全 文 ：HPLC法测定雪上一枝蒿中 2种生物碱的含量
耿家玲 1 ,孟芹 1 ,沈勇 2 ,付敏3
　第一作者　Tel:13708702580;E-mail:ynkmgjl@126.com
(1.云南省食品药品检验所 , 昆明 650011;2.昆明植物研究所 , 昆明 650204;3.昆明市中医院 ,昆明 650011)
摘要　目的:建立高效液相色谱法测定雪上一枝蒿药材中雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素的含量。 方法:色谱柱为 C18柱
(250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相为乙腈 -水(1000mL水中加三乙胺 0.1mL,并用 25%磷酸调节 pH至 7.3)(30∶70), 检测
波长 203nm。结果:雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素均在 0.0816 ～ 4.0800μg(r=0.99999)范围内线性关系良好 ,平均回收
率分别为 98.51%, 98.15%。结论:为进一步研究其质量控制方法提供参考。
关键词:雪上一枝蒿;雪上一枝蒿甲素;雪上一枝蒿庚素;HPLC
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2011)02-0387-04
HPLCdeterminationoftwoalkaloidsin
AconitumbrachypodumDiels
GENGJia-ling1 , MENGQin1 , SHENYong2 , FUMin3
(1.YunnanInstituteforFoodandDrugControl, Kunming650011, China;2.KunmingInstituteforPlantStudy, Kunming650204, China;
3.KunminghospitalofChinemedicine, Kunming650011, China)
Abstract　Objective:ToestablishamethodforthedeterminationbulatineAandbulatineGinAconitumbrachy-
podum.Methods:UsingaC18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm), acetonitrile-water(pH7.3)(30∶70)asthe
mobilephaseandUVdetectionwavelengethat203nm.Results:Therewasagoodlinearrelationshipwitharangeof
0.0816-4.0800 μg(r=0.99999)fortwobiochemistries;theaveragerecoveryforbulatineAwas98.51%, for
bulatineGwas98.15%.Conclusion:ThismethodcanbeappliedtothedeterminationofbulatineAandbulatine
GinAconitumbrachypodum.
Keywords:Aconitumbrachypodum;bulatineA;bulatineG;HPLC
　　雪上一枝蒿系毛茛科植物雪上一枝蒿(Aconi-
tumbrachypodumDiels)的干燥块根 ,具有活血 、镇
痛 、抗炎等作用 ,是云南地区民间习用的药材 ,收载
于 1996年版 《云南药品标准 》。主要分布在云南东
北部及西北部的东川 、昭通 、丽江等地。据文献报
道 [ 1] ,云南东川产雪上一枝蒿块根含雪上一枝蒿甲
素 、乙素 、丙素 、丁素 、庚素 、乌头碱及次乌头碱等多
种生物碱。这些生物碱既是雪上一枝蒿的主要活性
成分 ,同时也是毒性成分 。以雪上一枝蒿为原料开
发了一系列药品 (如雪上一枝蒿总碱片 、雪上一枝
蒿总碱注射液 、骨痛灵酊等)已用于临床 。但是 ,对
雪上一枝蒿药材及其制剂的质量控制研究不多 ,仅
限于紫外分光光度法测定总生物碱和 HPLC法测定
其中的雪上一枝蒿甲素。在提取 、分离雪上一枝蒿
药材的化学成分中发现 ,除雪上一枝蒿甲素外 ,雪上
一枝蒿庚素也是雪上一枝蒿药材中含量较高的一种
化合物。为了能更准确的控制药材质量 ,本文以雪
上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素为指标成分进行了
定量检测 ,比较了不同产地药材的含量差异 ,以便为
进一步研究其质量控制方法提供参考。
1　仪器与试药
HP-1100型高效液相色谱仪(HP-1100四元
泵 、VWD紫外检测器 、G1313A自动进样器 、在线真
空脱气机 、智能柱温箱 、HP化学工作站);雪上一枝
蒿甲素对照品(批号:895-20001)由中国药品生物
制品检定所提供 ,雪上一枝蒿庚素对照品由昆明植
物研究所提供(鉴定依据:比旋度 、紫外光谱 、质谱 、
氢谱 、碳谱;纯度检查方法:三维液相色谱法;纯度大
于 99%);雪上一枝蒿药材按 1996年版 《云南药品
标准 》的有关规定鉴定为雪上一枝蒿 (Aconitum
—387—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2011, 31(2)DOI :10.16155/j.0254-1793.2011.02.021
brachypodumDiels)的干燥块根 。流动相中乙腈为
色谱纯 ,水为超纯水;其余溶剂均为分析纯 。
2　色谱条件
色谱柱为 AgilentC18柱(250 mm×4.6 mm, 5
μm);流动相为乙腈 -水(1000 mL水中加三乙胺
0.1mL,并用 25%磷酸调节 pH至 7.3)(30∶70);检
测波长 203nm;柱温 30 ℃;进样 10 μL。色谱图见
图 1。雪上一枝蒿甲素的保留时间为 8.8min,雪上
一枝蒿庚素的保留时间为 12.9min。
图 1　溶剂 (A)、雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿庚素对照品(B)、雪
上一枝蒿药材(C)色谱图
Fig1　HPLCchromatogramsofsolvent(A)、bulatineAandbulatineG
chemicalreferencesubstances(B)andAconitumbrachypodumDiels(C)
1.雪上一枝蒿甲素(bullatineA)　 2.雪上一枝蒿庚素(bulatineG)
3　溶液制备
3.1　对照品溶液　精密称取在 80℃干燥至恒重的
雪上一枝蒿甲素及雪上一枝蒿庚素对照品各 16.32
mg,置 100 mL量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,
摇匀 ,即得 0.1632 mg· mL-1对照品混合液 (A)。
精密量取对照品混合液(A)5 mL置 10mL量瓶中 ,
即得 0.0816mg· mL-1对照品混合液(B)。
3.2　供试品溶液　精密称取药材细粉(过二号筛)
1.1g,加氨试液 1mL使湿润 ,精密加入三氯甲烷 25
mL,称定重量 ,加热回流 2 h,取出 ,放冷 ,再称定重
量 ,用三氯甲烷补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取滤液
5 mL置水浴上蒸干 ,残渣加甲醇溶解并转移至 10
mL量瓶中 ,摇匀 ,滤过 ,取滤液过 0.45 μm微孔滤
膜 ,既得。
4　线性关系考察
取对照品混合液(A)25, 20, 15 μL和对照品混
合液(B)20, 10, 5, 1 μL进样 ,记录色谱图。进样量
分别为 4.0800 , 3.2640, 2.4480, 1.630, 0.8160,
0.4080, 0.0816μg,以进样量为横坐标 ,峰面积为纵
坐标 ,绘制标准曲线并进行回归计算 ,雪上一枝蒿甲
素和雪上一枝蒿庚素的标准曲线回归方程分别为:
Y=676.10X-11.82　r=0.99999
Y=623.18X-21.58　r=0.99999
雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素均在 0.0816 ～
4.0800μg范围内与峰面积呈良好的线性关系 。
5　精密度试验
取 “ 3.1”项下的对照品混合溶液(B)10 μL,连
续进样 6次 ,测定雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚
素的峰面积 , RSD(n=6)分别为 0.4%, 0.5%。
6　稳定性试验
取配好的供试品溶液 ,室温下放置 ,分别在 0,
1, 2, 3, 6, 10 , 21h时测定峰面积 ,结果 ,雪上一枝蒿
甲素和雪上一枝蒿庚素在 21h内稳定 , RSD(n=7)
分别为 0.4%, 0.4%。
7　重复性试验
取云 南 东 川 产 雪 上 一 枝 蒿 药 材 粉 末
(20080701),按 “3.2”项下方法制备供试品溶液 ,分
别测定含量 ,结果雪上一枝蒿甲素的平均含量为
0.39%, RSD=0.9%;雪上一枝蒿庚素的平均含量
为 0.34%, RSD=0.7%(n=6)。
8　回收率试验
精密量取浓度为 0.2118 mg· mL-1的雪上一枝
蒿甲素和 0.1925 mg·mL-1的雪上一枝蒿庚素对照
品混合液 10 mL, 6份 ,分置 6个锥形瓶中 ,水浴蒸
干;精密称取 6份已知含量(药材粉末 20080701,雪
上一枝蒿甲素的含量为 0.39%;雪上一枝蒿庚素的
含量为 0.34%)的药材粉末 0.55 g,依次加入上述 6
个锥形瓶中 ,按 “3.2”项下的方法操作 ,按上述色谱
条件测定 ,计算回收率。结果:雪上一枝蒿甲素的平
均回收率 =98.51%, RSD=1.6%, ;雪上一枝蒿庚
素的平均回收率 =98.15%, RSD%=1.3%(n=6),
结果见表 1。
—388— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2011, 31(2)
表 1　回收率试验测定结果(n=6)
Tab1　Resultsofaccuracy
取样
(sample)
/g
样品含量(content)/mg 加入对照品量(amountadded)/mg 测得量(found)/mg 回收率(recovery)/%
甲素
(bulatineA)
庚素
(bulatineG)
甲素
(bulatineA)
庚素
(bulatineG)
甲素
(bulatineA)
庚素
(bulatineG)
甲素
(bulatineA)
庚素
(bulatineG)
0.5507 2.148 1.872 2.118 1.925 4.245 3.769 99.00 98.55
0.5521 2.153 1.877 2.118 1.925 4.287 3.783 100.76 99.01
0.5512 2.150 1.874 2.118 1.925 4.189 3.763 96.27 98.13
0.5525 2.155 1.878 2.118 1.925 4.216 3.797 97.31 99.69
0.5503 2.146 1.871 2.118 1.925 4.228 3.750 98.30 97.61
0.5511 2.149 1.874 2.118 1.925 4.255 3.720 99.43 95.90
9　提取方法考察
取云 南 东 川 产 雪 上 一 枝 蒿 药 材 粉 末
(20080701),提取方法如表 2,其余照 “3.2”项下方
法操作 ,结果见表 2。
表 2　不同提取方法测定结果(%, n=2)
Tab2　Resultsofdiferentextractions
提取方法
(diferentextractions)
雪上一枝蒿甲
素(bulatineA)
雪上一枝蒿庚
素(bulatineG)
超声处理 30 min(ultrasonicextraction30
min)
0.22 0.30
超声处理 50 min(ultrasonicextraction50
min)
0.26 0.32
加热回流 1 h(heatingflux1 h) 0.35 0.35
加热回流 2 h(heatingflux2 h) 0.39 0.35
加热回流 3 h(heatingflux3 h) 0.39 0.34
超声 5 min,冷浸过夜 ,再超声 5min(ultra-
sonicandcolddip)
0.28 0.33
10　样品测定
照 “ 3.2”项下方法操作 ,测定 8批样品中雪上
一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素的含量 ,结果见表 3。
11　讨论
11.1　用紫外二极管阵列检测器在 200 ～ 500 nm波
长扫描可得各待测组分色谱峰的色谱图 ,雪上一枝
蒿甲素和雪上一枝蒿庚素均在 200 nm附近有吸收 ,
考虑到末端吸收的影响 ,选择 203nm为本实验的检
测波长。结果 ,药材中雪上一枝蒿甲素的出峰时间
为 8.8 min;雪上一枝蒿庚素的出峰时间为 12.9
min;在三维图谱中 ,该两处峰的纯度角度均小于其
纯度域值 ,证明没有其他杂质的干扰。
11.2　试验中以雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素
为考察指标 ,对供试品溶液的制备进行了方法学研
究:提取溶剂曾用乙醇和甲醇提取 ,发现提取的杂质
较多;后改用乙醇提取 ,蒸干乙醇液 ,用 1.5%盐酸
表 3　8批样品的含量测定结果(%, n=2)
Tab3　ResultsoftwobiochemistriesinAconitumbrachypodumDiels
产地
(producingarea)
批号
(LotNo.)
雪上一枝蒿甲素
(bulatineA)
雪上一枝蒿庚素
(bulatineG)
云南东川新桥(Dongchuanxinqiao, Yunnan) 20070201 0.51 0.31
云南东川法则(Dongchuanfaze, Yunnan) 20070501 0.76 0.58
云南东川法则(Dongchuanfaze, Yunnan) 20080701 0.39 0.34
云南东川(Dongchuan, Yunnan) 20081001 0.64 0.50
云南东川(Dongchuan, Yunnan) 20081002 0.65 0.38
云南昭通(Zhaotong, Yunnan) 20081101 未检出(notdetected) 0.17
四川(Sichuan) 20070801 未检出(notdetected) 0.40
四川(Sichuan) 20071001 未检出(notdetected) 未检出(notdetected)
溶解残渣 ,用三氯甲烷提取 ,弃去三氯甲烷液 ,水层
用氨试液调节 pH至 9,三氯甲烷提取 ,蒸干三氯甲
烷液 ,残渣加甲醇溶解 。此方法杂质较少 ,但提取率
低 。采用文献方法 [ 2]加入氨试液后三氯甲烷提取 ,
提取方法比较了超声 、回流 、冷浸 。结果 ,以加热回
流 2 h提取率高 ,且杂质较少。氨试液的加入量对
提取率无明显影响 ,氨试液加入量以湿润为宜 ,否
则 ,后续处理较为麻烦。加入三氯甲烷 25 mL已能
充分提取出药材中的雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿
庚素 。
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11.3　流动相还考察了①磷酸盐缓冲液(取磷酸氢
二钠 1.97 g,磷酸二氢钾 0.22g,加水溶解并稀释至
1000mL,用 80%的磷酸溶液调节 pH至 7.3)-甲
醇(28∶72)[ 2] ;②乙腈 -水(1000 mL水中加 0.1 mL
磷酸 , 0.1 mL三乙胺)(30∶70)。方法 ①在较高有
机相浓度中用了缓冲盐 ,会缩短色谱柱的使用寿命;
雪上一枝蒿甲素和雪上一枝蒿庚素属弱生物碱类 ,
曾考虑用离子化的方法使之从色谱柱上洗脱下来 ,
所以方法②流动相的 pH偏酸 ,约在 3.2左右 ,但无
论如何调节流动相的比例 ,均不能使雪上一枝蒿甲
素和雪上一枝蒿庚素有效分离 。最终确定本文流动
相分离效果好 ,且不使用缓冲盐 ,既能获得良好的峰
形 ,又能延长色谱柱的使用寿命 。
11.4　曾选用 AgilentSBC18 、AgilentExtendC18 、
PhenomenexC18 、依利特 ODS2C18 、汉邦 KromasilC18
等 ,结果 ,国产依利特 、汉邦柱在流动相 pH大于 6
时分离效果不理想。
11.5　本实验对雪上一枝蒿药材中的雪上一枝蒿甲
素和雪上一枝蒿庚素进行了含量测定 , 8批药材的
测定结果表明其含量差别很大 。说明生态环境 、采
收时间 、采收方法和存储条件等都可能对其含量产
生影响。
参考文献
1　HANDong-tie(韩东铁).Studythechemicalcompositionandphar-
macologyinAconitiumbrachypodumDiels(雪上一枝蒿的化学成分
与药理作用研究概况).YanbianUnivMedJ(延边大学医学学
报), 2007, 30(3):223
2　GAOShao-yang(高邵阳), YUPing(喻萍), CHENWu-yuan(陈
武元), etal.RP-HPLCdeterminationofbulatineAinAconitium
brachypodumDiels(RP-HPLC法测定雪上一枝蒿中雪上一枝蒿
甲素的含量).ChinJPharmAnal(药物分析杂志), 2005, 25(11):
1382
(本文于 2010年 1月 14日收到)
赛默飞世尔科技对德国二恶英食品安全危机作出响应
　　2011年 1月 12日 ,赛默飞世尔科技宣布其位于德赖艾希的全球食品安全响应中心正在监测德国
的二恶英危机 。在此事件中 ,动物饲料可能已经遭到包括有毒化学物质的工业脂肪的污染。同时 ,赛默
飞世尔科技还通告了生产商和食品安全实验室 ,赛默飞世尔现有可以检测食品和动物饲料中二恶英的
方法 。在德国 ,大约 3000吨遭二恶英污染的动物饲料添加剂近期被发放销售。
二恶英是在燃烧过程(例如垃圾焚烧)中形成的一组有毒化学物质。众所周知 ,这类物质的长期暴
露会增加致癌的可能性 。欧盟委员会设定了食品中二恶英的最高水平并于近期提出了更加严格的检测
限。由于近期德国食品危机的影响 ,已经关闭了 4500多家农场 ,欧盟委员会的官员也提倡更加严格的
法规和更加严厉的处罚 ,这些无疑为食品生产商施加了更大的压力 ,使他们需要使用更加灵敏的检测仪
器。
有关赛默飞世尔科技检测食品安全和动物饲料中二恶英的方法的更多信息 ,请访问:www.thermo-
scientific.com/fsrc.
—390— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2011, 31(2)