全 文 ：亲水色谱法测定甜叶菊叶片中糖苷含量
史一鸣，杨虹*，李燕艳，杨天奎
（丰益（上海）生物技术研发中心有限公司，上海 200137）
摘 要：建立测定甜叶菊叶片中三种主要糖苷成分：蛇菊苷、莱鲍迪苷 C以及莱鲍迪苷 A的高效液相色谱方法。选用
70 %（g/g）的乙醇/水溶液为萃取溶剂，超声法提取甜叶菊叶片中的糖苷成分，步骤简单灵活。液相色谱分析条件建在
亲水原理基础上，采用 ZORBAX-NH2柱，乙腈、水为流动相梯度洗脱，外标法定量。该方法分离度和线性良好，三种组
分回收率在 90 %以上，能满足不同品种甜叶菊叶片糖苷含量的测定。利用该方法对 5种甜叶菊样品进行了分析，结
果准确，重复性好，是一种可信的方法。
关键词：甜叶菊；蛇菊苷；莱鲍迪苷 A；莱鲍迪苷 C；高效液相色谱法
HILIC Determination of Diterpene Glycosides of the Leaves of Stevia Rebaudiana Bertoni
SHI Yi-ming， YANG Hong*， LI Yan-yan， YANG Tian-kui
（Wilmar Biotechnology Research＆Development Center（Shanghai）Co.，Ltd.， Shanghai 200137，China）
Abstract：An analytical method was developed which can be be used determination of Stevioside， Rebaudioside
C and Rebaudioside A contents in dried leaves of Stevia rebaudiana bertoni. Diterpenoid glycosides were
extracted with 70 % （w/w） ethanol by ultrasonic method which was simple and quick. The chromatographic
analysis was performed on a NH2-column by using acetonitrile -water as mobile phase with linear gradient
elution， and through external standard method to calculate. The method was proved to be good in separating
degree，linear and detection limit. The recoveries of three components were all higher than 90 %. Using this
method to determinate five kinds of samples， the results were accurate. This method was a trustworthy method，
and can be used in the quantitative determination of diterpene glycosides of the leaves of Stevia rebaudiana
bertoni.
Key words：Stevia Rebaudiana Bertoni；Stevioside；Rebaudioside A；Rebaudioside C；High-performance liquid
chromatographic
作者简介：史一鸣（1987—），男（汉），工程师，学士，主要从事天然产
物提取、分离及分析方面工作。
*通信作者
甜叶菊糖苷（Steviol glycosides）是一种从甜叶菊茎
叶中提取的天然甜味剂，被誉为“世界第三糖源”。与
蔗糖、葡萄糖、甜蜜素、阿斯巴甜等甜味剂相比，甜叶菊
糖苷具有热量小、甜度高、口感好、耐高温、稳定性高等
特点[1]。1995年 9月 18日，FDA批准甜叶菊糖苷可以
作为“膳食补充剂”进行销售和消费。2004年 7月 6日
世界联合卫生组织正式通过允许甜叶菊糖苷在世界
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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收稿日期：2012-04-19
检测分析
食品研究与开发
Food Research And Development
2012年 12月
第 33卷第 12期
134
范围内通用的决议[2]。我国在 GB 2760-2011《食品添加
剂使用标准》中明确规定，甜菊糖苷作为甜味剂允许
在蜜饯凉果、熟制坚果与籽类、糖果、糕点、调味品、饮
料类、膨化食品生产加工中按生产需要适量使用[3]。这
些都为甜叶菊糖苷的使用提供了安全证明。
甜叶菊叶片可以用来泡制茶饮，其甜味提取物甜
叶菊糖苷耐热，酸碱条件下的性质稳定，有防腐等性
能，所以可以被应用于食品工业上。其他工业领域中
甜叶菊糖苷也已经广泛被应用，例如医药工业，它可
作为矫口剂，应用在糖浆剂、散剂、片剂等制作上，还可
作为降压剂、新陈代谢促进剂、强壮剂、减肥剂等[4]。日
化工业中，甜叶菊糖苷应用在牙膏、漱口液等产品中
可掩蔽某些配料的不良味感[5]。
甜叶菊中含有 10种甜味成分[6]，因品种及种植环
境的差异，含量有所不同。通常，蛇菊苷、莱鲍迪苷 A、
莱鲍迪苷 C为含量最多的三种糖苷[1]。
关于甜叶菊中糖苷含量的测定国内外有许多报
道。如分光光度法[7]、薄层色谱法[8]、毛细管电泳法[9]、高
效液相色谱法[10-15]等。
与其他方法相比，高效液相色谱法具有分辨率
高、检测范围宽等优点。本文利用超声萃取技术、亲水
色谱原理，建立了一种提取步骤简单且分析性能优
异，能同时测定三种主要糖苷含量的液相色谱方法。
经过方法学考察，杂质干扰低，分离度良好，回收率高，
是准确可信的方法。用该方法对 5种甜叶菊样品进行
测定，得到了准确的样品数据，对甜叶菊在食品和医
药工业中的应用具有一定的借鉴作用。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1200型高效液相色谱仪（配在线脱气机、
四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）；KuDos
SK250H型超声清洗机；北京时代北利离心机；sartorius
CPA225D 型十万分之一天平；METTLER TLOEDO
AB204-S型万分之一天平；BINDER FD115烘箱；IKA
A11 basic粉碎机。
对照品：蛇菊苷（购自和光纯药工业株式会社，纯
度＞99 %）、莱鲍迪苷 A（购自和光纯药工业株式会社，纯
度＞99%）、莱鲍迪苷C（购自 ChromaDex，纯度 = 87 %）。
样品：甜叶菊 1号样品（生产日期：2010-11-28，产自
河北）、甜叶菊 2号样品（生产日期：2010-11-02，产自
安徽）、甜叶菊 3号样品（生产日期：2009-07-15，产自
江苏）、甜叶菊 4号样品（生产日期：2010-10-26，产自
云南）、甜叶菊 5号样品（生产日期：2010-11-22，产自
云南）。无水乙醇：分析纯（上海凌峰化学试剂有限公
司）；乙腈：色谱纯（德国 Merck）；双蒸水（丰益全球研
发中心分析测试实验室自制）。
1.2 对照品溶液配制
取蛇菊苷对照品约 50.0 mg，精密称量，置 25 mL
容量瓶中，用 70 %（g/g）乙醇/水溶液溶解，超声，稀释
至刻度，浓度为 2.0 mg/mL；取莱鲍迪苷 C对照品约
10.0 mg，精密称量，置 25 mL容量瓶中，用 70 %（g/g）
乙醇/水溶液溶解，超声，稀释至刻度，浓度为 0.4 mg/
mL；取莱鲍迪苷 A对照品约 62.5 mg，精密称量，置
25 mL容量瓶中，用 70 %（g/g）乙醇/水溶液溶解，超
声，稀释至刻度，浓度为 2.5 mg/mL。配好的对照品溶液
密封后置于 4℃避光环境中保存。
1.3 样品制备
取甜叶菊叶片置于 50℃避光环境下烘烤 24 h至
恒重，然后用粉碎机打碎，过 80目筛，存放在棕色干燥
器中。精密称取干燥的甜叶菊粉 500 mg，置 50 mL离
心管中，精密加入 20 mL 70 %（g/g）乙醇/水溶液，在超
声仪中超声 30 min。然后取出，6 000 r/min离心 5 min，
吸取上清液。残渣中再次精密加入 20 mL 70 %（g/g）乙
醇/水溶液，超声 30 min。取出，6 000 r/min离心 5 min。
合并两次上清液于 50 mL容量瓶中，用 70 %（g/g）乙
醇/水溶液稀释至刻度，摇匀。吸取 1.5 mL样品溶液，
用 0.45 μm针式微孔滤膜过滤后进样。
1.4 色谱条件
色谱柱：ZORBAX NH2（4.6×250 mm，5 μm），流速：
1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：210 nm，进样量：
10 μL。流动相 A：水，流动相 B：乙腈，梯度洗脱，流动
相梯度见表 1，获得的对照品色谱图见图 1。
2 方法
选取甜叶菊 5号样品为考察对象，下文中所述样
品未标明即为甜叶菊 5号样品。
2.1 线性关系考察
将“1.2”项中蛇菊苷对照品溶液用 70 %（g/g）乙醇/
水溶液稀释成 0.032、0.40、0.80、1.2、1.6、2.0 mg/mL 浓
表 1 梯度洗脱时间表（体积比）
Table 1 The schedule of gradient elution
洗脱时间/min 流动相 A/% 流动相 B/%
0 10 90
30 10 90
50 25 75
55 25 75
60 10 90
史一鸣，等:亲水色谱法测定甜叶菊叶片中糖苷含量检测分析
135
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
mAU
40 42 44 54 min46 48 50 52
Rc
ba
ud
io
sid
e
A
Rc
ba
ud
io
sid
e
C
St
ev
io
sid
e
图 1 对照品色谱图
Fig.1 Chromatogram of stevioside，rebaudioside C and
rebaudioside A
度；将“1.2”项中莱鲍迪苷 A对照品溶液用 70 %（g/g）
乙醇/水溶液稀释成 0.040、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL
浓度；将“1.2”项中莱鲍迪苷 C对照品溶液用 70 %（g/
g）乙醇/水溶液稀释成 0.0032、0.040、0.080、0.12、0.16、
0.20 mg/mL浓度。
吸取 10 μL各浓度标准溶液进样，按“1.4”项所述
液相条件测定，得到相应色谱峰的峰面积。以峰面积
为纵坐标 Y，溶液浓度（mg/mL）为横坐标 X进行线性
回归计算，得到蛇菊苷、莱鲍迪苷 C和莱鲍迪苷 A三
种糖苷的回归方程如表 2所示，结果表明，三者线性
良好。
2.2 精密度试验
吸取样品溶液，重复进样 5次，每次 10 μL，记录
蛇菊苷、莱鲍迪苷 C及莱鲍迪苷 A峰面积。三者的
RSD值分别为 0.36 %，0.87 %，0.51 %，结果表明，方法
精密度良好。
2.3 重复性试验
称取样品 3份，采用上述样品处理方法做平行测
定，所得的蛇菊苷、莱鲍迪苷 C及莱鲍迪苷 A RSD值
如表 5所示，三者都小于 5 %，结果表明，方法重复性
良好。
2.4 加标回收率试验
精密称取样品 9份，按高、中、低 3个浓度加入适
量的 3种对照品溶液，每个浓度 3份。三者 3个浓度的
加标回收率在 91％～104%之间，且 RSD值小于 5%。结
果表明，回收率良好，方法准确。
3 讨论
3.1 提取方法选择
测定甜叶菊糖苷含量常用高效液相色谱法，其具
有分辨率高、定量准确等优点，国内外有诸多相关报
道，差别主要集中在提取方法与分析条件两个方面。
提取方法上，目前主要有超声提取法、索氏抽提
法[10]、水浴震荡提取法[11-13]。索氏抽提法耗时较长，水浴
加热震荡步骤较为繁琐，超声提取法具有高效、快捷、
简单等优点，本文选择了超声萃取来提取甜叶菊中的
糖苷物质。
在提取溶剂的选择上，文献报道的有甲醇[10]、乙醇
水溶液[11]、沸水[12-13]等。本文对甲醇、乙醇、水、丙酮、乙
醇/水溶液提取效率进行单因素试验比较，发现乙醇/
水溶液效率最高。纯水或者乙醇做提取剂效率欠佳，
而甲醇毒性较大。不同浓度的乙醇提取效率也存在明
显差异，通过单因素实验考察，60 %和 70 %质量浓度
对莱鲍迪苷 A提取效率最高。为了进一步确定最优
条件，本文以莱鲍迪苷 A含量为考察指标，对超声提
取法中的液料比、乙醇浓度、提取次数三个主要因素
设计正交试验 L4（23），每组做 3 次平行，结果取平均
值，各因素和水平选取结果如表 3所示。提取时间通
过单因素试验确定，选择 30 min。正交试验结果如表4
所示。
从表 4中可以看出，极差从大到小依次为 B＞A＞
C，影响提取效果因素主次顺序依次为液料比＞乙醇浓
度＞提取次数。提取三次和提取两次效果相当，所以选
择提取二次。得到的最优组合为 A2B1C1，即 70 %（g/g）乙
表 2 三种糖苷回归方程
Table 2 The regression equations of stevioside，rebaudioside C and
rebaudioside A
化合物 回归方程 r
蛇菊苷 Y=2 319.1X+6.1（n=6） r=1.00
莱鲍迪苷 C Y=2 295.6X-4.3（n=6） r= 0.999
莱鲍迪苷 A Y=1 960.5X-7.2（n=6） r=1.00
表 3 超声提取正交试验因素水平表
Table 3 Orthogonal test factors and levels of ultrasonic extraction
水平
因素
A乙醇浓度/（g/g）% B液料比/（mL/g） C提取次数/次
1 60 40:1 2
2 70 50:1 3
表 4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal test
实验序号
因素 结果
A乙醇浓度 B液料比 C提取次数 莱鲍迪苷 A/%
1 1 1 1 4.20
2 2 1 2 4.26
3 1 2 2 3.97
4 2 2 1 4.06
K1 4.08 4.23 4.13
K2 4.16 4.02 4.12
极差 R 0.08 0.21 0.01
史一鸣，等:亲水色谱法测定甜叶菊叶片中糖苷含量 检测分析
136
醇为提取剂，液料比为 40∶1，提取 2次，每次 30 min。按
此最优组合条件测得的莱鲍迪苷 A含量为 4.29 %，高
于表 4中所得实验数据，说明该条件提取效率最优。
3.2 液相分析方法选择
分析条件上，常见的色谱柱选择有 C18柱或者氨
基柱。国标 GB 8270—1999《食品添加剂 甜菊糖甙》
中 [14]介绍了测定甜叶菊糖苷纯度的液相方法，采用氨
基柱，乙腈和水等度洗脱。利用该方法分析甜叶菊叶
片糖苷提取液，如图 2所示，糖苷峰和杂质峰不能够完
全分离，干扰显著。尝试不同的乙腈和水等度洗脱比
例，仍无法同时摆脱杂质对 3种糖苷峰型的干扰，等度
洗脱模式不能满足分析需求。
本文选择氨基柱，其硅胶键合氨丙基固定相能与
羟基形成氢键作用，在乙腈/水为流动相的条件下分析
极性碳水化合物，是一种亲水作用色谱方法。通过对
等度洗脱条件的摸索，改变流动相乙腈和水的比例，
发现杂质存在疏水性。提高流动相中乙腈比例，疏水
性杂质能相对较早的被洗脱，而糖苷化合物因为氢键
作用仍保留在固定相中。然后降低乙腈比例，提高流
动相极性，糖苷化合物便被洗脱出来，从而降低了杂
质的干扰。
在 90 %乙腈等度洗脱条件下，3种糖苷化合物在
40 min内没有出峰，同时，疏水性杂质已经基本洗脱出
色谱柱，然后，调整乙腈浓度到 75 %，3种糖苷化合物
即刻快速的洗脱出色谱柱，如图 2所示，分离度良好，
达到了理想的分离要求。从 3种糖苷化合物结构分析，
莱鲍迪苷 A分子中羟基最多，与固定相氢键作用最
强，所以保留能力最强，因此，在该色谱条件下 3种化
合物的出峰顺序依次为蛇菊苷、莱鲍迪苷 C及莱鲍迪
苷 A。
3.3 甜叶菊样品测试结果
对 5种甜叶菊叶片进行糖苷含量测定。按“2”项中
所述方法对不同品种叶片进行处理，每个品种取 3份。
按上述色谱条件分析，测定峰面积，代入回归方程，计
算出含量，结果如表 5所示。
4 总结
在医药工业上，蛇菊苷在对分离的胰岛和 β细胞
具有直接的促胰岛素分泌效应，能明显降低血糖水
平，抑制高血糖素分泌[15]，服用甜叶菊糖苷能够明显降
低午餐后血糖的提高幅度 [16]，因此富含蛇菊苷的甜叶
菊具有很好的药用开发价值。通过测定糖苷组分含
量，1号、3号、5号样品比较适合药物开发。与其他糖
苷成分相比，莱鲍迪苷 A的口感更接近蔗糖，并且甜
度是蔗糖的 450倍[1]，所以可以在食品工业中作为蔗糖
的替代品。从实验数据看出，2号、4号样品富含莱鲍迪
苷 A，更合适作为食品添加剂来使用。
本文采用超声萃取法高效、快捷地提取出甜叶菊
叶片中糖苷成分，利用亲水色谱原理排除杂质干扰，
并很好的分离了 3种主要的甜叶菊糖苷成分，是一种
性能和适用性都较好的分析方法，本方法的建立对甜
叶菊品质鉴定具有重要意义。
图 2 甜叶菊 5号样品色谱图
Fig.2 Chromatogram of Zhaifuyi stevia rebaudiana Bertoni
Ⅰ.国标 GB 8270—1999方法
Ⅱ.本文方法
175
150
125
100
75
50
25
0
mAU
0 2.5 5 12.5 min7.5 10
Rc
ba
ud
io
sid
e
A
Rc
ba
ud
io
sid
e
C
St
ev
io
sid
e
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
40 42 44 5446 48 50 52
Rc
ba
ud
io
sid
e
A
Rc
ba
ud
io
sid
e
C
St
ev
io
sid
e
表 5 甜叶菊叶片中三种主要糖苷检测结果
Table 5 The content of stevioside，rebaudioside C and
rebaudioside A in different brands of Stevia Rebaudiana Bertoni
样品
蛇菊/% 莱鲍迪苷 C/% 莱鲍迪苷 A/%
含量 均值 RSD/% 含量 均值 RSD/% 含量 均值 RSD/%
1号
8.66
8.91 2.75
0.86
0.90 3.89
3.18
3.22 1.608.91 0.92 3.20
9.15 0.93 3.28
2号
1.35
1.34 1.81
1.12
1.15 4.27
11.85
11.78 0.941.31 1.12 11.65
1.34 1.20 11.82
3号
7.22
7.03 2.41
1.08
1.04 2.81
2.87
2.86 0.766.92 1.03 2.87
6.95 1.03 2.83
4号
1.38
1.38 0.45
1.12
1.13 3.31
10.40
10.56 2.071.39 1.10 10.48
1.38 1.18 10.81
5号
6.30
6.28 0.89
0.85
0.84 0.45
4.25
4.29 1.976.22 0.84 4.24
6.33 0.84 4.39
mAU
min
史一鸣，等:亲水色谱法测定甜叶菊叶片中糖苷含量检测分析
137
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收稿日期：2012-03-18
云南松露挥发性风味物质GC-MS分析
李维莉，马银海，彭永芳
（昆明学院化学科学与技术系，云南昆明 650214）
摘 要：采用同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱联用法（SDE-GC-MS）测定云南松露（Tuber melanosporum）中的挥发性成
分，分离并鉴定出 21个组分，占峰面积的 74.63 %，并用峰面积归一化法测定了各成分的质量分数。主要香气化合物
有：晚香玉内酯（1.79 %）、亚油酸乙酯（2.05 %）、1-（1-亚甲基-2-丙烯基）环己醇（4.37 %）、2-苯乙醇（6.86 %）、棕榈酸
（16.48 %）、亚油酸（33.76 %）。
关键词：云南松露；挥发性；GC-MS
Study on Constituents of Volatile Oils of Tuber melanosporum
LI Wei-li，MA Yin-hai，PENG Yong-fang
（Department of chemistry science and technology in Kunming University， Kunming 650214， Yunnan， China ）
Abstract：The volatile oils of Tuber melanosporum were extracted with simultaneous steam distillation extract
（SDE）as well as analyzed and identified by GC-MS. Twenty -one constituents had been identified from the
volatile oils. The relative contents of absorbed volatiles were 74.63 % of the total area of the peaks. The relative
contents of the constituents were determined by area normalization method. The key constituents were Dihydro-
作者简介：李维莉（1974—），女（汉），副教授，硕士，主要从事天然产物研究开发的教学科研工作。
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检测分析
食品研究与开发
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2012年 12月
第 33卷第 12期
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