全 文 ：第 37卷 第 11期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.37 No.11
2009年 11月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Nov.2009
东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长 cDNA文库的构建 1)
郝　丽　李和平　严　厉
(东北林业大学 ,哈尔滨 , 150040)
　　摘　要　为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列 ,采用 SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织
的全长 cDNA文库。用 SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒提取总 RNA,以逆转录酶 PowerScriptTM反转录合成第
一链 cDNA,然后通过 LD-PCR合成并扩增 dscDNA。扩增产物经纯化 、SfiⅠ酶切 、过CHROMASPIN-400柱去除
小片段后 , 连接到 SfiⅠ消化过的 pDNR-LIB质粒载体中 , 最后用电转化法将重组质粒转化到 E.coliDH5α内得
到原始文库。经测定 , 构建的原始文库约含有 2.56×106个重组子 , 插入片段多在 0.5 ～ 2kb之间 , 平均插入片段
长度约 1.1kb,重组效率接近 100%。结果表明 ,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长 cDNA文库已构建成功。
关键词　东北梅花鹿;鹿茸;全长 cDNA文库;SMART技术
分类号　Q78
ConstructionofFul-lengthcDNALibraryforAntlerTipTissueofSikaDeer/HaoLi, LiHeping, YanLi(Colegeof
WildlifeResources, NortheastForestryUniversity, Harbin150040, P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniver-
sity.-2009, 37(11).-120 ～ 122Astudywasconductedtoconstructful-lengthcDNAlibraryfromantlertiptissuesofSikaDeer(Cervusnipponhortu-
lorum)bySMARTtechniqueinordertoclonenewspecialgenesfordevelopmentofantler.ThetotalRNAwasextractedu-
singSVTotalRNAIsolationSystem.Single-strandedcDNAwassynthesizedusingPowerScriptTMreversetranscriptase,
anddouble-strandedcDNAwassynthesizedandamplifiedbylong-distancePCR.ThePCRproductsweredigestedbypro-
teinaseKandpurified.AfterdigestionwithSfiⅠ andsizefractionationusingCHROMASPIN-400TMColumns, SMARTcDNAwasligatedtotheSfiI-digested, dephosphorylatedpDNR-LIBvector, andtheligationmixturewastransformedinto
E.coliDH5αbyelectroporation.TheprimarycDNAlibrarycontained2.56×106 independentcloneswithDNAinsertsof
0.5 ～ 2.0kb, theaveragesizeofinsertedcDNAswas1.1kb, andtherecombinationpercentagewasabout100%.Results
showedthattheful-lengthcDNAlibraryfromantlertiptissuesofSikaDeerwassuccessfulyconstructed.Keywords　Cervusnipponhortulorum;Antler;Full-lengthcDNAlibrary;SMARTtechnique
　　东北梅花鹿(CervusnipponhortulorumLydekke)是鹿科
(Cervidae)、鹿属 (Cervus)动物梅花鹿(CervusnipponTem-
minck)的东北亚种 , 以其茸质优良而著称。 鹿茸为雄鹿(驯
鹿除外)未骨化密生茸毛的幼角。梅花鹿鹿茸含有多种生理
活性物质 , 具有广泛的药理作用 [ 1] , 为盛誉国内外的常用名
贵滋补品和中药材。哺乳动物骨组织的生长是一个非常缓慢
的过程 , 而鹿茸作为特殊的骨组织 ,在快速生长期可达 2cm/
d,是哺乳动物任何组织和器官无法比拟的。由此 , 许多学者
推测 , 鹿茸的快速生长有它特殊的物质基础 , 其生长发育存在
自身的生长规律 [ 2] 。所以 , 鹿茸成为了研究哺乳动物细胞发
生 、生长与分化的理想材料 ,可作为模拟人和动物软骨内成骨
过程的最佳实验模型。大量的研究已证明 , 鹿茸的生长分化
中心位于其尖端 , 该处组织是生长因子和其它很多活性成分
含量较高的部位 [ 3] , 因此 , 实验所用鹿茸样品多选择鹿茸的
顶端。近年来国内外许多学者针对鹿茸化学成分及其药理作
用 [ 4] 、茸角的组织学结构 、鹿茸发生的生化生理机制 、控制鹿
茸形成的内分泌 、神经与激素调节机制 [ 5-6]以及鹿茸产品粗
加工等方面进行了研究。但有关鹿茸的分子遗传学背景资料
仍然缺乏 , 尚未见到有关鹿茸生长发育特异基因及其调控机
制的研究报道。随着分子生物学技术的发展和人类基因组计
1)黑龙江省自然科学基金(C200725)资助项目。
第一作者简介:郝丽 ,女 , 1977年 8月生 ,东北林业大学野生动物
资源学院 ,讲师 ,现东北林业大学在读博士研究生。
通信作者:李和平 ,东北林业大学野生动物资源学院 ,教授。
收稿日期:2009年 3月 18日。
责任编辑:张建华。
划的实施 ,一系列寻找新基因的方法也应运而生 ,而在众多方
法中 ,能得到完整的基因序列 , 比较可行和可靠的主要还是
cDNA文库筛选。笔者利用 SMART法构建了东北梅花鹿鹿
茸尖端组织的全长 cDNA文库 , 一方面为保存梅花鹿这一珍
贵物种的基因资源 , 另一方面为鹿茸生长发育相关基因全长
序列的克隆及其内在分子机制的研究奠定基础。
1　材料
动物组织　试验选取人工驯养的一头健康 4岁成年东北
梅花鹿为试验动物 , 在其生茸至二杠茸型时采集茸顶端组织
为试验样品。取样时 , 将鹿麻醉 ,用手术刀迅速切取鹿茸顶端
约 4cm组织(图 1), 用酒精棉擦去茸皮表面污物 , 对照文献
[ 7]对赤鹿生长顶端的分层方法(图 2), 切取真皮层 、间充质
层 、前软骨层和软骨层组织各 25mg,总共 100mg,于液氮保存。
　　图 1　鹿茸顶端切害示意图　　图 2　鹿茸生长顶端组织结构层次示意图
　　　　　　　　　　　　　　　　D.皮肤层;RM.间充质层;PC.前软骨层;
　　　　　　　　　　　　　　　　TZ.过渡层;C.软骨层。
DOI :10.13759/j.cnki.dlxb.2009.11.037
主要试剂　CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒购
自 Clontench公司。 RNA提取试剂盒 SVTotalRNAIsolation
System购自 Promega公司;DNAMarker购自 TaKaRa公司;
DEPC为 Sigma公司产品;琼脂糖购自 Gibco公司;胰蛋白胨 、
酵母提取物 、琼脂粉均购自 OXIOD公司;Taq酶购自 MBI公
司。
2　试验方法
总 RNA提取　取样品 , 快速放于液氮中研磨至粉末状
后 , 按 RNA提取试剂盒 SVTotalRNAIsolationSystem(Pro-
mega公司)操作说明书提取总 RNA。紫外分光光度仪 、琼脂
糖凝胶电泳检测总 RNA浓度和提取质量。
cDNA单链和双链的合成　取 3μL总 RNA(约 1μg)于
灭菌离心管中 , 按照试剂盒说明加入相应的试剂和引物 , 合成
cDNA第一链。采用 LD-PCR法合成双链 cDNA, 按照试剂
盒说明添加试剂和引物 ,反应在已预热到 95℃的 PCR仪上
进行。反应条件:95℃预变性 1min, 95℃变性 15 s, 68℃复
性延伸 6min, 共 22个循环。 取 5μL反应产物进行 1.1%琼
脂糖电泳鉴定。
蛋白酶 K与 SfiI限制性酶切消化　取 50μL双链 cDNA
的 PCR产物 , 加入 2μL蛋白酶 K(20g/L), 45℃温育 20 min
灭活 DNA聚合酶活性 ,用酚氯仿异戊醇抽提 , 乙醇 、醋酸钠 、
糖原室温沉淀;以 100μL体系于 50℃ sfi酶切提纯物 2h, 再
加入 1%的二甲苯氰 2μL,混匀备用。
cDNA片段分级分离及与 pDNR-LIB载体的连接　用
ChromaSPIN-400柱对酶切产物进行分级分离 , 每管收集 1
滴 , 共收集 16管 ,各取 3μL于 1.1%的琼脂糖凝胶上进行电
泳 , 回收 cDNA长度大于 500bp的收集管中的片段 , 经乙醇 、
醋酸钠 、糖原 -20 ℃共沉淀后 , 以 7 μL去离子水溶解。 将
cDNA片段与载体 pDNR-LIB在 T4 DNA酶的作用下 , 16℃
连接过夜。乙醇 、糖原于 -70℃下沉淀纯化连接产物 2 h, 后
用 5μLDEPC水溶解沉淀。
重组质粒的电转化　从冰箱中(-80℃)取出 50μL感
受态细胞 E.coliDH5α, 置于冰上解冻后 ,迅速加到上述连接
产物中 , 混匀 ,转移至已预冷的 0.1cm电极杯中 ,使用 BioRad
电转仪在 15kV/cm电压下电转 , 脉冲时间为 4.8s。电击后 ,
迅速用 945μL不含抗生素的 LB培养基洗出转化产物 , 于 37
℃、225r/min摇菌复苏 1h,得到的菌液即为原始文库。
文库的鉴定　分别取 1、1/10、1/100μL原始文库涂在含
30mg/L氯霉素的 LB培养板上 , 37℃过夜培养 , 检测文库滴
度。随机挑取 12个单菌落 , 使用 M13 -引物于 25μL体系中
进行菌落 PCR扩增 , 在 1.1%的琼脂糖凝胶上电泳确定文库
重组率和插入片段的大小。扩增条件为 94℃预变性 4min,
94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 2min, 32个循环 , 72℃延伸 7min。
3　结果与分析
3.1　总 RNA的纯度及完整性检测
经测定 ,提取的总 RNA其紫外吸收值 OD260 /OD280为 2.04,
经 1.1%的琼脂糖凝胶电泳结果(图 3)显示 , 28SrRNA和 18S
rRNA条带清晰 , 亮度比接近 2∶1, 表明获得的 RNA纯度较
高 , 没有基因组 DNA,并且总 RNA没有降解 ,比较完整。
3.2　dscDNA的合成及鉴定
合成的 dscDNA经 1.1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,产物电泳
呈现从小到大均匀分布的拖带 , dscDNA片段条带大小分布
范围 0.2 ～ 3.0kb(图 4), 主要集中于 500bp以上。
图 3　东北梅花鹿鹿茸尖端组织　　图 4　LD-PCR产物的琼脂糖
　　　总 RNA的凝胶电泳图谱　　　　　凝胶电泳图谱
　　　　　　　　　　　　　　　　 1.双链 cDNA;M.DNAmarker2000。
3.3　cDNA的分级分离
将 SfiI酶切的 cDNA经过 CHROMASPIN-400柱 , 除去
小于 500bp的小片段 cDNA, 收集剩余的大片段 cDNA, 以提
高文库的质量。 1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示 , 500bp以上
的片段主要集中在 7 ～ 10泳道所代表的收集管(图 5)。 因
此 ,合并 7 ～ 10管的 cDNA用于建库。
图 5　东北梅花鹿鹿茸尖端组织中 dscDNA过柱分级分离电泳图谱
1 ～ 16.分级分离后 LD-PCR产物;M.DNAmarker2000。
3.4　文库质量的鉴定
经测定 , 原始文库约得到 2.56 ×106个重组子。 随机挑
取 12个单菌落进行 PCR扩增 , 电泳结果显示(图 6), 插入片
段大小主要集中在 0.5 ～ 2kb之间 , 平均长度约 1.1 kb,重组
率达 100%, 基本达到文库质量要求。
图 6　PCR鉴定插入片段大小的电泳结果
1～ 12.cDNA插入片段;M.DNAmarker2000。
4　结论与讨论
经典的 cDNA文库构建方法由于存在文库中克隆片断短
和无效克隆多等缺陷 , 已不适应目前对低丰度 mRNA目的基
因的克隆和大规模 、高通量 、高效的功能基因组的研究需
要 [ 7] ,而全长 cDNA文库的构建可高效和大规模地获得基因
序列 ,并且序列大多数包括 3′和 5′端的非编码区 , 大幅度地
加快了计算机分析 、蛋白质表达和功能分析的进程 ,并实现了
121第 11期　　　　　　　　　　　　郝　丽等:东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长 cDNA文库的构建　　　　　　　　
对低丰度 Mrna基因的克隆 [ 8] 。目前 , 已经报道的全长 cDNA
文库构建方法有 Oligo-Capping法 、CAP-ture法 、CAP-
trappe法 、SMART法等 [ 9-10] 。但综合比较而言 , SMART法因
其具有简单 、快速的特点 ,已广泛应用于 cDNA文库的构建。
在建库过程中 , 总 RNA的纯度与完整性对于后续研究的
成功与否至关重要。 Wilfinger等认为 , 纯的 RNAOD260 /OD280
值应在 1.9 ～ 2.1之间 [ 11] 。本文提取的 RNA, 在琼脂糖凝胶
电泳上表现为 28S、18S2条清晰条带 , 且 28S∶18S约为 2∶1,
说明总 RNA完整性好 ,未被降解。 OD
260
/OD
280
值为 2.04, 说
明纯度很高。
本文库构建时所选择的载体为 pDNR质粒 , 作为载体 , 质
粒与噬菌体相比 , 操作简单 、可塑性强 , 这对于组织的大规模
EST测序非常有利 , 而且 pDNR质粒载体能在原核中表达。
由于 loxP位点中含有原核的 T7启动子 ,因此 ,筛选到的基因
可直接转化至原核生物中进行蛋白质表达 [ 12] 。
电转化的效率是热转化效率的 100倍 ,而对于构建文库
而言 , 转化效率直接影响文库构建的成败。 试验选用 E.coli
DH5α感受态细胞进行电转化 , 获得了较好的转化效率。在
电转化之前要特别注意连接反应液中的离子浓度 , 最好使用
纯化后的连接产物 , 以减少离子干扰 ,防止细胞在高电压下的
爆裂。
cDNA文库的质量具体反映在 2个方面 [ 13]:文库的库容
量和重组 cDNA片段的大小。本试验所构建的原始文库约含
有 2.56×106个重组子 ,包括了大部分稀有的 mRNA,可以满
足大规模 EST测序的需要 ,另外 , 插入片断大小基本都在 0.5
kb以上 , 平均长度为 1.1kb, 保障了高比例全长 cDNA的获
得。
研究中采用 SMART技术成功构建了东北梅花鹿鹿茸生
长与分化最快的尖端组织(茸角生长分化中心)的 cDNA文
库 ,该文库可以用来克隆鹿茸生长发育的特异全长基因或其
他相关基因 ,为鹿茸生长发育的人工调控及从基因水平上对
茸用鹿进行遗传选择提供科学的依据。
参　考　文　献
[ 1] 　陈雪龙.鹿茸的药理作用及其研究进展 [ J] .四川畜牧兽医 ,
2008, 35(1):29-30.
[ 2] 　岳占碰 ,邓旭明 ,冯海华.鹿茸角发育与再生机理 [ J] .经济动物
学报 , 2005, 9(1):46-49.
[ 3] 　LiC, SutieJM.Tissuecolectionmethodsforantlerresearch[ J] .
EuropeanJournalofMorphology, 2003, 41(1):23-30.
[ 4] 　汪树理 ,孙继红 ,李晓红 ,等.东北梅花鹿茸不同部位多糖与无
机元素质量分数的差异 [ J] .东北林业大学学报 , 2008, 36(5):
58, 66.
[ 5] 　李长生 ,王喜萍 ,马丽娟.梅花鹿茸角生长规律与体内激素关系
的研究进展 [ J] .中国草食动物 , 2001, 3(6):36-38.
[ 6] 　高志光.梅花鹿鹿茸生长速度与睾酮 、雌二醇关系的研究 [ J] .
经济动物学报 , 1999, 3(3):27-30.
[ 7] 　EndegeWO, SteinmannKE, BoardmanLA, etal.Representa-
tivecDNAlibrariesandtheirutilityingeneexpressionprofiling
[ J] .BioTechniques, 1999, 26(3):542-548, 550.
[ 8] 　董志敏 ,张宝石 ,关荣霞 ,等.全长 cDNA文库的构建方法 [ J] .
中国农学通报 , 2006, 22(2):51-55.
[ 9] 　毛新国 , 景蕊莲 , 孔秀英 ,等.几种全长 cDNA文库构建方法比
较 [ J].遗传 , 2006, 28(7):865-873.
[ 10] 　杨锡明 , 高磊 ,栾静.获取基因全长 cDNA的方法及其进展
[ J] .现代检验医学杂志, 2005, 20(3):80-83.
[ 11] 　WilfingerWW, MackeyK, ChomczynakiP.EfectofpHandi-
onicstrengthonthespectrophotometricassessmentofnucleicacid
purity[ J] .BioTechniques, 1997, 22(3):474-476, 478-481.
[ 12] 　王绍海 ,刘勇 ,宫伟雁 ,等.人胎儿骨膜全长 cDNA文库的构建
及测序 [ J] .医学分子生物学杂志 , 2007, 4(4):319-323.
[ 13] 　SchulerGD.Piecesofthepuzzleexpressedsequencetagsandthe
catalogofhumangenes[ J] .JMolMed, 1997, 75:694-698.
(上接 119页)相关:空气污染严重 、土壤质地差 、人为活动量
大等都对雪松生长不利 , 从而加剧了病害的发生 , 这与胡薇
宁 [ 3]的研究结果类似。此病害在雪松大树 、中树 、小树上均
可发病 , 但其中以大树发病最为严重:树龄越高发病越趋于严
重。行道树发病率较高 ,其次为公园。在保定地区的 4月开
始发病 , 4月上旬至 5月中旬达到高峰 , 直至 6月中旬 , 秋季 8
月底又有一次小的发病高峰。
通过柯赫氏人工诱发试验鉴定雪松枝枯病的病原是由球
壳孢目(Sphaeropsidales)的小穴壳属(Dothiorelasp.)所致。
病原小穴壳菌能在多种碳源中生长但在麦芽糖培养基生长最
快;在氮源培养基中 ,蛋白胨培养基最适宜其生长。
雪松枝枯病在不同地区可能由多种病原引起:西北农林
科技大学的高智辉等 [ 1]对陕西关中地区雪松进行调查研究 ,
鉴定出该病是由子囊菌亚门的茶藨子葡萄座腔菌(Botryo-
sphaeriaribis)所致 , 无性型为半知菌亚门的聚生小穴壳菌
(Dothiorelagregaria)。河南农业大学的郑文明等 [ 2]对濮阳 ,
郑州两地进行调查 , 其初步研究结果病原菌是聚生小穴壳菌
(Dothiorelagregaria);病菌生长最适温度为 25 ～ 30 ℃;单糖 、
双糖 、多糖均可作为良好碳源被病菌吸收利用。保定市园林
局的胡薇宁等 [ 3]在东风公园通过调查发现其病原菌为樟疫
霉菌(PhotophoracinnamoinRanas);病菌通过风雨传播 、伤口侵
入 ,引起枝枯或整株枯死。山东省济南市园林科学研究所的吴玲
等 [ 4]对济南市的雪松进行研究测定该病是由松色二胞菌(Diplo-
diapineaKickx)所致;病菌通过自然孔口 、伤口侵入。
由于雪松枝枯病在当地还未大面积发生 , 所以尚未引起
足够的重视 , 但该病在山东 、河南 、江苏等地已经大发生 ,这说
明雪松枝枯病有进一步扩大蔓延的潜在可能和趋势 , 因此应
该对该病的防治加以重视 , 控制其蔓延发展。为了有效的控
制雪松枝枯病在本地区的发展和蔓延建议采取加强苗木管
理 ,及时浇水 、施肥以增强树势 , 发现病枝或死树及时清除销
毁;在起苗 、假植和定植以及苗木调运过程中尽可能减少水分
蒸发 ,尽量避免伤口;在雪松枝枯病的发病高峰期尽量不要调
运和移植苗木;用 50%多菌灵 、70%甲基托布津 、 50%代森锰
锌 500倍 , 40%福美砷 100倍在发病过程使用 ,可以有效的防
治雪松枝枯病 [ 1] 。
参　考　文　献
[ 1] 　高智辉 ,王云果 ,韩丽 ,等.雪松枝枯病病原和生物学特性研究
[ J] .西北林学院学报 , 2005, 20(3):127-130.
[ 2] 　郑文明 ,任国兰 ,王玉峰.雪松枯梢病研究初报 [ J] .河南农业大
学学报 , 1996, 30(1):46-49.
[ 3] 　胡薇宁 ,赵永立 ,王春和 ,等.雪松枝枯的病因及防治 [ J] .河北
林果研究 , 2002, 17(2):166-168.
[ 4] 　吴玲,薜玲.雪松枯梢病的研究[ J] .森林病虫通讯 , 1995(1):1-3.
[ 5] 　魏景超.真菌鉴定手册 [ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1979:
406-430.
[ 6] 　邵立平 ,沈瑞祥 ,张素轩, 等.真菌分类学 [ M].北京:中国林业
出版社 , 1984:329-334.
[ 7] 　陆家云.植物病原真菌学 [ M] .北京:中国农业出版社 , 2001:
226.
122 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 37卷