全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 3期，第 422-428页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.3, 422-428
研究报告
Research Report
甜叶菊葡糖基转移酶基因 UGT76G2的克隆及生物信息学分析
郭书巧 杨郁文 倪万潮 *
1江苏省农业科学院农业生物技术研究所,南京, 210014; 2农业部华东作物遗传改良与育种重点开放实验室,南京, 210014; 3江苏省农业生物
学重点实验室,南京, 210014
*通讯作者, niwc@yahoo.cn
摘 要 本研究利用 RT-PCR方法从甜叶菊(Stevia rebaudian)叶片中分离了与甜叶菊 UGT76G1高度同源的
UGT76G2基因，该基因编码一条分子量为 52.029 kD的由 458个氨基酸残基组成的多肽，含有 C-端所特有
的高度保守的信号序列 PSPG基序和 N-端膜结合序列，属于植物中特有PSPG基序的 UGT家族成员。半定
量 RT-PCR分析表明：UGT76G2在甜叶菊根、茎、叶、花不同组织中具有组织表达特异性，在叶组织中的表达
丰度略高，在根中不表达而在茎中表达较低。推断的 UGT76G2编码产物与其它参与植物次级代谢产物的糖
基转移相关酶同源比对和系统发生分析表明该蛋白与康乃馨(Dianthus caryophyllus) DicGT4、棉花(Gossypi－
um hirsutum) GhUGT1、甜叶菊(Stevia rebaudian) UGT76H1 及玉米(Zea mays) BX8 的一致性较高，分别为
41%、35%、35%和 32%。对 UGT76G2和 UGT76G1的次级结构和立体结构分析发现，苜蓿(Medicago sativa)
UGT71G1与二者的一致性皆为 23%，它们有类似的次级结构。在 C-端的PSPG信号区内具有 10个相同的
基质结合位点。但在 UGT76G2和 UGT76G1之间也有个别位置氨基酸存在差异。它们的 N-端含有保守的
组氨酸 H25和天冬氨酸 D124残基，可能与受体的结合有关。
关键词 甜叶菊,葡糖基转移酶,基因克隆,生物合成
Cloning and Bioinformatic Analysis of Glucosyltransferase Gene UGT76G2
from Stevia rebaudian
Guo Shuqiao Yang Yuwen Ni Wanchao *
1 Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, 210014; 2 Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Breed-
ing in East China, Ministry of Agriculture, Nanjing, 210014; 3 Key Laboratory of Jiangsu Province for Agrobiology, Nanjing, 210014
* Corresponding author, niwc@yahoo.cn
DOI: 10.3969/gab.028.000422
Abstract A glucosyltransferase gene UGT76G2, homologous with UGT76G1, was isolated from Stevia rebaudian
by RT-PCR, which encodes a 52.029 kD protein with 458 amino acids, containing typical plant glucosyltransferases
characteristic including PSPG signal motif and N-terminal membrane anchor. The semi-quantitative RT-PCR assay
showed UGT76G2 expressed in high abundance in leaves and flower tissues, not in roots. Sequence alignment of the
UGT76G2 with other known glucosyltransferases involved in plant secondary metabolites sequences revealed that
UGT76G2 shared 41% , 35% , 35% and 32% identity with DicGT4 from Dianthus caryophyllus, GhUGT1 from
Gossypium hirsutum, UGT76H1 from Stevia rebaudian and BX8 from Zea mays. Secondary structures illuminated
that UGT76G2 and UGT76G1 shared 23% identity with UGT71G1 from Medicago sativa, and they have similar sec-
ondary structure and three-dimensional structure. There are 10 matrix binding sites within PSPG signal motif, and
few amino acids are different in PSPG signal motif between UGT76G2 and UGT76G1. The N-terminal contains
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000422
基金项目：本研究由江苏省博士后科研资助计划(0701021B)、江苏省农业科学院博士后科研资助计划(005036510701)和国家转基
因专项(2008ZX2008005-001)共同资助
甜叶菊(Stevia rebaudian)是富含甜菊苷类物质的
多年生菊科草本植物，其叶片中含有一类天然甜味
剂——甜菊醇糖苷(steviol glycosides, SGs)。到目前为
止已从甜叶菊中分离到至少八种不同甜度的甜菊苷。
其中甜菊糖苷(stevioside)是主要成分，占 60%~70%，
甜度为蔗糖的 143倍；其次是甜菊糖苷 A (rebaudio-
side A)，占 15%~20%，甜度为蔗糖的 242倍(Brandle
and Telmer, 2007; 倪万潮和郭书巧, 2008; Kovylyae-
va et al., 2007)。甜菊糖苷 A的甜味比甜菊糖苷更为
甘醇，涩味少(Brandle and Telmer, 2007)。SGs含有 32
种营养成分(Geuns, 2003)。长期实践证明，SGs对人
体有益无害，因而成为食品工业的重要甜味添加剂
(Hsieh et al., 2003; Gregersen et al., 2004)。
SGs的生物合成途径与植物体内赤霉素 GAs的
合成途径在底物链上部分共享(石琰璟等, 2006)。GAs
的生物合成途径在植物中普遍存在，是植物生命过程
的重要的代谢和调控机制。在甜叶菊中，甜菊醇在不
同的葡糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases, UGTs)
作用下，在 C19和 C13位上分别连接不同数量的葡糖
基以及鼠李糖基形成不同甜度和甜味的甜菊糖苷
(stevoiside)和甜菊苷 A (rebaudioside A)等，尤其是
UGT76G1能催化甜菊糖苷的 C13位的 C3添加一个
葡萄糖分子，形成甜菊苷 A (Brandle and Telmer, 2007;
Humphrey et al., 2006)。因此对 UGTs生物功能的研究
尤为重要。本研究从甜叶菊中成功地分离与UGT76G1
高度同源的UGT76G2基因，然后使 UGT76G2基因在
大肠杆菌中表达，该基因的克隆和表达有利于进一
步了解 SGs的合成过程以及 UGTs的功能。
1材料和方法
1.1 植物材料
甜叶菊品种“首田 2号”种植于江苏省农业科学
院农业生物技术所试验田中，用于提取 RNA的根、
茎、叶和花取自收获前一个月的植株。
1.2总 RNA的提取和 cDNA第一链的合成
总 RNA的抽提采用 Biozol试剂盒(杭州博日)，
操作过程按照说明书进行；cDNA第一链的合成，取
2 μg的总 RNA (经 DNaseⅠ处理)做模板，oligod(T)18
为反转录引物，利用M-MLV RTase按照说明书(Pro-
mega)进行反转录。产物作为 RT-PCR的模板。
1.3 UGT76G2基因的克隆
根据 NCBI公布的 UGT76G1基因序列(Richman
et al., 2005) (GenBank登录号: AAR06912)设计一对
特异性引物分别为 P1：5-AAACGTCAGTCAAACC
AAT-3 和 P2：5-CTCACATAACCAACAACCAT-3
(Invitrogen合成)，通过如下 PCR扩增程序可从甜叶
菊的 cDNA和 gDNA中分离目标基因：94℃预变性
5 min；94℃变性 40 s，56℃复性 40 s，72℃延伸 90 s，
共 35个循环；最后 72℃延伸 10 min。目的条带经胶
回收纯化后 (上海华舜) 连接到 pGEM-T-Easy载体
(Promega)中，转化大肠杆菌 JM109，由 Invitrogen公
司完成测序。
1.4 UGT76G2基因的组织表达分析
用于 UGT76G2组织表达的引物为 P3：5-TGA
AGAAGATGAAGAGGTATCG-3和 P4：5-CTATC
AACCAACCCACGAG-3；PCR反应程序同 UGT76G2
的克隆，循环数减少为 30。以甜叶菊中组成性表达的
Actin 基因(GenBank 登录号: AF548026)为内参，设
计PCR引物：5-GCACCAAGGGCGGTATTTC-3和
5-CAGAACCTCAGGGCAACG-3用于扩增甜叶菊的
Actin基因，PCR扩增程序如下：94℃预变性 5 min；94℃
变性 40 s，55℃复性 40 s，72℃延伸 1 min，共 27个循
环；最后 72℃延伸 10 min。
1.5原核表达载体的构建和表达
采用 BioXM 6.0软件，设计特异引物：P1：5-AA
TGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACC-3 (含
BamHⅠ酶切位点)和 P2：5-CTAGTCGACCTCACA
TAACCAACAACCAT-3 (含 SalⅠ酶切位点)，扩增
UGT76G2的开放阅读框(ORF)，PCR产物经 BamHⅠ和
SalⅠ双酶切后，与经同样酶切的pGEX-4T-1(phar-
macia)载体连接，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，构
建重组表达载体 pGEX-4T-UGT76G2，经 1 mmol/L
异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导 4 h后，表达
产物进行 SDS-PAGE (15%)，考马斯亮蓝染色后，分
析目的蛋白的表达情况，以不含目的基因的
pGEX-4T-1载体为对照。
1.6生物信息学分析
目的基因 cDNA 序列分析采用 BioXM 6.0 软
件；氨基酸的分子量和等电点预测采用 http://us.ex-
highly conservative His25 and Asp124, may be associated with the combination of the relevant receptor.
Keywords Stevia rebaudian, Glucosyltransferases, Gene cloning, Biosynthesis
甜叶菊葡糖基转移酶基因 UGT76G2的克隆及生物信息学分析
Cloning and Bioinformatic Analysis of Glucosyltransferase Gene UGT76G2 from Stevia rebaudian 423
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
pasy.org/cgi-bin/pi_tool程序完成；氨基酸一级结构的
功能域预测分析由 ScanProsite程序完成(http://www.
expasy.ch/prosite)；跨膜区预测采用 TMPRED程序
(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.
html)完成。氨基酸的多序列比对和系统发生树的分
析采用 ClustalX软件(版本 1.81)和Mega (版本 3.1)程
序实现。
蛋白质的次级结构信息来源于 Brookhaven pro-
tein data bank (RCSB) (http://www.rcsb.org)，有 5 个
植物葡糖基转移酶 UDP的次级结构 2ACV、2ACW、
2VCE、2VCH和 2VG8，选择与 UGT76G2一致性较
高的来源于苜蓿的与萜类生物合成有关的 2ACV和
2ACW (Shao et al., 2005)与甜叶菊的 UGT76G1 和
UGT76G2，用 ClustalX软件进行同源比对，并选择
2ACV作为次级结构模式，利用 ESPript2.2 (http://es-
pript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi) 进行次级结
构的预测。蛋白质的立体结构预测和观看采用
SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/SWIS-
S-MODEL.html)和Raswin (http://www.bbioo.com/Soft/
2007/710.htm)软件。
2结果与分析
2.1 UGT76G2基因 cDNA的克隆和序列分析
利用 P1和 P2引物，利用 RT-PCR的方法从甜
叶菊叶片 cDNA中克隆了一个与 1 377 bp的目的基
因，并在 GenBank登录(FJ607329)。
利用BioXM软件分析发现 UGT76G2基因 cDNA
的 ORF全长 1 377 bp，编码 458个氨基酸残基；利用
http://us.expasy.org/cgi-bin/pi_tool程序预测，分子量
为 52.029 kD，等电点 5.36。推断的氨基酸含有 C-端
特有的高度保守的信号序列 PSPG (putative secondary
plant glycosyltransferase, IILFPVPVQGHINPILQLAN
VLYSKGF)基序(Paquette et al., 2003) N-端膜结合序
列(IILFPVPVQGHINPILQLANVLYSKGF)。
利用 ClustalX软件对其它 UDP-葡糖基转移酶
进行氨基酸序列比对，发现 UGT76G2与 UGT76G1
(Richman et al., 2005)的一致性为 92%；它与康乃馨
(Dianthus caryophyllus) DicGT4 (Ogata et al., 2004)的
一致性为 41%，与棉花(Gossypium hirsutum) GhUGT1
(Tai et al., 2008)和甜叶菊的 UGT76H1 (Richman et
al., 2005)都是 35%，与玉米(Zea mays) BX8 (von Rad
et al., 2001)的一致性为 32%，与甜杏仁(Prunus dulcis)
UGT85A19 (Franks et al., 2008)、苜蓿(Medicago trun－
catula)Ugt85h2 (Li et al., 2007)、烟草(Nicotiana tabacum)
togt1 (Fraissinet-Tachet et al., 1998)、RUGT-5 (Ko et
al., 2006)、水稻 (Oryza sativa)、玉米 cisZOG1 和棉豆
(Phaseolus lunatus) PlZOG1 (Martin et al., 2001; Veach
et al., 2003; Mok et al., 2005) 的一致性依次为 27%、
27%、25%、21%、20%和 20%。系统发生树的分析也
表明 UGT76G2与 DicGT4、棉花 GhUGT1、甜叶菊的
UGT76H1及玉米 BX8等与次级代谢产物的糖基转
移相关酶的亲缘关系较近(图 1)。
2.2 UGT76G2的次级结构和立体结构分析
以 RCSB中苜蓿(Medicago sativa)的 UDP-葡糖
基转移酶 UGT71G1的 2ACV (Shao et al., 2005)为次
级结构模板，利用 ESPript 对 UGT71G1 和甜叶菊
UGT76G1、UGT76G2 进行同源比对和次级结构比
较，发现 UGT71G1与二者的一致性皆为 23%，它们
有着类似的次级结构(图 2)，UGT76G2的 C-端含有
与 UGT71G1高度保守的 UGT信号基序 PSPG (氨基
酸残基W338到 Q381相当于 UGT71G1的W339到
Q382)，在“PSPG”box 区内，UGT76G1 和 UGT76G2
图 1甜叶菊 UGT76G2与其它已报道的部分葡基糖转移酶系
统发生树分析
注 : BX8 (玉米 , AAL57037); cisZOG1 (玉米 , AAK53551);
DicGT4 (康乃馨, BAD52007); GhUGT1 (棉花, ABN 58740);
PlZOG1 (棉豆, AAD04166); RUGT-5 (水稻, XM 463383); togt1
(烟草, AAK28303); UGT76H1 (甜叶菊, AAR06925); UGT76G1
(甜叶菊, AAR06912); Ugt85H2 (苜蓿, 2PQ6_A)
Figure 1 Phylogenetic tree analysis UGT76G2 form Stevia re－
baudian with other reported UGT proteins
Note: BX8 (Zea mays, AAL57037); cisZOG1 (Zea mays, AAK5-
3551); DicGT4 (Dianthus caryophyllus, BAD52007); GhUGT1
(Gossypium hirsutum, ABN 58740); PlZOG1 (Phaseolus lunatus,
AAD04166); RUGT-5 (Oryza sativa, XM 463383); togt1 (Nico－
tiana tabacum, AAK28303); UGT76H1 (Stevia rebaudian, AAR-
06925); UGT76G1 (Stevia rebaudian, AAR06912); Ugt85H2
(Medicago truncatula, 2PQ6_A)
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.028.000422424
图 2甜叶菊 UGT76G1、UGT76G2及苜蓿 UGT71G1 (2ACV和 2ACW)的次级结构比较
Figure 2 The secondary structure elements observed of S. rebaudian UGT76G1, UGT76G2 and M. truncatula 2ACV and 2ACW
甜叶菊葡糖基转移酶基因 UGT76G2的克隆及生物信息学分析
Cloning and Bioinformatic Analysis of Glucosyltransferase Gene UGT76G2 from Stevia rebaudian 425
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
具有 10个与 UGT71G1完全相同的供体 UDP或者
UDP葡基糖结合的位点，同时也具有 3个不同氨基
酸，在 UGT76G1中 L379、G378和 D376三个氨基酸
在 UGT76G2中分别为 F379、A378和 A376 (图 2)。在
UGT76G2和 UGT71G1的 N-端含有两个植物中高
度保守的组氨酸H25和天冬氨酸D124 (UGT76G1,相
当于 UGT71G1的 H22和 D121)。
利用 SWISS-MODEL对 UGT76G2的立体结构
进行在线预测，发现 UGT76G2由相对独立的 N-端
和 C-端两部分组成，这两部分紧密相连，并形成一
个大沟(图 3)。保守的 UGT信号基序 PSPG正好位于
N-端和C-端两部分所形成的大沟处，推测该结构
可能与底物的靠近和结合有关；在 UGT76G2 和
UGT71G1 的 N- 端的组氨酸H25 和天冬氨酸
D124，在立体结构中紧密相邻(图 3)。UGT71G1中对
应的 H22作为一个接触反应的底物与 UDP葡糖基
转移酶紧密结合，而 D121则可能与接触反应底物
H22形成电子传递链，协助受体分子去质子化(Pa-
quette et al., 2003)。Shao等(2005)将 UGT71G1中的
H22和 D121分别突变后都没有检测到该酶的活性，
这些暗示 D121在协助 H22与受体的结合及电子传
递中发挥着主要作用。推测 UGT76G2中这两个氨基
酸具有与 UGT71G1中类似的功能。
2.3 UGT76G2基因的组织表达分析
半定量 RT-PCR分析表明该基因在甜叶菊根、
茎、叶、花不同组织中具有组织表达特异性(图 4)，在
叶组织中的表达丰度略高，在根中不表达而在茎中
表达较低。
2.4 UGT76G2编码产物的原核表达分析
如图 5所示，将重组质粒 pGEX-4T-UGT76G2和
pGEX-4T-1分别转入大肠杆菌 E. coli BL21(DE3)
后，经 IPTG诱导后表达，与未诱导的菌体相比，
pGEX-4T-1/BL21的细菌裂解产物 SDS-PAGE电泳
图 3 UGT76G2的立体结构图(Paquette et al., 2003)
注 : 绿色表示 C- 端, 黄色表示 N- 端 植物UGT 所特有的
PSPG保守区用网带模式表示, UGT信号基序 PSPG用网带
模式表示;保守的氨基酸 His25和 Asp124用球状模式和 CPK
颜色表示 ; UGT76G2 蛋白质的立体结构预测和观看采用
SWISS-MODEL和 raswin软件
Figure 3 Cartoon diagram of the structure of UGT76G2 (Paquette
et al., 2003)
Note: The N- and C- terminal domains are shown in yellow and
green; The Putative Secondary Plant Glycosyltransferase motif is
shown as strands model; His25 and Asp124 are shown as spacefill
model collored byCPK; Three-dimensional structure ofUGT76G2
was preparedwith SWISS-MODELand raswin software
图 5 pGEX-4T-UGT76G2和 pGEX-4T-1在大肠杆菌中表达
蛋白的 SDS-PAGE分析
注:M:蛋白质分子量标准;1:含 pGEX-4T-UGT76G2的菌体诱导
4 h; 2:含 pGEX-4T-1的菌体诱导 4 h;3:含 pGEX-4T-UGT76G2
的菌体未诱导; 4:含 pGEX-4T-1的菌体未诱导
Figure 5 SDS-PAGE analysis of products expressed pGEX-4T-
UGT76G2 and pGEX-4T-1 vector in E. coli.
Note: M: Protein molecular weight marker; 1: The expression of
pGEX-4T-UGT UGT76G2 induced by IPTG for 4 h; 2: The ex-
pression of pGEX-4T-1 induced by IPTG for 4 h; 3: Uninduced
pGEX-4T-UGT76G2/BL21; 4: Uninduced pGEX-4T-1/BL21
图 4 UGT76G2在甜叶菊的表达
注: R:根; S:茎; L:叶; F:花
Figure 4 Expression profiles of UGT76G2 in Stevia rebaudian
Note: R: Root; S: Stem; L: Leaf; F: Flower
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.028.000422426
分析，发现在大约 26 kD处有明显的蛋白带(图 5,泳
道 2)；携带重组质粒 pGEX-4T-UGT76G2的菌体诱
导 4 h后在大约 78 kD处有一明显的蛋白条带(图 5,
泳道 1)，而未诱导的菌体没有这一条带(图 5,泳道 3)。
经预测 UGT76G2分子量为 52.029 kD，GST 表达标
签为 26 kD，诱导后 pGEX-4T-UGT76G2/BL21菌体
裂解产物电泳后显示一条大小约为 78 kD的蛋白带。
表明 UGT76G2基因在大肠杆菌中得到了成功表达。
3讨论
糖基转移酶(glycosyltransferases, GTs)在生物体
中广泛存在，能从有活性的供体转移一个糖基到受
体分子。植物 GTs能够识别异源物质，在杀虫剂和
除草剂代谢过程中发挥着主要作用，同时能够将生
物活性分子储存于植物液泡中。前人的研究表明，
糖基转移酶能特异地糖基化植物信号分子 IAA、SA
和玉米素等，同时它在多种次生代谢物的修饰过程
中发挥着主要作用(von Rad et al., 2001)。这种酶活
性的调节在维持细胞内激素水平的平衡和细胞内
代谢物的定位中起着主要作用。糖基转移酶家族 1
葡糖基转移酶是 GT酶中的一个亚家族，其羧基端
存在保守序列，大约 50个氨基酸残基组成植物所特
有的“PSPG”box，作为 UGTs的特征信号序列，可能
是蔗糖的结合位点。除此之外，UGTs的氨基端变化
较大，这可能与受体的特异性有关。
UGT71G1是最近从植物中分离出来的一种功能
酶，已经对该酶进行了初步的研究，主要参与皂草苷的
生物合成(Shao et al., 2005)。本研究利用 UGT71G1
基因(Brandle and Telmer, 2007)的核苷酸序列设计
特异性引物，利用 RT-PCR的方法从甜叶菊中没有
扩增到与其完全相同的序列，而是获得了一个与
UGT76G1高度同源的基因 UGT76G2，二者与氨基酸
一致性为 92%。这种差异可能是由于甜叶菊品种的
不同引起的。在植物特有的“PSPG”信号区内，
UGT76G1和 UGT76G2具有 10个相同的结合位点，
同时也具有 3个不同氨基酸，在 UGT76G1中 L379、
G378 和 D376 3 个氨基酸在 UGT76G2 中分别为
F379、A378和 A376 (图 3)。这些数据暗示它们具有
相似的结合底物，但是对不同的底物或者底物的结
合能力方面存在着差异。该基因的克隆有利于进一
步深入研究 UGT76G1/UGT76G2在甜菊醇糖苷的生
物合成过程中的功能。
本实验室还成功地从甜叶菊中分离了另一个甜
菊醇糖苷合成途径中关键酶基因 KAH (GenBack登录
号: AAX07436)，它是从赤霉素合成途径到甜菊醇糖
苷合成途径中的第一个关键酶基因(倪万潮和郭书巧,
2008; Brandle and Telmer, 2007)，如果能使 KAH 和
UGT76G2基因在其它作物中分别表达或者共表达，
再对转基因植株中赤霉素含量、甜菊糖苷及甜菊糖
苷 A的含量进行测定，探索利用相关酶提高甜叶菊
叶片中甜度高、口感好的甜菊糖苷 A的含量，以及培
育新型甜味作物的可行性。这些研究有利于开拓我
国甜味剂新来源，并为大众提供健康甜味食品。
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