全 文 ：　文章编号:1001-3717(2002)01-0003-04
提取条斑紫菜高纯度总 DNA 及其质粒状
DNA 的新方法
郭宝太1 , 夏连胜1 ,姜国勇1 ,毕玉平2 ,戴继勋3
(1.莱阳农学院农学系 , 山东莱阳 265200;2.山东省农科院生物技术中心;3.青岛海洋大学海洋生命学院)
摘要:本文报道提取条斑紫菜高纯度总 DNA 及其质粒状 DNA 的新方法。先用海螺酶处理紫菜叶状体制备紫菜
体细胞 ,然后用 SDS-蛋白酶 K 裂解细胞提取总 DNA , 再用 Wizard DNA clean-up 树脂对其纯化 , 经纯化后的总
DNA能被 EcoRI、PstI 等限制酶完全酶解 , 并在酶切图谱上形成明显的 DNA 带型。当用异硫氰酸胍—十二烷基肌
氨酸钠裂解紫菜细胞时 ,在总 DNA提取物中直接发现有一条质粒状 DNA 带 , 即建立了一种极简便的质粒状 DNA
提取方法。
关键词:条斑紫菜;体细胞;总 DNA;限制性酶切;质粒状 DNA
中图分类号:Q503　　　　文献标识码:A
New Methods for Extraction of Plasmid-like DNA and High-Quality
Total DNA from Porphyra yezoensis
GUO Bao-tai1 , XIA Lian-sheng1 , JIANG Guo-yong1 , BI Yu-ping2 , DAI Ji-xun3
(1.Dept.of Agronomy , LAC , Laiyang 265200 ,C hina;2.Biotechnology Research Center , Shandong Academy of Agricultural S cience;
3.College of Marine Life Science , Ocean University of Qingdao)
Abstract:Somatic cells were prepared f rom sea snail enzyme digests of Porphyra yezoensis thalli.Using SDS-
Pro teinase K as ex traction solution , total DNA was isolated from the somat ic cells.The crude ext racts of total
DNA were purif ied wi th Wizard DNA clean-up resin , and the resulting DNA was of sufficient quality fo r diges-
tion of restriction endonuclease.DNA bands w ere clearly observed in the restriction pat terns of EcoRI , PstI re-
spectively .The presence of DNA bands in the restriction pat tern of total DNA indicated that the genome of Por-
phyra yezoensis may be small.Unexpectedly , using guanidinium isothiocyanate and sarcosyl as ex traction solu-
tion , a plasmid-like DNA band(2.3 Kb)was directly found in the isolated total DNA of Porphyra yezoensis.
A very simple and convenient method for isolation of plasmid-like DNA has been established.
Key words:Porphyra yezoensis;somatic cells;total DNA;restriction digestion;plasmid-like DNA
　　由于藻胶(多糖)含量较高 ,紫菜 DNA的提取 ,
特别是高纯度紫菜 DNA 的提取比较困难。为了避
免液氮破碎后多糖的严重干扰 ,Hong 等(1992)建立
了一种用 LiCl软化紫菜组织让 DNA直接透出细胞
而无细胞裂解步骤的提取方法[ 1] ,但此法的 DNA
得率低 ,纯度也不高 。Kitade 等(1996)建立了一个
提取条斑紫菜高纯度且大分子量 DNA 的程序[ 2] ,
其中包括液氮破碎 、异硫氰酸胍 —十二烷基肌氨酸
钠裂解 、CsCl密度梯度离心及 CTAB去除残余多糖
等一系列步骤。用此程序提取的 DNA 纯度高且分
子量大 ,能满足多种分子生物学分析的要求 ,但该程
序操作复杂 ,用时长 ,花费昂贵 ,不是简便的常规方
法 。Shivji等(1991)在条斑紫菜质体 DNA 富集物
中发现有质粒状 DNA[ 3] ,但提取方法复杂 、得率低 ,
直接影响了其研究 。本研究拟建立简便可靠的紫菜
高纯度总 DNA及其质粒状 DNA的提取方法 。
莱 阳 农 学 院 学 报　19(1):3 ～ 6 , 2002
Journal of Laiyang Agricultural College
收稿日期:2001-07-31
作者简介:郭宝太(1963-),男,山东青州人 ,博士 ,教授 ,现主要从事植物分子生物学与植物基因工程方面的教学和研究工作。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
条斑紫菜叶状体由日照市海水育苗厂提供 ,洗
净后晾至半干 , -20℃保存 ,随时取用。海螺酶为青
岛海洋大学产品 , SDS 、蛋白酶 K 分别为 Serva 与
Merck产品 。异硫氰酸胍及十二烷基肌氨酸钠分别
是Boehringer与 Sigma 产品 。限制性内切酶与Wiz-
ard DNA clean-up 试剂盒购自 Promega公司。
1.2　紫菜总 DNA 的提取
1.2.1　紫菜细胞的大量制备　参照戴继勋等描述
的方法[ 4]并作改进。取出 2g 冷冻保存的紫菜叶状
体 ,剪成碎片 ,加入适量酶液(2%海螺酶 ,2mol/ L 葡
萄糖),于 30℃酶解 2h。无菌水稀释酶解物 ,筛绢过
滤 ,滤液经 5000rpm ,10℃离心 5min(Sorvall RC28S
离心机 ,GSA转子)收集细胞。无菌水悬浮 、洗涤细
胞一次 ,离心后重新收集细胞 。
1.2.2　细胞的裂解与裂解物的抽提　用 10m l的
3%SDS , 150mmol/L EDTA , 50mmol/L Tris -
HCl , pH8.0 , 0.2mol/L NaCl , 0.2%β -巯基乙醇
裂解液悬浮紫菜细胞 , 加蛋白酶 K 至终浓度为
300μg/ml , 55℃水浴 1.5h ,中间搅拌几次。取出裂
解物 ,降至室温后用等体积水饱和酚抽提 1次 ,酚/
氯仿抽提 2 ～ 3次至水相无色透明且水相与有机相
的界面处不再有沉淀为止 ,最后用氯仿抽提 1次 。
抽提时都用SS34转子 ,10000rpm ,10℃离心 8min。
1.2.3　总核酸与总 DNA 的获得　在抽提后清澈
的水相中加预冷的 0.6 倍体积的异丙醇 , 4℃静置
20min。12000rpm , 15℃离心 10min后弃上清 。沉
淀用 70%乙醇洗 1 次室温晾干。加 3mlTE 溶解沉
淀即得总核酸提取液 。在总核酸中加 RNase A 至
终浓度为 25μg/ml , 37℃消化 lhr去除 RNA 。将消
化物分至 1.5ml Eppendorf 管中 ,用酚 、酚/氯仿 、氯
仿各抽提 1 次。上清中加 0.1 倍体积的 3mol/L
NaAc 与 0.6 倍体积的异丙醇 , 4℃放置 30min。
13000rpm 离心 8min 后弃上清。沉淀用 70%乙醇
洗两次 ,室温晾干或热风吹干 ,最后用无菌双蒸水溶
解沉淀即得总 DNA粗提物。
1.3　总 DNA的纯化与酶切
纯化紫菜总 DNA时 ,改用 60%乙醇 , 20mmol/
L Tris-HCl , pH 8.0 , 1mmol/ L EDTA , 0.1mol/L
NaCl作洗涤液 ,并对洗涤液用量与 DNA 洗脱条件
进行了优化。具体方法是先将总 DNA用双蒸水稀
释至 500μl ,再将 DNA 溶液与 1m l纯化树脂混匀 ,
然后上柱 。真空抽滤至树脂刚刚干燥 ,加 2.5ml洗
涤液后再抽滤至树脂干燥。取下微型层析柱 ,将其
装至一个 1.5ml Eppeddorf 管上 , 10000rpm 离心
2min ,去净树脂中残余的洗涤液 。取下微型柱 ,加
50μl 68℃预热的双蒸水 ,静置 1min ,将微型柱装至
一个新的 Eppeddorf 管上 , 然后 10000rpm 离心
1min 。收集到的液体即为纯化的 DNA 溶液 ,可直
接用于酶切反应 。作酶切反应时 ,限制酶用量为
10u/1μg 总 DNA ,37℃保温 6h或过夜 。
1.4　质粒状 DNA的提取
细胞裂解 液变为:4mol/L 异 硫氰 酸胍 ,
50mmol/L Tris-HCl , pH8.0 , 2%十二烷基肌氨酸
钠 , 0.2%β-巯基乙醇 ,其它步骤与提取总 DNA时
相同 。采用 NaAc 法[ 5] 去除总核酸中的 RNA。具
体操作如下:取 1ml总核酸 ,加 3ml的4M NaAc ,混
匀后-20℃静置 1h。取出混合物于 4℃,12000rpm
离心 10min ,留上清 ,弃去 RNA沉淀 。上清中先加
水至 10ml ,然后加 2v 体积的无水乙醇 , 4℃放置
30min。13000rpm , 15℃离心 8min 后弃上清 ,沉淀
用 70%乙醇洗两次 。将沉淀用热风吹干 ,然后加适
量无菌双蒸水溶解 ,即得总 DNA 溶液 ,电泳检测总
DNA中是否有质粒状 DNA 。
1.5　电泳
总核酸 、总 DNA 、质粒状 DNA 提取结果及总
DNA酶切结果走 0.8%琼脂糖凝胶电泳检查。电
泳时用 TAE缓冲液 ,电压为 5v/cm 。
图 1　条斑紫菜总核酸与总 DNA的提取结果
a.λDNA/ EcoRI+HindⅢ;b.总核酸;c.总 DNA
4　　 　　　　　 　　　　　　　　　　　莱　阳　农　学　院　学　报　　　　　　　　　　　 　　　　　　19 卷
2　结果与分析
2.1　总 DNA的提取
紫菜 DNA提取的难点在于多糖干扰。用海螺
酶制备的紫菜细胞已去除了大部分细胞壁(多糖),
用SDS-蛋白酶 K 裂解紫菜细胞后裂解物感觉不
到粘性 ,酚抽提等操作十分方便 ,提取的总核酸与总
DNA中高分子量(high molecular weight , HMW)
DNA带 ,即主带 ,清晰完整(图 1-b , c),符合要求 。
由于细胞裂解彻底 , DNA 得率明显提高 ,提取的总
DNA中多糖污染也明显减少。本研究建立的以细
胞为裂解材料的提取法(简称细胞法)直接解决了液
氮破碎后裂解物粘稠而操作不便 、DNA 得率低且有
严重的多糖污染等难题 。与液氮破碎法相比 ,细胞
法所需条件温合 、操作也更方便。
a　　b　 　c　 　d　　e
图 2　纯化后的紫菜总 DNA 的酶切结果
a.λDNA/ EcoRI+HindⅢ;b.条斑紫菜总 DNA/ EcoRI;
c.坛紫菜总 DNA/ EcoRI;d.条斑紫菜总DNA/ PstI;
e.坛紫菜总 DNA/ Pst I
2.2　总 DNA的纯化
用细胞法提取的总 DNA 中仍有少量多糖污
染 ,纯度达不到限制酶酶切的要求 。本研究用Wiz-
ard DNA Clean-up层析柱对其进行了纯化。每个
微型层析柱可上 DNA样品 4 ～ 5μg ,一次纯化需时
不足 10min ,回收率高于 70%。研究发现用试剂盒
推荐的 80%异丙醇作洗涤液时 , 多糖去除效果不
好 ,DNA纯度达不到限制酶酶切反应的要求。改用
新的洗涤液后 ,多糖去除彻底 ,纯化后的条斑紫菜总
DNA能被限制酶酶切 ,并且发现在 EcoRI、PstI 的
酶切图谱上有明显的带型 (图 2-b , d), 总 DNA
经酶切后能形成稳定的图谱与带型表明酶切反应完
全 ,同时也表明改用新的洗涤液后已获得了高纯度
的条斑紫菜 DNA 。应用此纯化法也可获得高纯度
坛紫菜 DNA(图 2-c , e), 表明该法可普遍地用于
纯化紫菜 DNA 。
2.3　质粒状 DNA的提取
当用异硫氰酸胍-十二烷基肌氨酸钠作裂解液
时 ,意外地发现在提取的总核酸及总 DNA 中都有
一条含量相对较高的质粒状核酸带(图 3-b , c),
其大小与 2.3Kb的线状 DNA 相对应 。在总核酸与
总 DNA 中同时存在 ,表明它是一条质粒状 DNA
带 。在提取物中质粒状 DNA 带型清晰 ,相对含量
较高 , 超过总 DNA 的 10%,表明提取方法非常有
效 。
藻类质粒状 DNA一般是在 CsCl密度梯度离心
后获得的质体 DNA富集物中发现的 ,在总 DNA电
泳图谱上一般见不到质粒状 DNA ,提取的困难严重
地影响了质粒状 DNA 的研究 。本试验在条斑紫菜
总 DNA中直接提取到了质粒状 DNA ,与 CsCl密度
梯度离心法相比 ,此提取程序不需要超速离心机等
设备 ,操作方便 ,是一种常规方法 ,也就是说建立了
一种极简便的提取方法 ,为紫菜质粒状 DNA 的研
究提供了更大的技术方便。
图 3　条斑紫菜质粒状 DNA的提取结果
a.λDNA/ EcoRI+HindⅢ;b.总核酸;c.总 DNA
1.主带 2.质粒状 DNA带 3.RNA
3　讨　　论
3.1　总 DNA的提取与纯化
除了多糖的严重干扰外 ,细胞中有非常高的
DNA酶活性也是大型海藻 DNA 提取难的一个重要
51 期　　　　 　　　　　郭宝太 ,等:提取条斑紫菜高纯度总 DNA 及其质粒状 DNA的新方法　　　　　　　　　　
原因[ 6] 。本研究发现当用细胞作材料 , 裂解液中
EDTA与蛋白酶 K浓度分别为 100mmol/ L 、100μg/
ml时 ,提取的 DNA 于 4℃放置 2 ～ 3d就有降解迹
象 ,有明显的 DNA 酶活性。当裂解液中 EDTA 为
150mmol/L ,蛋白酶 K 浓度提高到 300μg/ml时 ,提
取的 DNA非常稳定 ,完全克服了高活性 DNA 酶的
干扰。有力地抑制 DNA 酶活性 ,减少 DNA 酶降解
造成的 DNA 损失是提取紫菜等大型海藻 DNA 时
必须考虑的一个问题 。
换用新的洗涤液后 ,本研究成功地将 Wizard
DNA clean-up树脂用于纯化紫菜总 DNA粗提物 ,
获得了高纯度 DNA , 为进行 Southern 杂交 、RFLP
及AFLP 分析打下了基础。此法操作简便 ,一次纯
化只需要几分钟 ,另外花费不高 ,且效果非常稳定 。
值得注意的是在紫菜总 DNA 酶切图谱上有
DNA带型。一般而言 ,线粒体与叶绿体基因组较
小 ,高纯度线粒体 、叶绿体 DNA 酶切后才形成清晰
的带型[ 7] 。总 DNA 酶切图谱上有明显的 DNA 带
型可能与条斑紫菜基因组较小有关 ,但也不排除由
其它原因造成的可能 。
3.2 质粒状 DNA的提取
同样以细胞为材料 ,以 SDS-蛋白酶 K 作裂解
液提取的总核酸与总 DNA 中没有质粒状 DNA 带
(图 1-b , c),这可能是质粒状 DNA与蛋白质结合
紧密 ,酚抽提时与蛋白质共沉淀 ,造成质粒状 DNA
丢失所致。异硫氰酸胍是强的解偶联剂 ,能把蛋白
质与核酸分开 ,酚抽提时质粒状 DNA 不易丢失 ,所
以用异硫氰酸胍-十二烷基肌氨酸钠作裂解液时能
提取到质粒状 DNA。
用异硫氰酸胍-十二烷基肌氨酸钠作裂解液 ,
裂解物与酚互溶 ,分相效果差 ,要用酚/氯仿抽提 ,且
抽提效果也不佳。因此只将裂解物初步抽提后就把
总核酸沉淀下来 , TE 溶解后再用酚 、酚/氯仿 、氯仿
依次抽提 ,此时可迅速抽提掉蛋白质等杂质。
研究还发现用异硫氰酸胍-十二烷基肌氨酸钠
作裂解液提取的总核酸于 4℃放置几天 , 就出现
DNA被降解的迹象 ,有明显的 DNA 酶活性。从总
核酸中去除 RNA 时 ,本研究采用 NaAc法 ,目的就
是避免用 RNase A处理时保温造成的 DNA损失。
藻类质粒状 DNA 是藻类基因工程的潜在载
体 ,本文在日照产条斑紫菜中发现有质粒状 DNA
对我国紫菜基因工程的研究有非常积极的意义 。
参考文献:
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26:209-214.
“五龙鹅品种选育”课题通过鉴定
由山东省科技厅下达的莱阳农学院王宝维教授主持完成的“五龙鹅品种选育”“九五”重点攻关课题 ,于
2001年 12月 29日通过了鉴定 ,省内外专家一致认为经系统选育的五龙鹅品种繁殖性能达到国际领先水
平。
五龙鹅属于优质的草食水禽 ,开展五龙鹅的育种和产业化开发 ,符合我省发展节粮高效畜牧业的总战
略 ,对充分发挥利用当地资源 ,如农作物副产品 、荒山野草等 ,促进生态环境的良性循环具有重要的作用 。另
外 ,鹅为草食动物 ,抗病力很强 ,生长发育快 ,在自然状态下生长繁殖 ,不使用配合料和添加剂 ,因而其产品为
上等的绿色食品 ,对促进健康非常有益 。加上粪便对环境几乎没有污染能力 ,作为农作物的优质肥料充分利
用。因此 ,养鹅业是一项前景广阔的养殖业 ,具有非常显著的社会经济效益和生态效益。
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