.15%之间，占总样
品量的 60%。 4个采集地的水线草药材熊果酸含量在
0.3%～0.4%之间，占总样品量的 27%；有 8 个采集地
的水线草药材熊果酸含量在 0.4%～0.5%之间，占总样
品量的 53%。 3个采集地的水线草药材熊果酸含量在
0.5%～0.6%之间，占总样品量的 20%。15个样品，发现
齐墩果酸的含量在广东省 5个产地均＞0.13%，符合原
标准《广东省中药材标准》要求：齐墩果酸和熊果酸的
总量≥0.08%。为了保证水线草药材的合理使用，建议
沿用原标准。
本实验中分别选择水线草主产区广东、广西和云
南的 15 批水线草进行含量测定，结果发现齐墩果酸
含量在广东省产水线草含量均＞0.13%，若以齐墩果酸
计，应选择广东省产水线草较佳；熊果酸的含量在云
南 5 省产水线草含量均＞0.41%，若以熊果酸计，应选
择云南省产水线草较佳；熊果酸和齐墩果酸总含量在
云南省产水线草含量均＞0.52%，且不同批次含量差异
较小，药材质量稳定，若以熊果酸和齐墩果酸总含量
计，应选云南产水线草较佳。
总之，本实验的完成可为水线草药典标准含量测
定项标准的制订提供依据，为水线草药源的选择提供
参考。
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中国当代医药 2015 年 3 月第 22 卷第 8 期
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（收稿日期：2014-12-18 本文编辑：许俊琴）
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