全 文 ：畜牧兽医科学
中国农学通报 第24卷 第4期 2008年 4月
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基金项目：项目来源“863科技攻关项目”（2007AA10Z150）；“国家自然科学基金两个基地”项目（30510403163）；“国家自然科学基金项目”（30571340）。
第一作者简介：梅妹，女，1973年出生，安徽怀远人，主治医师，学士，主要从事药理学方面的研究。通信地址：130062 吉林省长春市西安大路5333号
吉林大学畜牧兽医学院。Tel：0431-87836222；E-mail：jldxnxb@jluhp.edu.cn。
通讯作者：冯海华，女，1970年出生，山东省临朐人，讲师，博士，主要从事兽医药理学方面的研究。通信地址：130062 吉林省长春市西安大路5333号
吉林大学畜牧兽医学院。Tel：0431-87836162；E-mail：fhh70@163.com。
收稿日期：2008-01-06；修回日期：2008-01-09。
不同培养代数鹿茸生长中心细胞对IGF1
刺激的反应
梅 妹 1,邓旭明 1,岳占碰 1,赵丽红 1,李春义 2,冯海华 1
(1吉林大学畜牧兽医学院，长春130062；2新西兰INVERMAY农业研究中心，Mosgiel，新西兰50034)
摘 要:【研究目的】探讨胰岛素样生长因子(IGF1)对生长 60d的梅花鹿鹿茸体外培养不同代数鹿茸生
长中心细胞的影响。【方法】分离、培养生长60d的梅花鹿鹿茸生长中心细胞,将培养第2代、5代、8代细
胞经含有不同浓度的IGF1(0,1,3和 10nM)作用,在培养 24h后用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定法检测
每分钟衰变数(DPM)值。【结果】全部IGF1处理组都显著高于对照组(p<0.01)。不同浓度IGFⅠ处理组的
平均值和最高值都是离体培养 2代的细胞的DPM最高(分别为31918和39818DPM/mg蛋白),培养5
代的细胞 (分别为5455和6815DPM/mg蛋白)已大大地下降;到了第 8代的 (分别为 4030和 4838
DPM/mg蛋白)又有进一步的下降。【结论】IGF1能够促进鹿茸生长中心细胞分裂增殖,生长60d鹿茸的
生长中心细胞在离体培养,不同培养时期的鹿茸生长中心细胞对IGFⅠ刺激的敏感度不同。
关键词:IGF1;鹿茸;生长中心细胞;梅花鹿
中图分类号:Q78,S852.65文献标识码:A
Effcets of Insulin-Like Growth Factor 1 on the Proliferation at Different Generation
of Antler Organic Center Cells
Mei Mei1, DengXuming1, Yue Zhanpeng1, ZhaoLihong1, Li Chunyi2, FengHaihua1
(1College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine, Jilin University, Changchun 130062,
2AgResearch Limited InvermayAgricultural Centre Puddle Alley, Private Bag50034, Mosgiel, NewZealand)
Abstract:【Objective】Toinvestigate the effects ofinsulin-like growth factor 1 (IGF1)on the proliferation of
antler organic center cells fromvarious passages in vitro at 60 days growing period of antler.【Method】Antler
organic center cells were isolated fromsika deer antler of growing 60 day and cultured. The second, fifth and
eighth population cells were incubated with 0, 1, 3, and 10 nMIGF1. Thymidine incorporation assay was ap-
plied after 24 hours ofculture respectivelytodetermine the disintegration per minute (DPM)value.【Results】
The proliferation of cells fromgrowing 60 day’s antler in the experimental groupwas significantly higher than
that ofthe control group (p<0.01). The average and maximal DPMvalue ofthe proliferation ofcells in the ex-
perimental group was the highest in the second population cells (31918 and 39818 DPM/mgrespectively), de-
creased in the fifth population cells materially(5455 and 6815 DPM/mg), and decreased in the eighth popula-
tion cells again (4030 and 4838 DPM/mg).【Conclusion】The results showthat IGF1 can enhance the prolifer-
ation ofantler organic center cells cultured in vitro. The sensitivity of IGF1 on the antler organic center cells
fromvarious passages at 60 days growingperiod ofantler in vitro.
Key words: IGF1, antler, organic center cells, Sika deer
畜牧兽医科学
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畜牧兽医科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.42008April
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鹿茸是唯一的一种能够每年完全再生的哺乳动物
器官，因此为笔者提供了探索自然界是如何解决了哺
乳动物器官再生的机会，可以作为一种难得的生物医
学模型 [1~3]，但迄今为止鹿茸生长的调控机制尚不清
楚。Sutie等[4~5]认为鹿茸的生长速度与鹿体内胰岛素
样生长因子（IGF1）的水平呈强正相关，鹿茸尖部组织
富含IGF受体[6~7]。本研究在梅花鹿鹿茸生长最快的时
期60d时分离鹿茸生长中心细胞传代培养，检测生长
中心细胞对IGF1刺激的敏感度，以探讨影响鹿茸生长
速度的因素。搞清控制鹿茸生长速度的机理不但能为
提高鹿茸产量打下基础，而且可能为解决生物医学领
域的重大问题开辟新的途径。
1材料和方法
1.1试验材料
选定4岁龄的健康梅花鹿（农科院左家特产研究
所提供），在鹿茸生长的最快时期60d割取鹿茸。
1.2试剂
DMEM培养基（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；I型胶
原酶(Invitrogen)；犊牛血清(Invitrogen)；台盼兰（Sig-
ma）；DMSO（Sigma）；IGF1（Roche）。
1.3组织分离
在细胞培养间切下鹿茸尖部组织，从中央部纵向
切开以暴露茸尖内部组织。依据Li等[8]的取材方法，在
解剖显微镜下定位和切取鹿茸的间质层。该层即为鹿
茸生长中心细胞所在的组织层。
1.4细胞培养
用平衡缓冲盐溶液清洗鹿茸间质层组织3次。将
组织切碎，再用缓冲液清洗。将清洗后的组织碎块移入
含有鹿茸组织消化液（终浓度为200U/ml的I型胶原
酶的90%DMEM培养液，10%的犊牛血清）的培养瓶
中。于37°C温箱中孵育3h左右。消化后的组织和游
离出的细胞通过离心除去消化液，再用细胞培养液清
洗后转移至培养瓶中培养。培养3d后换液并继续培
养直到大多细胞群落相互融合为止。用胰酶-EDTA消
化贴瓶生长的细胞，并对消化的细胞进行台盼兰染色
以确定细胞的活性。
1.5试验设计
细胞长满培养面的85%～90%时，用胰酶-EDTA
将细胞消化掉并用台盼兰染色确定细胞活性。将细胞
以2×104细胞/ml的密度接种到24孔板的孔中，分别
培养2代、5代、8代细胞。培养48h后，用等量不含犊
牛血清但含有不同浓度的IGF1（0，1，3和10nM）的培
养液来替换孔中正常培养液，每个处理都为4孔重复，
继续培养24h。在培养结束前2h，于培养液中加入
2.5μCi/ml的3H-胸腺嘧啶核苷。培养结束后用4°C
的三氯乙酸（TCA，10%）清洗细胞3次。再用 500μl
1NNaOH溶解细胞。吸取200μl溶解液于液体闪烁计
数器中测定放射强度。另吸取200μl溶解液进行蛋白
含量测定。最终结果以4孔的算术平均数±标准差来
表示，单位为DPM/mg蛋白。
1.6数据统计
采用SPSS10.0对所得数据进行方差分析，以确定
处理组（含有不同浓度的IGF1组）与对照组（无IGF1
组）之间差异的显著性。
2结果
2.1鹿茸生长中心细胞的分离、培养
用含10%犊牛血清的的DMEM培养的鹿茸生长
中心细胞第3天全量换液除去未贴壁的细胞，倒置显
微镜下观察，鹿茸生长中心细胞此时已贴壁，细胞形态
均匀，呈梭形，细胞呈克隆性生长，贴壁的细胞迅速增
殖。台盼兰检测结果表明本试验中所用的细胞活性全
部都在90%以上。
2.2IGF1对鹿茸生长中心细胞的影响
结果见图1。取材于生长60d鹿茸的生长中心细
胞，全部IGF1处理组都显著高于对照组（p<0.01）。3
个不同浓度IGFⅠ处理组的平均值和最高值都是离体
图1IGF1对体外培养不同代数鹿茸生长中心细胞分泌蛋白含量的影响
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中国农学通报 第24卷 第4期 2008年 4月
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培养 2代的细胞最高（分别为 31918和 39818
DPM/mg蛋白）；而培养5代的细胞的这些值（分别为
5455和6815DPM/mg蛋白）已大大下降；到了第8
代的细胞这些值（分别为4030和4838DPM/mg蛋
白）又有进一步的下降。这说明，取材于生长60d鹿茸
的生长中心细胞在离体培养2代后对IGFⅠ的敏感度
已达到高峰，进一步传代（包括第5、8代的细胞）将导
致这些生长中心细胞对IGFⅠ刺激敏感度下降。
3讨论
鹿茸角的生长发育周期受雄激素水平变化的调
节，但鹿茸生长本身几乎与雄激素无关，而是由生长因
子特别是IGF1所决定的[4]。鹿茸尖部的细胞在离体培
养条件下与加入的IGF1浓度呈明显的量-效关系[8~10]。
所以IGF1是公认的、目前为止所发现的刺激鹿茸细胞
分裂繁殖最强的生长因子。然而Sadighi等[11]用测量距
离的方法来确定鹿茸生长中心细胞的位置：由鹿茸顶
端量起0.75cm处即为。由于不同鹿种、不同个体、不
同鹿茸生长期的鹿茸生长中心细胞层离开其顶端的距
离不同，所以用测量距离法定位鹿茸生长中心细胞并
非适用于所有鹿。Price等[9]依据肉眼能看到的鹿茸组
织中管状系统的形状和密度定位鹿茸生长中心细胞，
也有一定的主观性。Li等[11]报道了如何在未经组织染
色的、新鲜鹿茸尖部的组织切面上精确定位和取材鹿
茸生长中心细胞的方法。该取材方法的建立为在细胞
和分子水平上研究鹿茸生物学，以及在建立鹿茸生物
医学模型上提供了有利的手段。通过该方法取材检测
IGF1对生长60d的梅花鹿鹿茸体外培养不同代数鹿
茸生长中心细胞的影响，不同浓度IGFⅠ处理组的蛋
白含量的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最
高，培养5代的细胞的这些值已大大下降，到了第8代
的细胞又有进一步的下降。Sadighi等[11]发现3～10nM
范围的IGFⅠ浓度对培养的鹿茸尖部细胞具有最大的
刺激作用，而我们的实验中1nM的IGFⅠ仍然具有刺
激作用，并且实验组之间无显著差异，而实验组与对照
组之间差异显著。
取材于鹿茸生长最快时期 60d鹿茸的生长中心
细胞在离体培养 2代后对 IGFⅠ的敏感度已达到高
峰，进一步传代（包括第5、8代的细胞）将导致这些生
长中心细胞对IGFⅠ刺激敏感度下降。表明IGF1能够
促进鹿茸生长中心细胞分裂增殖，在生长最快时期体
外培养不同代数鹿茸的生长中心细胞对生长因子
IGF1刺激的敏感度不同。
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