全 文 ：　表 6　　　　丁香超微粉和普通粉有效物质
提出效率和提出量的比较
指标 挥发油提取率 /% 总黄酮提取率 /%
提取时间 /h 1 2 3 1 2 3
超微粉 15.5 18.4 20.3 2.31 3.43 4.57
普通粉 13.3 16.4 19.5 1.33 2.14 2.98
3　讨论
含油脂类药材 ,常规的水煎煮提取或者直接口
服往往会由于油水亲和力差而妨碍提取效果或体内
吸收 ,将药材超微粉碎破壁后可免除溶媒穿透细胞
壁进入细胞内将药效成分溶出的漫长过程和障碍 ,
因此存在缩短提取时间 、降低用量的可能性 ,本研究
初步证明了丁香的水溶性黄酮类成分在水提取过程
中 ,超微粉体比普通粉体的提出速度和提出量都有
大大提高 ,其他含油脂类药材的实验结果有待进一
步确证 。
此类中药材在超微粉碎过程中 ,由于破壁后油
脂溢出造成粉体粘性增加 ,即使采用低温粉碎等方
法可以使粉碎过程顺利进行 ,但粉体恢复到常温后 ,
依然会出现结块 、流动性下降等现象 ,为此本研究采
用加入具有吸收性能的辅料 ,很好的解决了这一问
题 ,同时符合传统药材粉碎方法中的 “串油 ”粉碎的
理论 ,为解决此类药材的超微粉碎共性技术问题提
供了思路 。
参 考 文 献
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收稿日期:2009-04-23基金项目:辽宁省教育厅基金资助项目(2009T066)作者简介:李斌(1983-),女 ,硕士研究生 ,主要从事中药质量评价及创新药物开发;Tel:15840901457, E-mail:eleven lb@126.com。＊通讯作者:张慧 , E-mail:syyycs@163.com;康廷国 , E-mail:kangtg@lnutcm.edu.c.n。
乌骨藤多糖的提取工艺研究
李　斌 ,刘歆韵 ,张　慧＊ ,康廷国＊
(辽宁中医药大学药学院 ,辽宁 大连 116600)
　　摘要　目的:优化乌骨藤多糖的提取工艺 , 建立乌骨藤多糖的含量测定方法。方法:采用 L9(3)4正交试验 ,以
多糖含量为评价指标 , 确定多糖的提取工艺 , 并采用苯酚-硫酸法 ,测定多糖的含量。结果:最佳提取工艺为 100℃,
加水 8倍量提取 3次 , 每次 1h;葡萄糖的浓度在 0.004 ～ 0.014 mg/mL范围内呈良好的线性关系 , 回收率为
99.72%, RSD=0.63%。结论:确定的工艺稳定可行 ,适合工业化生产;建立的含量测定方法简便 、快速 、重现性好 ,
为乌骨藤的新药开发奠定基础。
关键词　乌骨藤;多糖;含量测定;提取工艺;正交试验
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)11-1751-04
StudyontheExtractionTechnologyofPolysaccharidesfromCaulisMarsdeniaeTenacissimae
LIBin, LIUXin-yun, ZHANGHui, KANGTing-guo
(ColegeofPharmacognosy, LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine, Dalian116600, China)
Abstract　Objective:Tooptimizetheextractiontechnologyandtoestablishthedeterminationmethodofpolysaccharidesfrom
CaulisMarsdeniaeTenacissimae.Methods:Phenol-sulphatecolorimetrywasusedtodeterminethecontentofpolysaccharides.According
totheyieldofpolysaccharides, theorthogonaldesignwasusedtoselecttheextractiontechnologyofpolysaccharides.Results:Theopti-
mumextractionprocedurewas8foldsofwater, refluxingandextractingfor3timesat100 ℃, and1 hforeachtime.Theconcentration
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.11.038
ofpolysaccharidewaslinearintherangeof0.004 ～ 0.014 mg/mL.Theaveragerecoverywas99.72%, RSD=0.63%.Conclusion:
Theoptimumextractionprocedureissimpleandreliablewhichissuitableforindustrialproduction.Themethodfordeterminationis
simple, specificandaccuratewhichcanprovideamethodformasscontrolofMarsdeniatenacissima.
Keywords　CaulisMarsdeniaeTenaissimae;Polysaccharide;Determination;Extractiontechnology;Orthogonaltest
　　乌骨藤为萝藦科植物通关藤 Marsdeniatenacis-
sima(Roxb.)WightetArn.的藤茎 ,又名为奶浆藤 、
通关藤等 ,主产于云南 、贵州等地 ,始载于 《滇南本
草 》[ 1] 。具有清热解毒 、止咳平喘等功效 ,现代乌骨
藤及其单味药材制成的注射剂和片剂 ,目前作为治
疗肺癌 、食道癌 、胃癌 、直肠癌等恶性肿瘤[ 2]的一线
药物和必用药物在临床广泛应用 ,通过 2075例癌症
病人临床观察 ,证实其抗肿瘤作用显效 ,但迄今为
止 ,有关其抗癌活性成分及部位尚不明确 ,为探明上
述问题 ,本课题组对乌骨藤的化学成分 、药理 、机理
等方面进行了系统研究 ,证实多糖类成分为其有效
部位。为了深入开发利用乌骨藤多糖 ,本文采用 L9
(34)正交试验 ,以多糖含量为评价指标 ,对其提取
工艺进行优化 ,采用苯酚 -硫酸比色法 ,建立了规范
化的含量测定方法。
1　材料与仪器
1.1　材料　乌骨藤购于安国杏林药材公司 ,经本
院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为萝藦科植物通
关藤 Marsdeniatenacisima(Roxb.)WightetArn.的
藤茎。
1.2　试剂　葡萄糖(105℃干燥至恒重)购于中国
药品生物制品检定所 ,批号:110833-200302;95%乙
醇 、无水乙醇 、苯酚 、98%硫酸等试剂均为分析纯 。
1.3　仪器　RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化
仪器厂);UV-3010型紫外分光光度计(日本岛津);
TDL-5-A台式离心机(上海安亭科学仪器厂);YB-
IA真空干燥箱(天津市鑫洲科技有限公司)。
2　方法与结果
2.1　乌骨藤多糖的含量测定
2.1.1　溶液的制备:葡萄糖对照品溶液的配制:精
密称取 105℃干燥至恒重的葡萄糖 10mg,用蒸馏水
溶解并定容到 100mL。 5%苯酚试液的配制:称取
5g重蒸苯酚 ,用重蒸水定容至 100mL,置于棕色试
剂瓶中 , 4℃保存。供试品溶液的配制:取乌骨藤粗
多糖 10mg,用蒸馏水溶解并定容到 50mL。
2.1.2　测定波长的选择:精密量取葡萄糖对照品
溶液 1.0mL、样品溶液 1.0mL,各加入新配制的 5%
苯酚液 1.4mL,混匀 ,迅速滴加浓硫酸 7mL,摇匀 ,置
40℃水浴中放置 15min,取出 , 冷却至室温 。另取
1.0mL蒸馏水同法平行操作作为空白对照 ,于 600
～ 400nm范围内扫描其吸收曲线 。结果两种溶液
在 490nm波长处均有最大吸收 ,故以 490nm为测定
波长 。
2.1.3　苯酚加入量的选择:分别精密量取葡萄糖
对照品溶液 1mL8份 ,按苯酚-硫酸法 ,分别加入苯
酚 1.0、1.2、1.4、 1.6、1.8、2.0、2.2、2.4mL, 加入浓
硫酸 6mL,在 490nm测定其吸光度 ,结果表明:苯酚
加入量为 1.4mL时 ,反应基本完全 ,故苯酚加入量
确定为 1.4mL。
2.1.4　硫酸加入量的选择:分别精密量取葡萄糖
对照品溶液 1mL6份 , 按苯酚 -硫酸法 ,加入苯酚
1.4mL,加入浓硫酸 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5mL,
在 490nm测定其吸光度 ,结果表明:浓硫酸用量为
7mL时 ,反应基本完全 ,为此浓硫酸加入量确定为
7mL。
2.1.5　标准曲线的制备:精密量取葡萄糖对照品
溶液 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL分别置于 10mL
具塞刻度试管中 ,各加入 5%苯酚溶液 1.4mL,充分
摇匀 ,然后加浓硫酸 7mL,充分摇匀 ,加水至刻度 ,置
40℃水浴中放置 15min, 取出 ,冷却至室温。另取
1.0mL的蒸馏水同上操作制得空白溶液。在 490nm
波长处测定吸光度 ,以葡萄糖浓度为横坐标 ,吸光度
为纵坐标 ,得标准回归方程为 Y=0.006X-0.1137
(r=0.9995), 表明葡萄糖浓度在 0.004 ～ 0.014
mg/mL范围内线性关系良好 。
2.1.6　稳定性试验:取同一供试品溶液 ,分别在
0、15、30、60、120min测定吸光度 ,考察供试品的稳
定性 。结果 RSD为 1.75%,供试品溶液在 2h内吸
光度基本无变化。
2.1.7　重复性试验:取同一批样品 6份 ,分别测定
吸光度 ,计算含量 ,结果 RSD为 0.69%,表明重复性
良好 。
2.1.8　加样回收率试验:精密称取已知含量的样
品 ,共 5份 。分别加入葡萄糖对照品约 5 mg,定容
至 50 mL,按 “2.1.5”项下方法操作 ,结果平均回收
率为 99.72%, RSD为 0.63%。
2.2　提取工艺的优选　取乌骨藤药材粉碎 ,过 20
目筛 ,精密称取粉末约 25 g4份 ,置圆底烧瓶中 ,分
别按下述 4种方法进行提取。方法 1:加水 8倍量 ,
回流提取 3次 ,每次 1h,滤过 ,合并提取液 ,备用;方
·1752· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月
法 2:加水 8倍量 ,浸提 24 h,滤过 ,备用;方法 3:加
95%乙醇 6倍量 ,回流提取 2次 , 每次 1h, 弃去醇
液 ,药渣加水 8倍量 ,回流提取 3次 ,每次 1h,滤过 ,
合并提取液 ,备用;方法 4:加 95%乙醇 6倍量 ,回流
提取 2次 ,每次 1 h,弃去醇液 ,药渣加水 8倍量 ,浸
提 24h,滤过 ,备用 。
取上述备用提取液均浓缩至 50 mL,加 95%乙
醇 300 mL,静置过夜 ,离心(3 000r/min, 15min),取
沉淀 ,分别依次用 95%乙醇 、无水乙醇 、丙酮洗涤数
次 ,置真空干燥箱中 50℃真空干燥 5h,至乌骨藤粗
多糖重量不再变化 ,精密量取乌骨藤粗多糖 10mg,
用蒸馏水溶解并定容到 50 mL,按 “ 2.1”项下的多糖
含量测定方法进行测定 ,并计算含量 ,结果多糖含量
分别为 1.097%、0.587%、1.792%、0.619%。由此
可见 ,方法 3的多糖含量高于其他 3种方法 ,故确定
方法 3为最佳提取方法。
2.3　正交试验
2.3.1　正交设计与结果:影响水提取多糖的因素
很多 ,结合预实验结果 ,选择 4个主要因素 ,即:加水
量 、提取时间 、提取温度 、提取次数 ,每个因素各设定
3个水平 ,按 4因素 3水平进行 L9(34)正交试验 ,因
素与水平见表 1。取乌骨藤药材粉碎 ,过 20目筛 ,
精密称取约 250g, 以 95%乙醇 6倍量回流提取 2
次 ,脱脂 ,每次 1h,滤过 ,挥干溶剂 ,得药渣 228g,得
率 91.2%。取上述药渣各 22.8g,共 9份 ,分别放入
500mL圆底烧瓶中 ,按表 2的条件进行提取 ,滤过 ,
合并滤液 ,并浓缩至 100mL,加 95%的乙醇使醇度
达到 80%, 搅拌 , 4℃过夜 , 离心 (3 000r/min,
15min),沉淀依次用 95%乙醇 、无水乙醇 、丙酮反复
洗涤 ,真空干燥 ,得乌骨藤粗多糖 ,按 “2.1”项下方
法进行测定 ,并计算含量 ,结果见表 2。
　表 1　 因素水平表
水平 A料液比/倍 B提取时间/h C提取温度/℃ D提取次数/次
1 6 1 60 1
2 8 1.5 80 2
3 10 2 100 3
2.3.2　正交试验结果分析:方差分析结果见表 3。
从表 2、表 3可知 ,影响乌骨藤多糖提取率的因素顺
序为 C>A>D>B。C即提取温度对乌骨藤多糖提
取的影响较大;直观分析的多糖最佳提取工艺为
A3B3C3D3 ,但 A1结果与 A3结果相当 ,且实验中发
现采用 A1提取时 ,水液刚刚浸过药材 ,考虑到工业
化生产 ,最终确定最佳工艺为 A2B3C3D3 ,即加 8倍
量水 、100℃提取 3次 、每次 2h。
　表 2　 正交试验结果
试验号 A B C D 多糖含量/%
1 1 1 1 1 0.891
2 1 2 2 2 1.282
3 1 3 3 3 2.465
4 2 1 2 3 1.158
5 2 2 3 1 1.709
6 2 3 1 2 0.829
7 3 1 3 2 2.061
8 3 2 1 3 1.319
9 3 3 2 1 1.538
K1 1.546 1.370 1.031 1.379
K2 1.232 1.437 1.326 1.391
K3 1.639 1.611 2.078 1.647
R 0.407 0.241 1.065 0.268
　表 3　 方差分析结果
方差来源 偏差平方和 自由度 F值 显著性
A 0.273 2 2.935
B 0.093 2 1.000
C 1.798 2 19.333 ＊
D 0.138 2 1.484
　　注:F0.05(2, 2)=19.00, ＊P<0.05
2.4　验证实验　精密称定药材 250g,按照正交试
验结果及结合实际优选出的提取方案 ,平行放大操
作 5次 ,按 “2.1”项下方法测定含量 ,结果见表 4。 5
批含量的 RSD=2.78%,表明按最佳工艺提取制得
的多糖收率稳定 ,故确定的工艺稳定可行 ,适合工业
化生产。
　表 4　 验证实验结果
批次 多糖提取量 /g 多糖含量 /% RSD/%
1 12.6 1.81
2 11.9 1.70
3 12.3 1.76 2.78
4 12.4 1.78
5 11.8 1.69
3　讨论
3.1　乌骨藤中含有大量皂苷类成分 ,为此提取多
糖时 ,先采用 95%的乙醇回流提取 2次 ,以除去大
部分皂苷 ,有利于多糖提取液的减压浓缩(皂苷含
量过高会产生大量泡沫),而且还能除去一部分单
糖 、寡糖等小分子物质 ,以利于多糖的提取及纯化 。
3.2　苯酚 -硫酸法以及蒽酮-硫酸法是较为常用的
·1753·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月
两种多糖含量测定的方法 ,这两种方法各有优缺点 ,
蒽酮-硫酸法的缺点是蒽酮试剂不稳定 ,需要临用前
配制 ,不适用于大量样品的测定 ,但是测量少量样品
优于苯酚-硫酸法;而苯酚 -硫酸法的缺点是苯酚容
易氧化 ,配制前苯酚需要重新蒸馏收集进行纯化处
理 ,否则影响结果的准确度 ,只要注意苯酚溶液的避
光保存 ,可以进行大量样品的处理 ,综合考虑两种方
法的优缺点 ,结合本实验的特点 ,最终采用了苯酚-
硫酸法进行测定 ,实验结果显示 ,苯酚-硫酸法的线
性良好 ,适用于多糖的含量测定 [ 3, 4] 。
参 考 文 献
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双水相体系萃取分离杜仲黄酮
彭　胜 ,彭密军＊ ,黄美娥 ,卜晓英 ,伍　钢
(吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室 ,湖南 张家界 427000)
　　摘要　目的:研究双水相体系萃取分离杜仲黄酮的工艺条件。方法:以高分子化合物聚乙二醇 4000
(PEG4000)/葡聚糖 40000(D40)为双水相体系 ,考察了萃取体系相图 , 研究了 PEG4000/D40质量分数 、样品溶液加
入量 、pH值和温度等因素对双水相成相及杜仲黄酮萃取效果的影响。结果:最佳萃取工艺条件是采用质量分数为
11%的 PEG4000和质量分数为 8%的 D40组成双水相体系 , 加入杜仲黄酮含量为 6.85%的样品溶液 8g, 控制温度
为 60℃、溶液 pH为 8,此条件下杜仲黄酮有较高的萃取率 , 可达到 75.82%。结论:该方法操作条件温和 , 无溶剂
残留 , 耗时少 ,对杜仲黄酮的单级分离提纯效率高。
关键词　黄酮;杜仲;双水相体系;萃取;分离
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)11-1754-04
ExtractionandSeparationofFlavonoidsfromLeaveof
EucommiaulmoidesinAqueousTwo-phaseSystem
PENGSheng, PENGMi-jun, HUANGMei-e, BUXiao-ying, WUGang
(KeyLaboratoryofHunanForestProductsandChemicalIndustryEngineering, JishouUniversity, Zhangjiajie427000, China)
Abstract　Objective:Tooptimizetheaqueoustwo-phaseextractionandseparationtechnologyofflavonoidsfromtheleavesofEu-
commiaulmoides.Methods:Thesystemwaspreparedbydissolvingsuitableamounisofpolyethyleneglycol4000(PEG4000)anddex-
tran40000(D40)inaqueoussolution.Phasemapofthesystem, themassfractionofPEG4000andD40, theefectsofamountofadd-
edsample, pHvalueandtemperatureontargetcompoundswereinvestigatedsystematicaly.Results:Theoptimumextractioncondi-
tionswerePEG4000 11%, D40 8%, 8 gsamplewhichcontains6.85% offlavonoids, temperature60℃ andpHvalue8.Thehighest
extractionratecouldreachto75.82%.Conclusion:Thismethodhastheadvantagesofmildconditions, solvent-freeresiduesandless
time-consumed, andtheobviouseficiencyinsingle-stageseparationandpurificationofflavonoids.
Keywords　Flavonoids;EucommiaulmoidesOliv.;Aqueoustwo-phasesystem;Extraction;Separation
收稿日期:2009-07-17基金项目:湖南省教育厅重点项目(08A056);吉首大学研究生科研创新项目(JGY200907)作者简介:彭胜(1984-),女 ,在读硕士研究生 ,研究方向:天然产物化学;Tel:13762195084, E-mail:pengsheng162@ 163.com。＊通讯作者:彭密军 , Tel:0744-6313787, E-mail:pengmj163@ 163.com。
　　杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国特有的
经济树种和名贵中药 ,其中杜仲黄酮是其主要有效
成分(包括檞皮素 、山奈酚 、芦丁等 10多种),既可
作为心血管疾病的原料药 ,还可广泛应用于功能食
品 、化妆品等领域 〔1-3〕。
双水相萃取(aqueoustwo-phaseextraction, ATP
E)是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的
差异进行萃取的方法。与传统方法相比 ,具有如下
优点:不存在有机溶剂残留 、分相时间短 、能除去大
量杂质和固体物质 、易于工程放大和连续操作等 ,被
·1754· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月