全 文 ：FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食 品 科 技
2010年 第 35卷 第 11期
Study on antimircrobial and immunomodulation actitvities of
extracts from Chondrus ocellatus
KONG Na-na, ZHOU Ge-fei, WANG Chang-hai*
(Ocean School of Yantai University, Yantai 264005)
Abstract: Objective: To study the antimircrobial and immunomodulation actitvities of extracts from Chondrus
ocellatus. Methods: The samples were extracted with ethanol, and then extracted with petroleum ether, ethyl
acetate, n-butanol. Nine kinds of extracts (P1 to P9 ) were prepared by silica gel column chromatography from
extraction of petroleum ether of Chondrus ocellatus. Effect on growth of Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, yeast bread and candida were studied. T -lymphocytes and macrophage cells were obtained from
healthy mice for improved lymphopoiesis test as well as NO production of murine peritioneal macrophages.
Results: P4, P6, P7, P8 could inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli, but P3 and P5
could only inhibit the growth of Staphylococcus aureus. All extracts had no effect on yeast bread and candida.
The minimum inhibitory concentration (MIC) of P5, P6, P7, P8 to Escherichia coli were 25, 50, 25, 12.5 mg/mL,
and the MIC of P3, P4, P5, P6, P7, P8 to Staphylococcus aureus were 6.25, 12.5, 25, 100, 50, 6.25 mg/mL.
Nine exacts had stimulating activities on cells mediated immunity in mice. Some extracts could significantly
孔娜娜， 周革非， 王长海 *
（烟台大学海洋学院，烟台 264005）
摘要： 目的：研究角叉菜不同提取物的抑菌和免疫活性。方法：将角叉菜的乙醇提取物依次用
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，取石油醚相进行硅胶柱层析得到 9种提取物 P1-P9，对 9
种提取物进行抑菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、面包酵母菌和假丝酵母菌)活性的研究，通过小
鼠脾淋巴细胞增殖实验和 NO释放实验检测免疫活性。结果：抑菌实验结果表明，P4、P6、P7、
P8均能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，P3和 P5只能抑制金黄色葡萄球菌的生长，所
有的提取物均不能抑制面包酵母菌和假丝酵母菌，P5、P6、P7、P8对大肠杆菌的最低抑菌浓度
(MIC)分别为 25、50、25、12.5 mg/mL，P3、P4、P5、P6、P7、P8对金黄色葡萄球菌的 MIC分
别为 6.25、12.5、25、100、50、6.25 mg/mL；免疫实验表明，9种角叉菜提取物对小鼠免疫细胞
具有不同的刺激能力，有些提取物能显著促进脾淋巴细胞的增殖，并能促进小鼠腹腔巨噬释放
NO。结论：角叉菜提取物有一定的抑菌和免疫活性。
关键词： 角叉菜；硅胶柱层析；抑菌活性；免疫调节
中图分类号： R 284.2 文献标志码： A 文章编号： 1005-9989(2010)11-0219-04
角叉菜提取物的抑菌和
免疫活性的研究
收稿日期： 2010-01-04 *通讯作者
基金项目： 山东省中青年科学家科研奖励基金项目(2008BS06012)；烟台市科技发展计划项目(2008GGA0020080410084458)。
作者简介： 孔娜娜(1985—)，女，山东枣庄人，硕士研究生，研究方向为海洋生物活性物质。
提取物与应用
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DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2010.11.071
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食 品 科 技
2010年 第 35卷 第 11期
角叉菜为潮间带海藻，俗称海木耳，自然分
布于我国东部沿海。属于红藻门(Rhodpophyta)、红
藻纲(Florideophyceae)、杉藻目(Gigartinales)、杉藻科
(Gigartinaceae)，角叉菜属[1]。
角叉菜具有多方面的生理活性，据海洋药物
辞典[2]记载：该藻全体均可食、入药，具有润肠通
便、和血消肿、止痛生肌之功效，主治慢性便秘、
骨折、跌打损伤等症。随着对天然产物药理活性
研究的深入，角叉菜多方面的生理活性被发现，
如抑菌、免疫、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血糖
等，已经引起国内外学者和产品研发人员的广泛
关注[3-5]。角叉菜虽然具有确切的生物活性，但是
其活性成分尚未得到有效的确认，从而使其进一
步地开发应用受到限制。本文以乙醇为溶剂对角
叉菜进行提取，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正
丁醇萃取，然后对石油醚部位进行硅胶柱层析得
到 9种提取物，并对这 9种提取物进行抑菌及免
疫活性的研究，为角叉菜这一药用资源的研究开
发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
角叉菜：采于烟台养马岛，由中科院海洋研
究所徐祖洪、李智恩研究员鉴定为角叉菜属植物
Chondrus ocellatus。自来水清洗，除去泥沙和杂藻，
样品自然阴干并粉碎，塑料袋封口室温保存；大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵母菌和面包酵
母菌：烟台大学海洋学院微生物实验室提供；清
洁级昆明种小鼠，雌雄不限，体重 18~22 g(由山东
绿叶制药有限公司提供)；LB培养基和马铃薯培养
基；噻唑蓝(MTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)：Sigma
公司；RPMI-1640培养基：Gibco公司；新生小牛
血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；实验
所用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
WD-9403A型荧光-紫外分析仪(紫外光源波长
254、300、365 nm)：北京市六一仪器厂；ELX-
800 酶联免疫检测仪：美国 Bio-Tek Instruments
INC.；CO2培养箱：美国希尔顿；96 孔细胞培养
板：美国 Coastar 公司；台式高速冷冻离心机：
Anke TGL-16G；全自动立式电热压力蒸气灭菌
器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2 实验方法
1.2.1 角叉菜活性成分的分离提取 将角叉菜粉
末置于 4倍于其体积的 90%乙醇溶液中冷浸 7 d，
并连续提取 4次，合并提取液，在 50 ℃下真空旋
蒸，得深绿色油状浸膏。将得到的浸膏加水悬浮，
分别用等量石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取数次，
合并各萃取液并在合适的温度下真空旋蒸得到浸
膏。取石油醚萃取相进行硅胶柱层析，用洗脱剂
分别为石油醚：乙酸乙酯=6∶1、3∶1、1∶1、1∶3、0∶
1、丙酮和甲醇进行梯度洗脱，并对洗脱液进行
TLC跟踪，并根据颜色和 Rf值进行合并得到 9种
提取物 P1~P9。
1.2.2 活性成分的抑菌试验 采用纸片扩散法进
行抑菌试验，首先制备菌含量为 5×105 cfu/mL~5×
106 cfu/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假丝酵
母菌和面包酵母菌的菌悬液。在 LB培养基中均匀
涂布大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在马铃薯培养
基中涂布假丝酵母菌和面包酵母菌，置室温干燥 5
min。将上述 9 种提取物用石油醚配制成浓度为
100 mg/mL的溶液，各取 10 μL，分 2次滴加在干
燥的无菌滤纸片上(直径为 5 mm)，待溶剂挥发干
燥后用无菌镊子夹取带药的滤纸片水平放入培养
基上，用石油醚作为空白对照。每个培养皿中放 5
片，每个样品做 3 个平行。然后将大肠杆菌和金
环色葡萄球菌的平板置 37 ℃培养箱中，面包酵母
菌和假丝酵母菌的平板于 28 ℃的培养箱中，培养
18~24 h后用十字交叉法测量抑菌圈的直径。
将上步有抑菌效果的角叉菜提取物稀释到终
浓度分别为 100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/
mL。取 2 mL 提取物稀释液至 15 mL 培养基，混
匀后倒入平板，凝固后加入 100 μL 106~107 cfu/mL
的菌液，涂布均匀，细菌 37 ℃、真菌 28 ℃培养
24 h后观察结果。菌落被完全抑制的最高稀释度
提取物浓度即最低抑菌浓度 MIC[6]。
1.2.3 活性成分的免疫试验
1.2.3.1 脾淋巴细胞增殖实验 [7-8] 将 P1~P9九种
promote spleen T -lymphocyte proliferation and NO production of murine peritioneal macrophages. Con -
clusion: The conclusion is that some extracts have antimircrobial antivitie and can advance the immunity of
healthy mice.
Key words: Chondrus ocellatus；silica gel column；antimircrobial actitvities；immunomodulation actitvities
提取物与应用
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提取物用 0.2%二甲基亚砜配制终浓度分别为 12.5、
25、50、100、200 μg/mL 的溶液，经 0.22 μm 无
菌膜过滤除菌。小鼠脱颈处死，无菌取脾，制备
小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为 8×106~10×
106 cfu/mL。向 96孔培养板中每孔加入 100 μL细
胞悬液，再加入 100 μL培养液(空白对照)、10 μg/
mL ConA(阳性对照)及不同浓度的样品溶液，振荡
混匀后，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 72 h。
终止培养前 4 h，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 20
μL，混匀后继续培养 4 h。培养结束后，小心吸弃
上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亚砜，振荡 10
min使紫色结晶完全溶解，即在酶联免疫检测仪上
测 570 nm处的吸光度。
淋巴细胞增殖指数 SI=供试样品组吸光值/空
白对照组吸光值。
1.2.3.2 一氧化氮(NO)诱生量的测定 采用亚硝酸
盐法测定[9]。取处于对数生长期的小鼠单核-巨噬
细胞 RAW264.7，胰酶消化收集细胞，用含 10%胎
牛血清的培养液调整细胞浓度为 5×106 cfu/mL，加
入 96孔板，100 μL/孔，贴壁 2 h后，换新鲜培养
液，再加 100 μL培养液(空白对照)、LPS阳性对
照(终浓度为 2 μg/mL)、及不同浓度的样品溶液，
样品浓度同 1.2.3.1，37°C、5%CO2 培养条件下，
培养 48 h后，从每个孔取 50 μL培养上清液到一
个新的 96 孔板中，加入 Griess 试剂，室温反应
10 min，半小时内测 540 nm处的吸光度，试验重
复 3次。
2 结果与分析
2.1 角叉菜抑菌试验结果
由表 1 角叉菜提取物的抑菌试验结果可知，
P4、P6、P7、P8均能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄
球的生长，P3和 P5只能抑制金黄色葡萄球菌的生
长，所有的提取物均不能抑制面包酵母菌和假丝
酵母菌的生长。
表 2是有抑菌作用的角叉菜提取物的最低抑
菌浓度，不同提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球
菌的最低抑菌浓度不同。
2.2 角叉菜提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
由图 1结果可知，角叉菜各提取物免疫活性
差别很大。P1、P2、P3、P7对小鼠脾淋巴细胞无
增殖作用 (P>0.05)。P4、P5、P6、P8 在 12.5~
100 μg/mL 范围内可显著或极显著促进脾淋巴细
胞增殖(P<0.05或 P<0.01)，并且呈现先增大后减
小的趋势。P9在 12.5~200 μg/mL范围内增殖作用
显著(P<0.05或 P<0.01)，且呈现出剂量依赖性，最
大增殖指数达到 2.26。
2.3 角叉菜粗提物对小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO
的影响
将吸光度代入标准曲线方程 y =0.0027x +
0.0555，R2=0.9989，求得 NO 的含量，如图 2 所
示。P2、P3、P9在 12.5~100 μg/mL范围内可明显
表 1 角叉提取物的抑菌圈直径实验结果 mm
菌种 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 面包酵母菌 假丝酵母菌
P1 0 0 0 0
P2 0 0 0 0
P3 0 14.0 0 0
P4 13.1 13.5 0 0
P5 0 13.2 0 0
P6 10.2 12.3 0 0
P7 14.4 13.5 0 0
P8 9.2 10.5 0 0
P9 0 0 0 0
注：以上结果均为 3个重复实验的平均值，所有阴性对照均无抑菌
圈产生。
表 2 角叉菜提取物最低抑菌浓度实验结果 mg/mL
菌种 P3 P4 P5 P6 P7 P8
大肠杆菌 - - 25 50 25 12.5
金黄色葡萄球菌 6.25 12.5 25 100 50 6.25
提取物与应用
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地促进小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO (P<0 .05 或
P <0.01)，且呈现先增大后减小的趋势。P1 在
12.5~100 μg/mL范围内促进作用显著(P<0.05或 P<
0.01)，并且呈现出剂量依赖性。P7在 12.5~50 μg/
mL促进作用显著(P<0.05或 P<0.01)，随浓度的增
大促进作用减小。
3 讨论
海藻富含多种生命活性物质，日渐成为潜在
的药物资源。众多研究报道表明，海藻成分具有
良好的抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗细菌、免疫
增强或抑制、抗氧化、防治脑心血管疾病、抑制
某些靶酶等生物活性[10-11]。
本文将角叉菜的乙醇提取物经石油醚、乙酸
乙酯、正丁醇萃取，并将石油醚相进行硅胶柱层
析得到 9种提取物，并对这 9种提取物进行了抑
菌和免疫活性的研究。抑菌试验表明，角叉菜石
油醚相柱层析提取物 P4、P6、P7、P8对大肠杆菌
和金黄色葡萄球的生长有不同程度的抑制作用，
P3和 P5只能抑制金黄色葡萄球菌的生长，所有的
提取物对面包酵母菌和假丝酵母菌均无抑制作用。
角叉菜提取物对所选细菌有较强的抑制效果，而
对真菌没有作用，这可能与提取物的组成有一定
的关系，因此有必要对这些提取物的成分以及对
其他细菌和真菌的作用做进一步的研究。
正常的免疫功能对机体预防疾病、促进患者
机体康复等具有重要意义。脾脏是机体内重要的
免疫器官，也是体外试验中淋巴细胞的重要来源。
测定脾淋巴细胞体外增殖反应是检测淋巴细胞功
能的常用方法 [12-13]。对提取物的免疫实验结果表
明，P4、P5、P6、P9对小鼠脾淋巴细胞的增殖作
用显著(P<0.05或 P<0.01)。P9 在 200 μg/mL 时最
大增值率达到 2.26。小鼠腹腔巨噬细胞产生 NO实
验表明，P2、P3、P9在 12.5~100 μg/mL范围内促
进作用显著(P<0.05或 P<0.01)，并且呈现先增大后
减小的趋势。P1在 12.5~100 μg/mL范围内促进作
用显著(P<0.05或 P<0.01)，并且呈现出剂量依赖
性。P7在 12.5~50 μg/mL促进作用显著(P<0.05或
P<0.01)，随浓度的增大促进作用减小。由此可以
看出，对于同一免疫指标，不同提取物的最佳反
应浓度不同，量效关系不一致，且不同提取物对
同一免疫指标的影响程度有较大差别，另外，同
一提取物对不同免疫指标作用结果也不一致，这
可能由于其对免疫细胞的作用机制不同造成的。
因此，对这些提取物的免疫作用做出准确的评价
还要进行进一步的实验研究。
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