全 文 ：收稿日期:2012-07-28
基金项目:河南省教育厅自然科学基金(201210475039)
作者简介:李小红(1982-) ，女，在读硕士研究生，专业方向:微生物与免疫;Tel:18338080296，E-mail:freefly5899@ sina． com。
* 通讯作者:黄红莹，Tel:13837826834，E-mail:huanghongying25@ 163． com。
草决明对临床 MＲSA菌株毒力的影响及机制研究
李小红1，刘 强2，娄 强1，卢 峰1，黄红莹1*
(1．河南大学医学院微生物学实验室，河南 开封 475004，2．河南大学淮河医院检验科，河南 开封 475004)
摘要 目的:探讨草决明对 MＲSA菌株的色素产生及毒力表达影响，寻找抑制毒力表达的基因靶标，探讨草决
明的药理作用及 MＲSA菌株的毒力变化机制。方法:草决明采用水提和醇提法，用血浆凝固酶实验、光密度测定技
术、抗过氧化氢实验观察草决明对不同组 MＲSA菌株的作用，通过荧光定量 PCＲ 技术观察各毒力表达基因及调控
基因变化。结果:12. 5、3. 125 μg /mL的草决明水提液和醇提液不影响 MＲSA菌的生长，草决明提取液降低了 MＲ-
SA菌色素合成及血浆凝固酶表达，MＲSA菌抗氧化能力降低;MＲSA菌分别受水提液及醇提液处理后，溶血素活性
出现分离现象;荧光定量 PCＲ结果表明抑制毒力表达的基因靶标为 agr，但溶血素基因不受其调控。结论:草决明
通过基因靶标 agr降低了 MＲSA菌的部分毒素表达，具有一定的临床应用价值。
关键词 草决明;MＲSA菌株;毒力表达;调节基因
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)06-0976-03
临床耐甲氧西林金葡菌(MＲSA)感染非常常
见，抗生素治疗效果不佳，特别是危重病合并 MＲSA
菌感染的患者治疗效果更差。
本实验对草决明采用水提和醇提法，比较不同
提取液对 MＲSA 菌株毒力的影响，通过荧光定量
PCＲ技术观察各毒力因素的基因水平及调节基因
变化;目的是寻找抑制毒力表达的基因靶标，探讨
草决明的药理作用及 MＲSA 菌株的毒力变化机制，
为临床 MＲSA菌株感染的治疗提供新的对策。
1 材料与仪器
1. 1 菌株 临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
10 株，由河南大学淮河医院细菌室提供。
1. 2 药物与试剂 草决明购自同仁堂药店，经河
南大学药学院中草药实验室李钦鉴定为正品;LB 营
养肉汤培养基、营养琼脂培养基(杭州天和微生物
试剂有限公司) ;逆转录试剂盒、PCＲ 试剂(Taq
DNA聚合酶、4 × dNTPs、10 ×缓冲液等)购自 Pro-
mega公司。
1. 3 主要仪器 生物安全柜(苏净集团安泰公
司) ;恒温培养箱(上海福码) ;恒温摇床(Thermo
forma) ;微型离心机(eppendorf) ;高速台式离心机
(eppendorf) ;核酸蛋白检测仪(Beckman，DU640，
USA) ;多功能酶标仪(Thermo)、ABI 5700 实时荧光
PCＲ 仪(ABI公司)。
2 方法
2. 1 草决明水提液及醇提液的制备 由河南大学
药学院中草药实验室提供。
2. 2 草决明对 MＲSA 菌生长的影响 MＲSA 菌培
养至对数生长期时，按 1% 接种量分别接种于 5 mL
LB培养基中，实验分为 3 组:草决明水提液组(12. 5
μg /mL)、醇提液组(3. 125 μg /mL)、对照组。于 37
℃ 200 r /min 培养，分别于 0、2、4、6、8、10 h 取样，样
品经 PBS 洗 2 次，10 000 r /min 离心 3 min，PBS 重
悬，96 孔板(3 个复孔)测样品光密度 D(λ)600 nm
值，实验重复 3 次，绘制细菌生长曲线。
2. 3 草决明对 MＲSA菌凝固酶产生的影响 细菌
处理同“2. 2”项，摇菌培养 10 h，离心收上清，用无
菌 LB培养液将菌液上清倍比稀释，分别加 100 μL
于 7 支试管中，第 8 管为阴性对照;取稀释兔血浆
(PBS稀释 4 倍) ，每支试管加入 500 μL，混合后置
于 37 ℃ 6 h;以产生血浆凝固的最高稀释倍数作为
凝固酶效价。
2. 4 草决明对 MＲSA菌溶血素产生的影响 参考
文献〔1〕的方法测定溶血素活力。细菌处理同“2. 2”
项，摇菌培养 10 h，离心收上清，取新鲜抗凝人血 5
mL，用生理盐水洗 3 次，将红细胞悬浮于 5 mL生理
盐水中;分别于离心管中加入 875 μL 生理盐水、100
μL 菌上清及 25 μL 红细胞，37 ℃ 孵育 60 min;2
000 r /min离心 2 min;D(λ)543 nm 波长下测定其
光密度 D(λ) ，各组 D(λ)值均以阴性对照校准。实
验重复 3 次。设定对照组的溶血活性为 100，计算
各组的溶血百分比。
溶血百分比 =
D(λ)实验组
D(λ)对照组
× 100%
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.06.038
2. 5 草决明对 MＲSA菌抗氧化能力的影响 细菌
处理同“2. 2”项，摇菌培养 10 h，100 μL菌液稀释涂
板，根据计数结果调整细菌浓度为 5 × 106 CFU /mL，
加入过氧化氢(浓度为 50 mmol /L)冰上孵育 1 h，
PBS洗 3 次，100 μL 菌液稀释涂板，24 h 后菌落计
数，实验重复 3 次，计算杀菌率。
杀菌率 =杀菌前细菌数 －杀菌后细菌数
杀菌前细菌数
× 100%
2. 6 草决明对 MＲSA菌毒力及其调节基因的影响
细菌处理同“2. 2”项，液氮中研磨细菌至其裂解，
TＲIZOL 法提取 ＲNA，琼脂糖电泳检测 ＲNA 的质
量。荧光定量 PCＲ的引物包括色素合成引物、凝固
酶引物、溶血素 α和 β 引物及调节基因 agr、ＲnaseH
Ⅰ、ＲnaseHⅡ、ＲnaseH Ⅲ引物，见表 1(苏州金威智
生物科技有限公司合成)。应用 Takara ＲNA PCＲ
kit(AMv)Ver. 3. 0 将 ＲNA 反转录为 cDNA 并储存
于 － 20 ℃冰箱。应用 SYBＲ Premix Ex TaqTM进行荧
光定量 PCＲ 反应，反应体系为 20 μL，循环参数如
下:95 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45s，共 40 个循环，
以 gyrA 为内对照，所有样品均为 3 个平行。采用
ΔΔCt法分析基因的相对表达水平。每个实验均单
独地重复 3 次。
表 1 引物及序列
名称 序列
crtM 5-CGCCTTTCAATCTTTCTATAATCTC-3
3-TAGTTAGCCTGTCTCACTTCGTC-5
coa 5-GAGATACAGACAATCCACATAA-3
3-CTACCTTCAAGACCTTCTAAAA-5
hlna 5-AATGAATCCTGTCGCTAATGC-3
3-AACTGTACCTTAAAGGCTGAA-5
hlab 5-GAAAAAAACAAAATCCAATTCACTA-3
3-ACTAACTTCAAATCAGTATCATCTT-5
gyrA 5-AGGTCCTGATTTCCCTACTGC-3
3-ATACGAGCCTTATTCACTTGG-5
agr 5-TGTTGTCTAAAGATAATAGCGTT-3
3-TCTAAATGGGCAATGAGTCTG-5
ＲnaseH Ⅰ 5-TTGATGCTGCGACGAAAGGA-3
3-ATTTATACAATGCCTGTTGAGCG-5
ＲnaseH Ⅱ 5-AAAGAAAAGTATGTTGAAATG-3
3-ATAATCATCACGAAAAACCT-5
ＲnaseH Ⅲ 5-TTGTCGGATAAAGACATAACG-3
3-TTGAGAATGCTGCGGTAGAAG-5
2. 7 统计学处理 数据以 x ± s表示;用 SPSS 11. 0
统计软件进行分析，用 Dunnett-t 法进行检验，P ＜
0. 05 有统计学意义。
3 结果
3. 1 细菌生长曲线观察 与对照组比较，MＲSA 菌
生长曲线无明显变化(见图 1)。说明 12. 5、3. 125
μg /mL的草决明水提液和醇提液不影响 MＲSA菌的
生长。
图 1 草决明提取物对MＲSA菌生长曲线的影响
3. 2 凝固酶效价测定 加入兔血浆 6 h 后观察结
果，对照组第 1 ～ 4 管出现凝固，效价为 1 ∶ 96;水提
液组第 1 ～ 3 管凝固，效价为 1 ∶ 48;醇提液组第 1 管
出现凝固;效价为 1 ∶ 12;说明草决明水提液和醇提
液处理 MＲSA菌后，凝固酶产生减少或明显减少。
3. 3 溶血素活性测定 水提液组平均 D(λ)值为
0. 0287，溶血活性为 41%;醇提液组平均 D(λ)值为
0. 478，溶血活性为 682. 85%;对照组平均 D(λ)值
为 0. 07，溶血活性为 100%(图 2)。
图 2 草决明对MＲSA菌溶血活力的影响
1．水提液组 2．醇提液组 3．对照组
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 01
3. 4 MＲSA菌抗过氧化氢实验结果 杀菌前细菌
数为 5 × 106CFU，杀菌后细菌数分别为:水提液组
3. 95 × 104，杀菌率 99. 21%;醇提液组 2. 55 × 104，杀
菌率 99. 49%;对照组 9. 14 × 105，杀菌率 81. 72%
(图 3)。说明草决明水提液和醇提液处理 MＲSA菌
后其抗氧化能力下降。
图 3 草决明对MＲSA菌抗氧化能力的影响
1．水提液组 2．醇提液组 3．对照组
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05
·779·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 6 期 2013 年 6 月
3. 5 实时荧光定量 PCＲ 实验结果 以 gyrA 为内
对照，除 ＲnaseHⅡ基因检测阴性外，其余基因均有
检出，且三组比较差异显著。见图 4。
图 4 荧光定量 PCＲ实验
1. crtM 2. coa 3. hlna 4. hlab 5. agr 6. ＲnaseH Ⅰ
7. ＲnaseH Ⅱ 8. ＲnaseH Ⅲ
4 讨论
金黄色葡萄球菌的致病是一个复杂过程，涉及
到胞外蛋白和细胞壁结合蛋白等毒力因子的协调
表达，在最初的定殖阶段，会涉及到细胞壁一系列
黏附素的表达，如 A 蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白结
合蛋白 、胶原蛋白结合蛋白等蛋白质的共同表达，
在细菌进入寄主体内造成感染后，会激活一系列毒
素(如溶血素脂肪酶，蛋白酶等)的表达〔1〕。全基因
组的扫描图揭示了金黄色葡萄球菌中存在 2 类主要
的调控系统: (1)双组分调控系统(two component
regulatory systems，TCＲSs) ;(2)葡萄球菌附属蛋白调
节系统(SarA 蛋白家族类 stapphylococcal accessory
protein regulator)。这两类调控系统可以同时激活
多种毒力基因的表达，金黄色葡萄球菌的毒性就是
由多种基因和蛋白质相互反馈形成的综合网络共
同作用的结果。TCＲSs 是金黄色葡萄球菌主要的调
控系统之一，其中 agr 系统是目前在金葡菌中研究
得较为清楚的一个重要的二元转导系统，包含 2 个
反向的转录单元 ＲNAⅡ 和 ＲNAⅢ 〔2〕，分别由 P2
和 P3 启动子引导。对许多附属的胞外蛋白和胞质
蛋白基因具有重要的调控作用。SarA 最初被描述
是 agr 操纵子的激活因子;它能够结合 agr 的 P2 和
P3 启动子区域，增加了 ＲNAⅡ 和 ＲNAⅢ的水平和
改变致病因子的合成〔3〕。金黄色葡萄球菌毒力因
子的调控是一个非常复杂的系统，许多调控通路可
能在金黄色葡萄球菌中出现，而在其他的葡萄球菌
中则缺失，精确的机制仍不清楚〔4〕。
草决明是豆科植物，主要含蒽醌类、萘骈-吡咯
酮类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素，具有较好降血
脂、降血压、抗氧化、抗衰老等疗效。程玲铃等〔5〕发
现其乙醇提取物与氯仿提取物对镰刀菌、弯孢菌、
金黄色葡萄球菌等都有一定的抑菌作用。本研究
结果证实，12. 5 μg /mL 和草决明水提液 3. 125 μg /
mL草决明醇提液对 MＲSA 菌生长曲线无明显影
响;草决明减少了 MＲSA 菌色素合成，与对照组比
较差异显著;草决明作用后 MＲSA 菌毒力表达发生
变化，血浆凝固酶产生减少，与对照组比较差异显
著，并与荧光定量 PCＲ 结果一致;血浆凝固酶基因
与色素合成基因变化趋势一致，说明 MＲSA 菌色素
合成基因与凝固酶合成基因受共同的调控基因调
控;草决明作用 MＲSA 菌后，水提液组溶血素活性
降低，醇提液组则升高，与对照组比较差异显著，与
荧光定量 PCＲ结果中 α 溶血素基因测定一致，但 β
溶血素基因测定值两组均降低，一方面说明葡萄球
菌的溶血活性主要与 α 溶血素有关，另一方面说明
α和 β溶血素基因分属于不同的调控基因调节;草
决明作用 MＲSA菌后其抗过氧化氢能力发生变化，
与对照组比较，水提液组和醇提液组抗氧化能力均
显著降低;此变化趋势与色素合成基因检测结果一
致，说明 MＲSA菌色素含量与其抗氧化能力密切相
关;调控基因定量结果显示:agr 在草决明处理组基
因含量减少，与对照组比较差异显著;ＲnaseHⅡ三
组均未检测到，ＲnaseHⅠ和 ＲnaseH Ⅲ变化趋势与
agr相同，都有下降趋势，与对照组比较差异显著;说
明 ＲNaseHⅠ、ＲnaseH Ⅲ参与了对 MＲSA 菌毒力的
调控。溶血素基因与调控基因变化趋势不一致，说
明其合成未受 agr的影响。
笔者的实验结果表明:草决明具有调节 MＲSA菌
色素合成及毒力产生的作用，其调控基因与 agr有关。
参 考 文 献
［1］ Tamber S，Ｒeyes D，Donegan NP，et al． The staphylococcus-
specific gene rsr represses agr and virulence in Staphylococ-
cus aureus［J］． Infect Immun．，2010，78(10) :4384-4391．
［2］ Kiran MD，Balaban N． TＲAP plays a role in stress response
in Staphylococcus aureus［J］． Int J Artif Organs，2009，32
(9) :592-599．
［3］ Lopez-Leban F，Kiran MD，Wolcott Ｒ． Molecular mecha-
nisms of ＲIP，an effect-tive inhibitor of chronic infections．
［J］． Int J Artif Organs，2010，33(9) :582-589．
［4］ Cheung A L，Nishina K A，Trotonda M P，et al． The SarA
protein family of Staphylococcus aureus［J］． The Interna-
tional Journal ofBiochemistry ＆ Cell Biology，2008，40(3) :
355-361．
［5］程玲铃，孙梅，涂凌． 决明子提取物对植物病原菌的抑
菌活性初探［J］． 四川理工学院学报(自然科学版) ，
2005，18(2) :53-55．
·879· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 6 期 2013 年 6 月