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收稿日期:2012-11-02; 修订日期:2013-05-03
基金项目:国家自然科学基金( No． 31200265) ;
西南林业大学校重点基金项目( No． 111123) ;
云南省教育厅重点项目( No． 50117015)
作者简介:闫晓慧( 1980-) ，女( 汉族) ，辽宁朝阳人，现任西南林业大学林
学院讲师，博士学位，主要从事植物化学成分及生物活性研究工作．
* 通讯作者简介:谈 锋( 1942-) ，男( 汉族) ，江苏常州人，现任西南大学
生命科学学院教授，博士研究生导师，学士学位，主要从事药用植物生物
技术与生化工程研究工作．
狭叶松果菊的毛状根诱导及培养
闫晓慧1，胡世俊1，谈 锋2*
(1．西南林业大学林学院，云南 昆明 650224; 2．西南大学生命科学学院，重庆 400715)
摘要:目的 利用两种发根农杆菌 A4，Ｒ1000 诱导狭叶松果菊产生毛状根，建立狭叶松果菊的毛状根培养体系。方法 利
用共培养法研究不同外植体、菌株、预培养时间和浸染时间等对狭叶松果菊毛状根诱导率的影响和不同液体培养基对毛
状根生长的影响筛选出最佳培养基。结果 利用发根农杆菌 Ｒ1000，预培养 48 h的叶柄为转化材料，浸染 10 min 的诱导
率最高，毛状根悬浮培养的最佳培养基为 1 /2MS + IBA0． 5 液体培养基。结论 狭叶松果菊毛状根离体培养体系的建立，
为狭叶松果菊的次生代谢产物的大规模生产奠定了基础。
关键词:狭叶松果菊; 毛状根; 次生代谢产物
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 08． 083
中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 08-1990-02
Induction and in vitro Culture of Echinacea angustifolia Hairy Ｒoots
YAN Xiao-hui1，HU Shi － jun1，TAN Feng2*
( 1． College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China; 2． School of Life Science，South-
west University，Chongqing 400715，China)
Abstract: Objective To induce hairy roots of Echinacea angustifolia by two strains of Agrobacterium rhizogenes A4 and Ｒ1000
and establish an in vitro culture system of the hairy roots． Methods Hairy roots were induced by coculture Effects of explants，
Agrobacterium rhizogenes，preculture time along with infecting time on the induction rate and effects of different basic media on
growth of hairy root were studied． Ｒesults The highest induction rate was obtained from leaves with 48h preculture which were in-
duced by Ｒ1000 for 10min． The growth of hairy root could be raised by 1 /2MS medium with 0． 5 mg /L IBA． Conclusion Estab-
lishment of Echchina angustifolia hairy root culture can provide a foundation for the industrial production of active drug compo-
nent．
Key words: Echinacea angustifolia; Hairy roots; Secondary metabolism
狭叶松果菊 Echinacea． angustifolia(也称松果菊) ，是菊科
(Compositae)紫菀族(Aster family)松果菊属(Echinacea)植物，原
产美洲，是印地安人的传统草药，被用作治疗外伤、蛇咬、头痛及
感冒已有上百年的历史［1］。最近的研究表明松果菊提取物还有
抗氧化、抗衰老、调控细胞凋亡 ，抗肿瘤等作用［2，3］(Di Carlo G
等，2003)。其疗效得到了越来越多的临床肯定，是国际市场上需
求量最大的植物药之一。研究表明松果菊的有效成分为酚酸类
物质和多糖，主要包括松果菊苷、菊苣酸、咖啡酸、绿原酸以及 4
－ O －甲基葡糖醛 －阿拉伯糖 －木聚糖、阿拉伯糖 －鼠李半乳聚
糖等多糖，这些活性成分通过增加细胞的数量，提高非特异免疫，
是国际市场最受欢迎的免疫调节剂［4］。目前我国北京、沈阳、山
东等地已成功引种松果菊［5］。由于狭叶松果菊的深度休眠性种
子萌发率极低，从而给松果菊的发展带来很大困难。我们曾以种
子为材料进行组织培养，实现了狭叶松果菊的离体快繁［6］。
发根农杆菌感染植物寄主后，在植物感染部位会被诱导长出
许多毛状根。这种根具有生长迅速、遗传性能稳定、次生代谢产
物产生能力强等诸多优点，使得这一培养系统在中药有效成分的
生产方面越来越受到重视。目前国内外许多植物毛状根培养体
系已经建立，并开始进行次级代谢产物的生产［7 ～ 12］。毛状根培养
技术已被认为是生产药用植物次生代谢产物的一条重要途径，具
有广泛的应用前景。本文利用 A4 和 Ｒ1000 两种发根农杆菌对
原产北美的具有免疫功能的狭叶松果菊进行了转化并诱导出毛
状根，经 PCＲ检测，证明 Ｒi质粒中 rol c 基因已整合在毛状根的
基因组中实现遗传转化。考察了不同激素及添加前体物质苯丙
氨酸对悬浮培养毛状根生长及其次生代谢产物松果菊苷和绿原
酸的含量影响，为今后利用毛状根悬浮培养来生产狭叶松果菊次
生代谢产物奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 菌种的活化 供试发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌
株:A4，Ｒ1000。无菌条件下，接种针挑取保存菌液，于相应的平
板上划线培养，28℃暗培养，直到长出单菌落大约需要 1 ～ 2 d。
挑取一个单菌落接种于 50 ml附加有 50 mg /L卡那霉素(Kan)的
YEB培养液中 28℃，黑暗条件下 180 r /min 摇床转速下培养，进
行第一次活化。培养 24 h左右待菌悬液 OD 值为 1． 0 左右时取
1 ml 菌液加入 50 ml 的 YEB 液体培养基中进行第二次活化，
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28℃，180 r /min暗培养 12 h，至菌液 OD值为 0． 6 ～ 0． 8 此时表明
农杆菌已达到生长对数期，可用于浸染外植体。
1． 2 外植体的预培养 无菌条件将狭叶松果菊无菌苗的叶片剪
成 2 cm2 大小的切段，将叶柄剪成 2 cm 长大切段。将这些切段
于添加了 20 mg /L乙酰丁香酮(AS)的 MS培养基上置于 25 ℃培
养箱中，黑暗条件下预培养 2d后用于浸染。
1． 3 浸染与共培养 在超净工作台上，用灭菌的针头将预培养的
外植体表面扎一些伤口以增加浸染效果，然后将外植体转移到灭
菌的培养皿中，将制备好的浸染菌液倒入其中，浸染 10 min，期间
要不时摇动培养皿使外植体与农杆菌能充分接触。浸染结束后
取出外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，接种到含乙酰丁香酮
(AS)20 mg /L的 MS固体平板上，于黑暗、25 ℃条件下共培养 2
d。
1． 4 毛状根诱导及除菌培养 将共培养 2 d 后的外植体用无菌
水清洗两遍，无菌滤纸吸干表面的多余水分后，将其转接到含有
头孢噻肟钠(Cef)500 mg /L 或 300 mg /L 的羧苄青霉素(Cb)的
MS除菌平板培养基上，于 25℃黑暗条件下进行毛状根的诱导培
养。
当诱导出来的毛状根长到 3cm 左右时，将毛状根剪下，于含
有的 500 mg /L Cef的 MS培养基上进行除菌培养，每隔一周继代
一次，继代培养 4 ～ 5 次后，待除菌彻底后，将其转移到不含抗生
素的 1 /2MS培养基上，进行繁殖每一根为一个克隆分别扩繁。
1． 5 毛状根的 PCＲ 分子检测 用 CTAB 法提取毛状根的总
DNA［13］，以非转化植株毛状根总 DNA 作为对照。根据文献［14］
合成了 rolC基因的引物:P1:5＇－ CTCCTGACATCAAACTCGTC － 3
＇;P2:5＇ － TGCTTCGAGTTATGGGTACA － 3 ＇预期产物长度为 624
bp。
2 结果与分析
2． 1 两种农杆菌诱导效果的比较 分别采用 A4，Ｒ1000 两种发
根农杆菌对狭叶松果菊叶片及叶柄切断进行了毛状根诱导。20d
后，伤口部位陆续分化产生毛状根，两种发根农杆菌诱导的效果
差异显著，表 1 是两种农杆菌诱导率的比较(诱导 30d 统计的结
果)。
表 1 两种发根农杆菌对狭叶松果菊毛状根诱导效果比较
农杆菌
菌株
感染外植
体数
诱导生根的
外植体数
生根率
(%)
A4 23 9 39． 1
Ｒ1000 22 18 81． 8
对照 10 0 0
Ｒ1000 的诱导为 81． 8% 明显高于 A4 的 39． 1% 。A4 诱导
产生的毛状根一般直接从伤口处长出，切口处不愈伤化见图 1;
而经 Ｒ1000 浸染的外植体切口先愈伤化，毛状根从愈伤组织上
长出，见图 2。且经 Ｒ1000 诱导的外植体平均生根数要高于 A4
诱导的平均生根数。
2． 2 不同外植体的诱导效果比较 以组培苗的叶片及叶柄切段
为材料，按两种方法预培养。一种先在含有 2，4 － D1mg /L的 MS
固体平板上培养 2 周，使其产生少量愈伤组织后转入毛状根预培
养的培养基上培养两天;另一种切下后直接按诱导毛状根的方法
预培养 2d。同时用农杆菌 Ｒ1000 浸染两种外植体，两周以后经
2，4 － D诱导产生愈伤组织的外植体首先长出根，平均每个外植
体生根 3 条以上。图 3 是上述两种处理方法诱导出的毛状根比
较。
表 2 是两种材料的诱导率，试验结果表明在含有 2，4 － D1
mg /L的 MS固体平板上预培养产生愈伤组织有利于农杆菌的转
化。
2． 3 毛状根的分子检测 取 2 个转化根克隆各 200mg 以及未转
化的根 200mg，按照前面所提的方法，提取 DNA。制备成检测样
品。同时提取 Ｒi质粒制备阳性对照。电泳显色后，在 UVP 成像
系统上观察 DNA条带并拍照。其结果如图 4。
图 1 A4 诱导的毛状根 图 2 Ｒ1000 诱导的毛状根
图 3 两种处理诱导效果比较
(左为经 2，4 － D预培养的)
表 2 两种外植体诱导效果的比较
外植体类型 感染外植体数 生根的外植体数 平均生根数 生根率(%)
2，4 － D预培养 20 19 4． 50 95
未预培养 20 16 1． 75 75
对照 20 0 0． 00 0
图 4 狭叶松果菊毛状根 PCＲ检测结果
从图 4 中我们可以看出，根据设计的一对引物分别对狭叶松
果菊毛状根进行 PCＲ 检测，结果出现了预期的条带(624bp) ，而
空白对照和自然根则没有扩增出条带，初步说明农杆菌的 T －
DNA已经整合进毛状根的基因组中。两种农杆菌对狭叶松果菊
的转化均获得成功。
2． 4 毛状根的悬浮培养 考察了四种培养基:1 /2MS + IBA
0． 1ppm;1 /2MS + IBA0． 5ppm;1 /2MS + 2，4 － D 0． 5ppm;1 /2MS
+ NAA0． 5ppm对悬浮培养根生长的影响，如图 5 所示，不同的激
素添加对根的形态有显著的影响，添加 2，4 － D和 NAA的培养基
会使根的生长严重的愈伤化，而添加 0． 5ppm 的培养基对根的生
长有显著的促进作用，因而最适于毛状根悬浮培养基为 1 /2MS +
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IBA0． 5ppm。
图 5 不同培养基的悬浮培养根形态
3 讨论
在本实验中，两种发根农杆菌感染狭叶松果菊外植体，20d
后，伤口部位均会产生毛状根。大部分已报道的双子叶植物毛状
根，一般在感染后 10d左右便会产生。相比之下狭叶松果菊毛状
根的诱导时间比较长。这说明不同的植物，毛状根的诱导周期是
不同的。所以对不同植物，感染后的观察时间也应相应变化。与
大多数文献报道一致，不同菌株对植物的感染能力不同，对于狭
叶松果菊来说，Ｒ1000 的转化能力更强，高于 A4。通过观察发现
叶柄外植体的转化效果要高于叶片，说明外植体类型对转化的效
果有影响。通过 2，4 － D 预培养可以提高毛状根的诱导率及外
植体的生根数，并且能缩短诱导的时间，表明预培养条件对毛状
根的转化影响显著，有必要进一步探索不同的预培养条件，建立
最优的转化体系。
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收稿日期:2012-11-14; 修订日期:2013-04-22
桔梗自毒作用初步研究
祝丽香1，毕 胜2，刘 燕1
(1．山东农业大学农学院，山东 泰安 271018; 2．山东中药技师学院，山东 泰安 271000)
关键词:桔梗; 自毒作用
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 08． 084
中图分类号:Ｒ282． 71 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 08-1992-03
近年来，由于中药材需求不断增加，实行连作或复种的面积
越来越大，连作障碍成为制约我国中药栽培的主要问题。桔梗
(platycodon grandiflorum)属于不耐连作的植物。从产地调查发
现，连作地块桔梗长势弱、病虫害严重，连作 6 年基本绝产。随着
桔梗栽培面积逐渐扩大，连作障碍日益严重。长期以来，桔梗生
产主要致力于提高栽培技术和防治病虫害等方法来缓解连作障
碍［1，2］，效果并不理想，其中的重要原因是对其连作障碍的机制
尚未清楚。因此，明确桔梗连作障碍形成原因对克服桔梗连作障
碍非常重要。目前还没有关于桔梗连作障碍方面的报道。研究
人员对当归［3］、地黄［4］、伊贝母［5］等药用植物研究发现，自毒作
用是导致药用植物产生连作障碍的主要原因之一。桔梗是否存
在自毒作用，即前茬桔梗是否通过根系分泌、地上部淋湿、残茬腐
解等途径产生有害物质而直接影响下茬桔梗生长目前还不清楚。
以往研究表明，种子萌发特性影响田间出苗率，幼苗生长则直接
影响到植株的长势、产量和品质，而且幼苗期是化感自毒作用发
生的敏感期［6，7］。因此，本实验将桔梗全株用不同溶剂提取，获
得提取物进行生物测定，研究提取物中是否存在抑制桔梗种子萌
发和幼苗生长的物质。旨在探讨桔梗是否存在自毒作用，为阐明
桔梗连作障碍产生原因提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 桔梗采自山东农业大学药用植物栽培基地，将健康干
净的新鲜植株晒干，按全株、根、茎、叶、花、果实分类并自然风干。
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 8 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 8