全 文 ：蚕砂提取物联合环孢菌素 A治疗
再生障碍性贫血的实验研究
巨君芳 1　魏克民 2■
(1杭州市中医院·杭州 310007　2浙江省中医药研究院·杭州 310006)
摘　要　目的:研究蚕砂提取物联合环孢菌素 A治疗再障的作用机制。方法:建立免疫介导的小鼠再障
模型 ,随机分为 4组 ,每组 10只。对照组胃饲生理水 , SCC组胃饲 SCC, CsA组胃饲 CsA, SCC+CsA组胃
饲 SCC+CsA,连续胃饲 13天 , 检测外周血象及外周血 CD3 +、CD4 +、CD8 +、TNF-α、IFN-γ、IL-6水平。
结果:蚕砂提取物联合环孢菌素 A灌胃 ,可提高小鼠外周血白细胞 、血红蛋白 、血小板 ,有效调节再障小鼠
外周血 CD3 +、CD4 +、CD8 +、TNF-α、IFN-γ、IL-6水平。结论:蚕砂提取物联合环孢菌素 A治疗再障具
有协同增效作用。
主题词　贫血 ,再生障碍性 /中西医结合疗法　蚕砂提取物 /治疗应用　环孢菌素 A/治疗应用　小鼠
■通讯作者
　　再生障碍性贫血(aplasticanemia, AA)简称再障 , 是一组
由化学 、生物 、物理因素及不明原因引起的骨髓造血功能衰
竭 , 导致以全血细胞减少为特征的综合征。再障与造血干细
胞损伤 、骨髓造血微环境异常 ,以及免疫功能紊乱有关 , 目前
西医治疗常用环孢菌素 A, 但是价格昂贵 , 许多再障患者常
常因此不能得到积极 、正规的治疗。中医对于再障主要从肾
论治 , 治则以补肾为主 , 辅以滋阴 、温肾 、健脾 、活血化瘀等。
国家级名老中医魏克民教授根据蚕砂治疗 “血瘀 ”、“血少”
的理论 , 制成蚕砂提取物叶绿素铜钠盐(SodiumCopperChlo-
rophyl, SCC)临床治疗再障疗效满意 [ 1] 。本实验旨在研究
蚕砂提取物联合环孢菌素 A治疗再障的协同增效作用 , 以
期在进一步提高再障临床疗效的同时 ,可以明显降低治疗费
用。
1　材料
1.1　实验动物　BALB/c小鼠 , 8 ～ 12周龄 , 体重 16 ～ 20g,
雌雄不限 , 作为受体;DBA/2小鼠 , 8 ～ 10周龄 , 体重 16 ～
20g, 雌雄不限 ,作为供体 , 由中国科学院上海实验动物中心
提供。
1.2　实验药品及配制　新山地明胶囊(环孢菌素 A):
10mg/粒 , NovartisPharmaGmbhGermany生产 , 进口药品注
册证号:H20050271, 批号:S0001, 灌胃前用生理盐水将其配
成 1mg/ml溶液。蚕砂提取物(SCC):由浙江省中医药研究
院提供 , 用生理盐水配制成 3mg/ml、 6mg/ml。
2　方法
2.1　造模方法　根据姚氏方法 [ 2] ,取 DBA/2小鼠 , 断头处
死 , 75%酒精浸泡消毒 5分钟后 ,无菌取出胸腺及腋下 、腹股
沟等处的淋巴结 , 加 RPMI-1640培养基 , 除去表面血污及
黏附的结缔组织 , 再次清洗后 , 用手术刀 、剪刀反复剪切组
织 , 直到成糊状 ,再轻轻研磨 , 用 200目钢网过滤 ,使之成为
单细胞悬液 ,计数后配成 5×106 /ml浓度 , 其胸腺细胞∶淋巴
细胞为 1∶2。取 1滴苔盼蓝滴入玻片上 , 鉴定细胞活性 >
95%。
在浙江大学农学院动物辐照中心 , 受体 BALB/c小鼠
经 60Coγ-射线 5.5Gy(1.1Gy/min×5min)做一次全身照射 ,
亚致死剂量照射后 2小时内 , 立即尾静脉输注上述供体
DBA/2小鼠细胞悬液 , 每只小鼠输注 0.2ml, 制成再障动物
模型。
2.2　实验分组及给药　将 BALB/c小鼠随机分为 4组 , 每
组 10只 , 即模型组 、蚕砂提取物组(SCC组)、环孢菌素 A组
(CsA)、蚕砂提取物 +环孢菌素 A组(SCC+CsA)。 模型组
胃饲生理水 0.3ml/d, SCC组胃饲 SCC(6mg/ml)0.3ml/d,
CsA组胃饲 CsA(1mg/ml)0.3ml/d, SCC+CsA组胃饲 SCC
(3mg/ml)0.15ml/d+CsA(1mg/ml)0.15ml/d, 连续胃饲 13
天。
2.3　观察指标及检测
2.3.1　外周血白细胞 、血红蛋白 、血小板检测　13天后 , 各
组小鼠断头处死 , 摘取右侧眼球 , 取血 , EDTA抗凝 , 用法国
HYLEL血细胞分析仪检测血常规。 外周血白细胞 、血红蛋
白 、血小板三系。
2.3.2　T细胞亚群检测　取血 50μl, EDTA抗凝 , 分别加入
PE标记的抗 CD+4 单抗 10μl、FITC标记的抗 CD+3 单抗 10μl
于检测管中 , PE标记的抗 CD+8 单抗 10μl、FITC标记的抗
CD+
3
单抗 10μl于检测管中 , 4℃保存 , 30分钟 , 混匀 ,加溶血
剂 1ml溶血 10分钟 , 加 PBS4ml混匀 , 3000r/min离心 5分
钟 ,取上清液 , 沉淀 , 加 500μlPBS,混匀 , 上机检测 , Celquest
软件获得 10000个细胞分析 , 检测小鼠外周血中 CD+3 、CD+4 、
CD+8 细胞 ,并计算 CD+4 /CD+8 细胞比值。
2.3.3　IFN-γ、TNF-α、IL-6检测　采用 ELISA法(夹心
酶联免疫吸附法)。观察满 13天的每组 10只 BALB/c小
鼠 ,断头处死 , 摘取右侧眼球 , 取小鼠静脉血 0.8 ～ 1.0ml, 分
·513·中国中医药科技 2010年 11月第 17卷第 6期 Nov.2010 Vol.17 No.6
离血清 , 4℃保存 , 3000r/min离心 5分钟 , 取上清液 , 严格按
试剂盒说明书操作。
2.4　统计学处理　所有数据以(x±s)表示 ,组间比较采用 t
检验。
3　结果
3.1　各组小鼠外周血象的变化　见表 1。
表 1 各组小鼠外周血象的变化(x±s, n=10)
组别 WBC(×109 /L) 　Hb(g/L) PLT(×109/L)
正常组 3.66±0.83 129.6±4.75 829.7 ±48.09
模型组 1.92±0.85＊＊ 95.9±21.25＊＊ 319.3 ±306.73＊＊
SCC组 1.96±1.82 107.6±16.58■ 447.9 ±304.72＊■
CsA组 2.33±1.74■ 104.1±9.37 456.9 ±159.79＊＊■
SCC+CsA组 2.20±0.82 119.2±10.15＊■■☆★ 596.8 ±265.35＊■★
　　与正常组比较＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与模型组比较■P<0.05, ■■P<0.01;与
SCC组比较☆ P<0.05, ☆☆ P<0.01;与 CSA组比较★P<0.05,★★P<0.01
3.2　各组小鼠外周血 T细胞亚群的变化　见表 2。
表 2 各组小鼠 CD+3 、CD+4 、CD+8 、
CD+4 /CD+8 的比较(x±s, n=10)
组别 CD+3 (%) CD+4 (%) CD+8 (%) CD+4 /CD+8
正常组 17.18±4.43 37.36±3.65 5.27±2.02 7.37±0.52
模型组 38.18±10.97＊＊ 20.58±5.69＊＊ 10.06±2.71＊＊ 2.30±1.57＊＊
SCC组 29.18±25.19＊＊ 22.43±1.44＊＊ 6.43±2.29 3.47±1.43＊
CsA组 27.92±5.66＊＊ 18.28±4.25＊＊ 9.24±2.97＊ 2.96±1.54＊＊
SCC+CsA组 20.20±23.19＊＊■ 29.29±5.18＊■☆☆★ 6.30±2.64■■★ 3.87±1.45＊＊■
　　与正常组比较＊ P<0.05 , ＊＊P<0.01;与模型组比较■P<0.05 , ■■P<0.01;与 SCC组比较
☆P<0.05 , ☆☆P<0.01;与 CSA组比较★P<0.05,★★P<0.01(下同 )
3.3　各组小鼠外周血细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-6的
变化　见表 3。
表 3 各组小鼠外周血 IFN-γ、TNF-α、
IL-6水平的比较(x±s, n=10)
组别 IFN-γ(pg/ml) TNF-α(pg/ml) IL-6(pg/ml)
正常组 13.60±8.91 　 8.16±3.23 9.40 ±0.91
模型组 73.16±26.22＊＊ 193.36±85.18 ＊＊ 61.68 ±13.36＊＊
SCC组 47.08±16.70＊＊■ 126.96±81.27＊＊ 38.50 ±13.33＊＊■■
CsA组 51.87±11.26＊＊■ 84.27±22.11＊＊■ 37.53 ±13.52＊＊■■
SCC+CsA组 37.96±14.87＊＊■☆ 71.30±39.96＊＊■■★ 36.62 ±12.27＊＊■■
4　讨论
本实验研究证实 , 蚕砂提取物联合环孢菌素 A能促进
AA模型小鼠造血功能 , 提高小鼠外周血白细胞 、血红蛋白 、
血小板 , 疗效优于单用蚕砂提取物 ,或者单用环孢菌素 A, 蚕
砂提取物与环孢菌素 A合用可以产生协同增效作用 , 纠正
免疫功能异常 , 使增生的造血干 /祖细胞免受抑制性 T淋巴
细胞阻碍 , 骨髓造血功能得到恢复。
蚕砂性温 、味甘辛 、入肝脾胃经 , 具有祛风除湿 、活血通
络 、镇静安神等功效。古代常用来治疗 “血虚” 、“血瘀” 、“血
劳”症。清·赵其光《本草求源》载 “晚蚕砂治血虚不能养经
脉。” 清·叶桂 《本草再新》载 “蚕砂治血瘀血少” 。从蚕砂
提取物分子结构为由 4个吡咯环组成的卟啉环 ,与血红蛋白
结构相似 , 能参与血红蛋白的合成 , 促进生血。蚕砂提取物
以治疗血虚为主 ,当再障患者发生出血 、食欲不振 、白细胞过
低 、血小板过低时 , 可以随症加减 , 调整免疫功能 , 特别是促
进 CD+
4
回升 , CD+
4
/CD+
8
比值恢复 ,从而解除 CD+
8
细胞对造
血干细胞的抑制 ,改善贫血。
细胞免疫功能紊乱参与了 AA的发病 , AA患者骨髓及
外周血中 T细胞亚群失调 , 异常增高的 CD+8 抑制骨髓造血
功能 ,分泌造血负调控因子 , 激活的 CD+8 细胞及其分泌的
IFN-γ、TNF-α等细胞因子可以直接诱发造血干 /祖细胞
凋亡 [ 3] 。
IFN-γ、TNF-α是两种造血负调控因子 , 主要由 T淋
巴细胞分泌。 AA患者骨髓及外周血中 IFN-γ、TNF-α水
平明显升高是 AA患者造血功能衰减的原因之一 [ 4] 。 IL-6
是具有多种功能的造血调控因子 ,主要作用于早 、中期造血
干 /祖细胞的增殖和分化 , IL-6又是 T淋巴细胞 、B淋巴细
胞增殖 、分化以及活化的重要调节因子 , 并与其他细胞因子
一起参与激活免疫效应细胞对造血干 /祖细胞的破坏。造血
因子 IL-6代谢紊乱是 AA的一个重要病理环节 [ 4] 。本研
究表明 , AA模型小鼠外周血和骨髓中 IFN-γ、TNF-α及 IL
-6水平上升明显 ,蚕砂提取物能够降低 AA模型小鼠外周
血及骨髓 IFN-γ、TNF-α含量 , 有效降低 IFN-γ、TNF-α
对造血干 /祖细胞的抑制作用。蚕砂提取物还能明显降低
AA模型小鼠血及骨髓 IL-6含量 ,纠正造血因子 IL-6的
代谢紊乱 ,减少 IL-6与 IFN-γ、TNF-α联合作用破坏造
血干 /祖细胞 [ 5] 。由此提示蚕砂提取物可能通过调节 IFN-
γ、TNF-α及 IL-6, 改善造血功能 [ 6] 。
蚕砂提取物与环孢菌素 A联合使用 , 具有协同增效作
用 ,疗效明显优于单用 CsA治疗。因 CsA价格昂贵 , 家庭经
济困难的患者常不能承受。所以 ,对经济困难的患者采用蚕
砂提取物联合 CsA方案治疗 , 明显降低治疗费用 , 减轻患者
家庭及社会的经济负担 , 值得大力推广。
　　参考文献
1　林庚庭 , 魏克民 , 梁卫青 , 等.叶绿素铜钠盐对 AA模型小鼠的
实验研究.中医研究 , 2007, 1(1):78.
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syndrome.PediaerHematolOncel, 2006, 28(7):450.
4　DufourC, CorcioneA, SvahnJ, etal.TNF-αandIFN-γare
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5　张涛 ,孙秉中 , 冯琪 , 等.急慢性再生障碍性贫血患者 IFN-γ、
TNF-α及 IL-4诱生水平的对比研究.中华血液学杂志 , 2000,
21(10):530.
6　林庚庭 , 魏克民 , 梁卫青 , 等.蚕沙提取物对再生障碍性贫血小
鼠细胞因子影响的实验研究.中国中医药科技 , 2008, 3(2):
117.
(修回:2010-09-10)
更正　本刊 2010年第 17卷第 5期第 467页“尹海英 ”文章第 10～ 11行 “对照组 29例 ,有效 64例 ”应为 “对照组 80例 ,有效 29例 ”,特此更正。
·514· 中国中医药科技 2010年 11月第 17卷第 6期 Nov.2010 Vol.17 No.6