全 文 ：吉林农业大学学报 2015，37(6) :694～697，714 http:/ / xuebao．jlau．edu．cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@ vip．sina．com
鹿茸提取物对顺铂诱导人胚肾细胞损伤的
影响
*
王婧瑜1，王露露1，李 冰1，刘芳芳2，孙长波2，张 晶1，2
＊＊
1．吉林农业大学中药材学院，长春 130118;2．吉林省中韩动物科学研究院，长春 130600
摘 要:建立顺铂(CDDP)诱导人胚肾成纤维细胞(HEK293)细胞损伤模型，通过 MTT 和 LDH 测定，比较不
同浓度的鹿茸提取物(水提物，醇提物，乙醚提取物，氯仿提取物，乙酸乙酯提取物)诱导 HEK293 细胞损伤的
保护作用。体外培养 HEK293细胞，观察鹿茸提取物对 CDDP 诱导 HEK293 细胞生长的影响，并用 MTT 法和
LDH法检测鹿茸对 CDDP 诱导 HEK293细胞死亡率的变化。结果表明:鹿茸提取物能够拮抗 CDDP 诱发的细
胞损伤，具有浓度依赖性，其半数致死浓度为(0. 083±0. 030)mmol /L。当 HEK293细胞与不同浓度鹿茸提取
物共同孵育 24 h，分别加入 CDDP 后，检测表明鹿茸水提物较其他溶剂提取物对顺铂诱导损伤的 HEK293 有
较好的保护作用，其质量浓度为 1 mg /mL时对顺铂诱导损伤的 HEK293细胞的保护作用最强，细胞存活率达
到 62. 0%(P＜0. 01)。鹿茸水提物对 CDDP 诱导人胚肾细胞损伤的抑制作用最显著，可有效保护细胞活性。
关键词:鹿茸;顺铂;人胚胎肾成纤维细胞;细胞增殖;乳酸脱氢酶;细胞损伤
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1000-5684(2015)06-0694-04
DOI:10．13327 / j．jjlau．2015．2549
引文格式:王婧瑜，王露露，李冰，等．鹿茸提取物对顺铂诱导人胚肾细胞损伤的影响［J］．吉林农业大学学报，
2015，37(6):694-697，714．
Effect of Velvet Antler on Human Embryonic Kidney Cell Injury In-
duced by Cisplatin
WANG Jingyu1，WANG Lulu1，LI Bing1，LIU Fangfang2，SUN Changbo2，ZHANG Jing1，2＊＊
1．College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;
2．Jilin Sino-Korean Institute of Animal Science，Changchun 130600，China
Abstract:This experiment was designed to study the effects of pilose antler extractions (water ex-
tract，ethanol extract，ether extract，chloroform extract and ethyl acetate extract)to protect HEK293
injury induced by cisplatin(CDDP)． HEK293 was cultured in vitro and the results were determined
by MTT and LDH． Pilose antler extractions can protect CDDP-induced injury of HEK293，and the
death rate was more than half at the level of (0. 083±0. 030)mmol /L． After HEK293 cells were in-
cubated for 24 h with different concentrations of extract of pilose antler，CDDP was joined respec-
tively． It was found that water extraction has better protection on CDDP-induced HEK293，and at
the level of 1 mg /mL，the survival rate of cells was 62%(P＜0. 01)． Water extraction can effectively
protect CDDP-induced HEK293 and maintain cell activity．
Key words:antler;CDDP;HEK293;cell proliferation;LDH;cell injury
＊
＊＊
基金项目:吉林省科技发展计划项目(20130413044GH，20140204063YY) ，国家国际科技合作专项(2011DFA32900)
作者简介:王婧瑜，女，在读硕士研究生，研究方向:天然产物化学。
收稿日期:2015-03-02
通讯作者
王婧瑜等:鹿茸提取物对顺铂诱导人胚肾细胞损伤的影响
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
鹿茸为鹿科动物梅花鹿 Cervus nippon Tem-
minck、马鹿 Cervus elaphus Linnaeus 或驯鹿 Ｒan-
gifertarandus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的
幼角，能进行周期性更换。鹿茸是所有哺乳动物
中生长最迅速的可再生器官，可在 90 d 内迅速生
长骨、血管、神经、表皮、毛发等俱全的综合器
官［1］。鹿茸中富含调控上述各器官组织发育成
长的各类细胞生长因子［2-4］。对鹿茸中的细胞生
长因子进行研究是揭开鹿茸药效奥秘的关键部
分。鹿茸蛋白作为主要活性成分，正逐渐得到国
内外学者的共识［5-6］。鹿茸多肽能通过增加脾脏
内的淋巴细胞使脾脏内免疫细胞增殖，从而增加
机体的免疫能力［7-10］。鹿茸水提物对免疫系统具
有调节作用，使机体达到一种稳态，并可抑制特异
性抗体的形成［11］。
顺铂(Cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)
是一种化疗药物，对治疗多种肿瘤疾病具有较好
的效果，近些年被广泛应用于临床，但其表现出明
显的肾毒性则被广大学者关注［12］。肾损伤是多
种肾脏病发展至终末期肾功能衰竭的共同通路，
而人胚肾成纤维细胞(HEK293)是肾的主要重构
细胞，促进 HEK293 的增殖可有效地抑制肾间质
纤维化。本试验通过体外培养的方式，研究了鹿
茸不同提取物对 HEK293 细胞增殖作用的影响，
为揭示鹿茸在抑制肾损伤方面提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
驯鹿鹿茸:吉林伊通鹿场，由吉林农业大学王
全凯教授鉴定为驯鹿鹿茸。
人胚肾成纤维细胞(HEK293) :由吉林农业
大学动物科学技术学院分子免疫实验室提供。
1. 2 试验仪器
倒置相差显微镜(Olympus，日本) ，分光光度
计(BIO ＲAD680，美国) ，二氧化碳培养箱(SE-
LECTA，西班牙) ，超净工作台(SANYO，日本) ，水
平摇床(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
HZS－H) ，高压蒸汽灭菌锅(SANYO，日本) ，鼓风
干燥箱(上海申贤恒温设备厂)。
1. 3 试验试剂
DMEM/F12 培养基 (GIBCO) ，胎牛血清
(PAA)、谷氨酰胺和胰蛋白酶为 AMＲESCO产品，
0. 25%胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜、青霉素、胶原
酶Ⅳ、链霉素为 Sigma 产品，去离子水(杭州娃哈
哈) ，无水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚为北京化工
厂产品。
1. 4 试验方法
1. 4. 1 样品溶液的配制 将鹿茸依次用乙醚、
无水乙醇、去离子水进行回流提取，将各溶剂提取
溶液分别蒸干留样。将部分水提物用氯仿萃取，
取氯仿层萃取液，再用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯
萃取液，分别蒸干留样。得到了鹿茸的乙醚、乙
醇、水、氯仿、乙酸乙酯的提取物。用含 10%胎牛
血清的 DMEM 溶液分别将各提取物制成质量浓
度为 0. 25，0. 50，1. 00 mg /mL的培养液各 10 mL，
为鹿茸不同提取物样品溶液。除菌后保存在 4 ℃
的冰箱中待用。
1. 4. 2 细胞培养 HEK293 细胞采用含青霉素
100 μg /mL、链霉素 100 μg /mL，10%胎牛血清的
DMEM的培养液，在 37 ℃、含 5% CO2的培养箱中
培养。每 2～3 d换液，将培养好的细胞用 0. 25%
胰酶消化、传代，取处于对数生长期的细胞试验。
1. 4. 3 鹿茸样品的添加 用 0. 25%胰酶将传
5代体外培养的 HEK293 消化，配制用含 10%胎
牛血清的细胞培养液，接种于 96 孔板，每孔分别
加入 200 μL，调节细胞浓度为 1×105 /mL 100 μL，
放入培养箱中培养 24 h 后检测。设 2 个细胞处
理组:鹿茸样品组和对照组，鹿茸样品组是将培养
好且已传代后接种于96孔板的细胞中加入已配
制好的不同浓度的鹿茸样品培养液，对照组加入
等量的细胞液。各孔加入培养液至 200 μL，将
96孔板放入 37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。
1. 4. 4 CDDP 对 HEK293 的损伤影响 取处于
对数生长的 HEK293细胞接种于 96孔板中，将细
胞浓度调整为 1×105 /mL 100 μL，待细胞融合后
加入不同浓度的顺铂，调整 CDDP 终浓度分别为
0，0. 019，0. 039，0. 078，0. 156，0. 312，0. 625，
1. 250，2. 500，5. 000 mmol /L，每组 6 个重复，置于
37 ℃、5% CO2的养箱中培养 24 h 后采用 MTT法
检测，加入 20 μL MTT后于 37 ℃、5% CO2培养箱
中培养 4 h，弃培养液，各孔加入 DMSO 100 μL，低
速摇匀 10 min，待结晶充分溶解后用酶标仪检测
(波长 570 nm)吸光度(A)。细胞抑制率 =(1－A
试验 /A空白)×100%。
1. 4. 5 鹿茸对 HEK293细胞的增殖作用 取处
于对数生长的 HEK293细胞接种于 96 孔板中，将
596
吉林农业大学学报 2015年 12月
Journal of Jilin Agricultural University 2015，December
细胞浓度调整为 1×105 /mL 100 μL。设置细胞分
组:空白对照组(仅有等量的细胞液)、试验组(将
处于对数生长期的 HEK293 细胞置于 5% CO2、
37 ℃的培养箱中培养 24 h 加入鹿茸提取物，样
品终质量浓度分别为 0. 25，0. 50，1. 00 mg /mL)。
每组 6次重复，MTT法检测(波长 570 nm)吸光度
(A) ，细胞存活率 /% =A试验 /A空白×100。
1. 4. 6 鹿茸对 CDDP 所致细胞毒性的保护作
用 取处于对数生长的 HEK293 细胞接种于 96
孔板中，将细胞浓度调整为 1×105 /mL 100 μL。
分组为空白对照组;顺铂模型组:加入浓度为
0. 083 mol /L的 CDDP 培养液，置于 37 ℃、含 5%
CO2的培养箱中培养 24 h;CDDP+样品组(鹿茸乙
醚、乙醇、水、氯仿、乙酸乙酯提取物) :加入不同
质量浓度的鹿茸提取物样品(终质量浓度分别为
0. 25，0. 50，1. 00 mg /mL)培养 24 h 后加入
0. 083 mol /L的 CDDP 再培养 24 h。每组 6 次重
复，MTT法检测(波长 570 nm)吸光度(A) ，细胞
存活率 /% =A试验 /A空白×100。
1. 4. 7 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 调整
HEK293细胞浓度为 1×105 /mL接种于 6孔板中，
每孔 2 mL，置于 37 ℃、含 5% CO2的培养箱中培
养 24 h后，加入不同浓度的鹿茸提取物样品培养
24 h，并按说明书中的方法测定 LDH。
1. 5 数据处理与分析
采用 SPSS17. 0软件对试验数据进行方差分
析，用 LSD法进行多因素多水平间的多重比较。
2 结果与分析
2. 1 顺铂对 HEK293细胞毒性作用
加入不同浓度的顺铂培养 HEK293细胞 24 h
后，随顺铂浓度增大，HEK293 细胞存活率逐渐降
低，呈浓度依赖关系，与空白组差异极显著，加入
顺铂后检测半数致死浓度(IC50)为(0. 083 ±
0. 030)mmol /L(图 1) ，结果表明:顺铂对 HEK293
细胞的生长具有明显的抑制作用。
2. 2 鹿茸提取物对 HEK293细胞存活率的影响
加入不同质量浓度的鹿茸提取物处理
HEK293细胞，于 24 h后采用 MTT法检测细胞存
活率，鹿茸乙醚、乙醇、水、氯仿、乙酸乙酯提取物
对细胞的生长均有影响，具有浓度依赖性。鹿茸
水提物和醇提物在浓度为 0. 5 mg /mL、1 mg /mL
时与对照组相比差异极显著(P＜0. 01) ，其中水提
物质量浓度为 1. 00 mg /mL 时细胞存活率达到最
高，细胞存活率为 136. 5%(P＜0. 01) ，其他提取物
无明显作用(图 2)。
图 1 CDDP对 HEK293细胞死亡率的影响
Fig．1． Effect of CDDP on HEK293 cell death rate
图 2 鹿茸提取物对 HEK293细胞存活率的影响
Fig．2． Effect of different pilose antler extracts on
HEK293 cell survival rate
2. 3 鹿茸提取物对顺铂所致 HEK293 细胞毒性
的影响
由图 3可见，加入不同质量浓度的鹿茸提取
物预处理 24 h 后，加入顺铂的半数致死浓度
(0. 083 mmol /L)处理 24 h，与空白组、模型组(仅
顺铂处理)相比较，顺铂模型组的 HEK293细胞存
活率明显降低;加入鹿茸提取物预保护后，可增强
HEK293细胞的存活率，从而降低顺铂对 HEK293
细胞生长的抑制作用。鹿茸提取物对顺铂诱导
HEK293细胞损伤的保护作用呈浓度依赖性，其
中鹿茸水提物和醇提物质量浓度为 0. 50 mg /mL、
1. 00 mg /mL 时差异极显著，水提物质量浓度为
1. 00 mg /mL时对顺铂诱导损伤的 HEK293 细胞
696
王婧瑜等:鹿茸提取物对顺铂诱导人胚肾细胞损伤的影响
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
的保护作用最强，细胞存活率达到 62%(P ＜
0. 01)。
图 3 鹿茸不同提取物对顺铂诱导 HEK293 损伤细
胞存活率
Fig．3． Cell survival rate of different pilose antler
samples in protecting HEK293 cell injury in-
duced by cisplatin
2. 4 LDH测定
乳酸脱氢酶(LDH)主要存在于真核细胞当
中，是可溶性胞质酶，细胞死亡后质膜破裂而释放
到培养基中，细胞的裂解数量与培养基中的 LDH
活性增加呈正相关(图 4)。
图 4 鹿茸不同提取物对顺铂诱导 HEK293 损伤释
放 LDH的影响
Fig．4． Effect of different pilose antler samples on
LDH release of HEK293 injury induced by
cisplatin
由图 4可见，鹿茸不同提取物在顺铂模型上
对细胞的保护活性具有差异。鹿茸水提物在
1. 00 mg /mL时，降低 LDH 释放量效果最为显著，
达到 205%(P＜0. 01)。
3 讨 论
细胞损伤是人体内细胞的生理性调节机制，
能够导致细胞减少，其对控制细胞增殖和分化、肿
瘤的发生和生长以及在机体的免疫调节中有重要
作用。研究表明:肾小管上皮细胞过度损伤是急
性肾功能异常的重要机制［13-15］。当损伤程度相
对较轻时导致细胞凋亡，较重时致使细胞死亡，可
通过药物治疗来降低细胞的损伤，从而使肾小管
上皮细胞再生，达到治疗疾病的目的。鹿茸有效
成分能够刺激肾上腺皮脂功能，在临床上用于增
强肾功能具有很好的应用意义。然而治疗损伤愈
合的重要过程则是通过细胞增殖，包括血管生成
及成纤维细胞增生来完成［16］。
本试验结果显示，驯鹿鹿茸提取物能够拮抗
CDDP 诱发的细胞损伤，并且随着浓度的不同而
产生 变 化，其 半 数 致 死 浓 度 为 (0. 083 ±
0. 030)mmol /L(P＜0. 01)。当 HEK293 细胞与鹿
茸不同浓度提取物配制的细胞培养液培养 24 h，
分别加入 CDDP 后，各提取物对细胞的保护作用
具有浓度依赖性，细胞存活率分别为水提物
(62. 0%)＞ 醇 提 物 (50. 6%)＞ 乙 醚 提 取 物
(42. 3%)＞氯仿提取物(41. 3%)＞乙酸乙酯提取
物(39. 6%) ，检测表明鹿茸水提物浓度在
1. 00 mg /mL时对顺铂诱导损伤的 HEK293 细胞
的保护作用最显著，细胞存活率达到 62. 0%(P＜
0. 01) ，LDH释放量效果较模型组(320%)最为明
显，为 205%。但驯鹿茸的促细胞增殖作用究竟
是一种成分还是多种成分的影响还需要继续验
证。HEK293是肾脏组织内过滤屏障内壁的重要
部分，是刺激炎症和血栓性物质的活性分子，其受
损后可严重导致肾脏病变。推测驯鹿鹿茸是通过
促进 HEK293增殖及分化来抑制肾间质纤维化，
从而修复肾脏受损组织。
鹿茸是一个天然的生长因子库，对 HEK293
的增殖机理可能是其多种生长因子共同作用完成
的，通过调控细胞内部基因，刺激细胞的快速增
殖、迁移，合成新的细胞间质，从而提高细胞活性
来治疗肾损伤。近年来，对鹿茸促进细胞增殖的
研究逐渐增多，但是对其作用机制仍不清楚，需进
一步研究。 (下转第 714页)
796
吉林农业大学学报 2015年 12月
Journal of Jilin Agricultural University 2015，December
［3］ 胡文河，宋红凯，马金华，等． 草甸黑土不同施钾量对大豆
生长发育及产量和品质的影响［J］． 吉林农业大学学报，
2011，33(2) :130-133．
［4］ 汪自强，董明远，叶飞华．不同供钾水平下春大豆的磷积累
和利用［J］．中国油料，1997，19(2) :38-41．
［5］ 李洪喜，焦占力，王忠．氮和钾肥对大豆的增产效果［J］．黑
龙江农业科学，2008(3) :66-67．
［6］ 李舒凡，沈桂琴，徐美德．施钾对增强大豆抗旱性的影响
［J］．大豆科学，1993，12(4) :302-307．
［7］ 郝小雨，周宝库，马星竹，等． 长期不同施肥措施下黑土作
物产量与养分平衡特征［J］． 农业工程学报，31(16) :178-
185．
［8］ 于洁，郝庆升． 入世后中国大豆经济效用与产业安全效用
分析［J］． 吉林农业大学学报，2015，37(1) :120-126．
［9］ 周桂玉，张晓平，范如芹，等． 黑土实施免耕对玉米和大豆
产量及经济效益的影响［J］． 吉林农业大学学报，2015，37
(3) :260-267．
［10］ 毕锐，崔娟，吴磊，等． 昆虫多糖对大豆生长调节作用及产
量的影响［J］． 吉林农业大学学报，2015，37(4) :402-405．
［11］ 王伟妮，鲁剑巍，鲁明星，等． 湖北省早、中、晚稻施钾增产
效果及钾肥利用率研究［J］．植物营养与肥料学报，2011，
17(5) :1058-1065．
［12］ 王英男，王洋，杨光宇，等． 吉林省大豆生产的现状及发展
潜力浅析［J］．中国农业科学导报，2009，11(S2) :21-24．
［13］ 李玉影，刘双全，吴英，等．长期施钾对草甸土钾素动态变
化及产量的影响［J］．黑龙江农业科学，2002 (1) :26-27．
［14］ Yin X H，Tony J Vyn． Ｒesidual effects of potassium place-
ment for conservation-till corn on subsequent no-till soybean
［J］． Soil ＆ Tillage Ｒesearch，2004，75:151-159．
［15］ 刘景利，许振柱，史奎桥．1981—2006 年锦州大豆产量与水
分条件关系分析［J］．安徽农业科学，2009，37(36) :18050-
18052．
［16］ 于晓秋，郭玉． 气象因子对大豆产量的影响［J］．黑龙江气
象，2002(2) :3-4．
［17］ 尹秀英，许文良，冯君． 吉林省大豆种植区土壤主要营养
元素与大豆产量的相互关系研究［J］． 土壤通报，2002，33
(3) :207-211．
［18］ 闫孝贡，刘剑钊，张洪喜，等． 吉林省春玉米大面积增产与
资源增效限制因素评估［J］．吉林农业科学，2012，37(6) :
9-11，24．
［19］ 刘景利，杨扬，梁涛，等． 气象要素对大豆产量的影响分析
［J］．气象与环境学报，2013，29(5) :136-139．
［20］ 郭建华，韩宝文，邢竹．耗竭土壤钾素的固定及对棉花钾素
营养的作用［J］． 华北农学报，2003，18(1) :94-96．
［21］ 董鲁浩，李玉义，逄焕成，等． 不同土壤类型下长期施肥对
土壤养分与小麦产量影响的比较研究［J］． 中国农业大学
学报，2010，15(3) :22-28．
［22］ 鲁剑巍，陈防，刘冬碧，等．成土母质及土壤质地对油菜施
钾效果的影响［J］． 湖北农业科学，2001(6) :42-43．
［23］ 宋秋来，郭昕，龚振平，等． 土壤速效钾水平对大豆钾素积
累及产量影响研究［J］． 作物杂志，2014(2) :106-109．
(责任编辑:赵立华)
(上接第 697页)
参考文献:
［1］ Zhou Ｒ，Li S F． In vitro antioxidant analysis and characteriza-
tion of antler velvet extract［J］． Food Chemistry，2009，114
(4) :1321-1327．
［2］ 王秋玉，王本祥． 论鹿茸生长因子［J］．中医药学报，2000
(6) :10-12．
［3］ 孙红梅，杨福合，邢秀梅，等．鹿茸再生干细胞成骨诱导
(微粒体)培养体系的建立［J］． 吉林农业大学学报，2010，
32(6) :680-683．
［4］ 崔昊震，尹明浩． 鹿茸生长因子的研究现状［J］． 延边大学
医学学报，2006，29(1) :70-72．
［5］ 柯李晶，林冬云，黄晓南，等． 不同加工工艺鹿茸的蛋白成
分和活性比较［J］．中药材，2009，31(1) :11-14．
［6］ 张晨，曹航，李当当，等．细胞周期蛋白 D1在梅花鹿茸角中
的表达［J］．中国兽医学报，2014，34(7) :1153-1156．
［7］ 吴庆燕，宋健，贾泓瑶，等． 促渗剂对鹿茸多肽透皮吸收的
影响及鹿茸多肽免疫活性检测［J］． 中国兽医学报，2012，
32(11) :1703-1707．
［8］ 胡太超，刘玉敏，陶荣珊，等．鹿茸多肽的抗疲劳作用机制研
究［J］．吉林农业大学学报，2015，37(4) :469-475．
［9］ 张传奇，郑毅男，张成中，等．鹿茸多糖的研究概况［J］．经济
动物学报，2013，17(1) :45-48．
［10］ 刘玉敏，李庆杰，胡太超，等．鹿茸超临界 CO2萃取工艺及
滴丸制备工艺研究［J］．经济动物学报，2015，19(1) :51-
54．
［11］ Kang S K，Kim K S，Kim S I，et al． Immunosuppressive ac-
tivity of deer antler extracts of Cervus korean TEMM-INCK var．
Mantchurie-us Swinhoe，on type Ⅱ collagen-induced arthritis
［J］． In Vitro Cell Dev Biology Animal，2006，42(34) :100-
107．
［12］ Tafani M，Cohn J A，Karpinich N O，et al． Ｒegulation of in-
tracellular pH mediates bax activation in HeLa cells treated
with staurosporine or tumornecrosis factoralpha［J］． J Biol
Chem，2002，277:49569-49576．
［13］ 张海莲，高丽萍，冷洪涛，等．枸杞多糖提取物对顺铂诱发
大鼠肾毒性的影响［J］． 食品科学，2012，33(5) :268-
271．
［14］ 杨宁，樊均明，甘华山．顺铂与肾小管上皮细胞凋亡［J］． 国
际泌尿系统杂志，2006，26(6) :848-851．
［15］ Hauser P，Oberbauer Ｒ． Tubular apoptosis in the pmhophysi-
ology of renal diseases［J］． Wien Klin Wochenschr，2002，
114:671-677．
［16］ 黄沙． 生长因子在烧伤创面修复中的作用［J］．人民军医，
2004，47(2) :110-112． (责任编辑:林海涛)
417