全 文 ：收稿日期:2009-05-06;　修订日期:2009-09-10
基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(No.30701087)
作者简介:钟世红(1980-),女(汉族),四川隆昌人 ,现任成都医学院讲师 ,
博士学位 ,主要从事中药材品种 、质量及资源研究工作.
＊通讯作者简介:古　锐(1979-), 男(汉族),四川简阳人 , 现任成都中医
药大学助理研究员 ,硕士学位 ,主要从事民族药可持续开发与利用研究工
作.
红毛五加叶中常春藤皂苷元的高效液相色谱法测定
钟世红1, 2 ,卫莹芳 2 ,古　锐2＊ ,吴　宇 1 ,段　雄2
(1.成都医学院 ·药学院 ,四川 成都　610083;　2.成都中医药大学 ,四川 成都　611131)
摘要:目的 建立红毛五加叶中常春藤皂苷元的测定方法。方法 采用高效液相色谱法。色谱柱为 WelchromC18色谱柱
(4.6 mm×250 mm, 5μm);流动相为甲醇 -水 -冰醋酸 -三乙胺(85∶15∶0.04∶0.02);流速:1.0 ml· min-1;柱温:35
℃;检测波长为 210 nm。结果 常春藤皂苷元的线性范围为 0.68 ～ 10.94 μg, 平均加样回收率为 100.42%, RSD小于
2%。结论 该方法准确 、专属性强 ,可为红毛五加叶的综合开发利用提供参考。
关键词:红毛五加叶;　常春藤皂苷元;　高效液相色谱
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)01-0006-02
HPLCDeterminationofHederagenininLeavesofAcanthopanaxgiraldiHarms
ZHONGShi-hong1, 2 ,WEIYing-fang2 ,GURui2＊ , WUYu1 ,DUANXiong2
(1.PharmaceuticalSchool, ChengduMedicalColege, Chengdu610083, China;2.ChengduUniversityof
TCM, Chengdu611131, China)
Abstract:ObjectiveTodevelopadeterminationmethodforthehederagenininleavesofAcanthopanaxGiraldiiHarms.Meth-
odsHederageninwasdeterminedbyHPLCmethod.TheseparationwasperformedonawelchromC18 column(4.6mm×250mm,
5 μm)withmobilephaseofmethanol-water-glacialaceticacid-triethylamine(85:15:0.04:0.02).Theflowratewas1.0mL
· min-1.Thecolumntemperaturewasat35℃.Thedetectionwavelengthwas210nm.ResultsThelinearrangeofhederagenin
was0.68 ～ 10.94μg.Theaveragerecoverywas100.42%, andtheRSDwaslessthan2%.ConclusionThemethodisaccurate
andspecificwhichisusefulfortheintegrativeexploitationoftheleavesofA.GiraldiHarms.
Keywords:LeavesofAcanthopanaxgiraldiHarms;Hederagenin;HPLC
　　红毛五加 AcanthopanaxgiraldiHarms收载于四川省中药材
标准 , 传统以茎皮入药 ,为四川地区五加皮的习用品种和羌族特
色药材 , 具祛风湿 、强筋骨之功效 ,主治风寒湿痹 、足膝无力等证。
红毛五加叶目前已受到关注 ,四川省阿坝州地区将其开发为保健
茶推向市场 , 具有进一步开发成新药材的前景。关于红毛五加叶
的研究甚少 [ 1, 2] , 结合文献及预实验 , 红毛五加叶中存在以常春
藤皂苷为代表的多种三萜皂苷。 本文对红毛五加叶中的常春藤
皂苷元进行了定性 、定量分析 , 以期为其进一步的开发及资源的
可持续利用提供科学依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器 高效液相色谱仪(DionexP680 美国戴安), 旋转蒸发
器(buchi瑞士), 超纯水器 (Milipore美国), 超声清洗器
(AS5150A天津 , 功率:180W, 频率:40KHz), 电子天平(Sartorius
BS224S北京)。
1.2　试药与试剂 常春藤皂苷元(中国药品生物制品检定所 ,供
含量测定用 , 批号 111733-200501),齐墩果酸(中国药品生物制
品检定所 , 批号 110709-200505), 甲醇(色谱纯 , Fisher), 水为超
纯水及重蒸水 , 其余试剂均为分析纯。
1.3　样品 采自阿坝州 , 经成都中医药大学卫莹芳教授鉴定为红
毛五加 AcaothopanaxgiraldiHarms的干燥叶。
2　方法与结果
2.1　红毛五加叶的薄层鉴别 文献报道 , 红毛五加中含有常春藤
皂苷及齐墩果酸皂苷 [ 2] , 因此 ,本研究对常春藤皂苷元和齐墩果
酸进行了定性鉴别。
取常春藤皂苷元对照品 、齐墩果酸对照品 , 加甲醇制成每毫
升各含 0.4 mg的混合溶液 ,作为对照品溶液。取本品粉末(过 4
号筛)约 2g,精密称定 , 加甲醇 50 ml, 超声处理 30 min, 滤过 , 残
渣用甲醇适量洗涤 , 合并滤液与洗液 , 回收溶剂至干 , 残渣加水
10 ml溶解 , 用水饱和正丁醇振摇提取 3次 , 20 ml/次 , 合并提取
液 , 蒸干 ,残渣加甲醇 20ml, 盐酸 1 ml,加热水解 4 h, 水解物加水
10 ml, 用三氯甲烷振摇提取 2次 , 20 ml/次 , 合并提取液 , 回收溶
剂至干 , 残渣加甲醇 2 ml溶解 ,即得供试品溶液。 吸取供试品溶
液 、对照品溶液各 2 ～ 5 μl,点于同一硅胶 G薄层板上 , 以环己烷
-醋酸乙酯 -冰醋酸(6∶4∶0.25)为展开剂 , 展开 , 取出 , 晾干 ,
喷以 10%硫酸乙醇溶液 ,在 105℃加热至斑点显色清晰 , 置日光
下检视 。供试品色谱中 ,在与常春藤皂苷元对照品色谱相应的位
置上 , 显相同颜色的深蓝色斑点;在与齐墩果酸对照品色谱相应
的位置上 ,显相同颜色的蓝紫色斑点。见图 1。
1.2.5.6.红毛五加叶样品
3.常春藤皂苷元　4.齐墩果酸
图 1　红毛五加叶的薄层色谱图
2.2　红毛五加叶中常春藤皂苷元含量测定
2.2.1　色谱条件 色谱柱为 Welchrom-C18柱(4.6 mm×250mm, 5 μm)。流动相为甲醇 -水 -冰醋酸 -三乙胺(85∶15∶0.
04∶0.02)。 检测波长 210 nm, 柱温 35℃, 体积流量 1.0 ml·
min-1 ,进样量 10 μl。色谱柱理论塔板数以常春藤皂苷元峰计
·6·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.1
算 , 不得低于 2 000。
2.2.2　对照品溶液的制备 精密称取减压真空干燥至恒重的常
春藤皂苷元对照品 34.2 mg, 置于 100 ml容量瓶中 , 加甲醇溶解
并稀释至刻度 , 制成 0.342 mg/ml的对照品溶液。
2.2.3　供试品溶液的制备 取本品粉末(过 4号筛)约 2g,精密
称定 , 加甲醇 50 ml, 回流提取 30 min, 滤过 , 残渣用甲醇适量洗
涤 , 合并滤液和洗液 , 回收溶剂至干 , 残渣加水 10 ml溶解 , 用水
饱和正丁醇振摇提取 3次 , 20 ml/次 , 合并提取液 , 蒸干 , 残渣加
甲醇 20ml, 盐酸 1 ml,加热水解 4h,水解物加水 10 ml,用三氯甲
烷振摇提取 2次 , 20 ml/次 , 合并提取液 , 回收溶剂至干 , 残渣加
甲醇溶解并转移至 25 ml量瓶中 , 加甲醇至刻度 , 摇匀 , 滤过 , 取
续滤液 , 即得。
2.2.4　标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液 2, 4, 8, 16, 32 μl
进样分析 , 测定常春藤皂苷元的峰面积 , 以进样量(μg)为横坐
标 , 峰面积积分值为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,得常春藤皂苷元的回
归方程为Y=7.228 4X-0.023 2(r=1.000 0), 其进样量在 0.68
～ 10.94μg范围内呈良好的线性关系。
2.2.5　精密度实验 精密吸对照品溶液 10 μl进样 , 连续进样 5
次 , 记录峰面积 ,计算峰面积的 RSD值为 1.07%, 表明仪器精密
度较好。
2.2.6　重复性实验 取本品粉末(过 4号筛), 按 “ 2.2.3”项下制
备供试品溶液 6份 , 进样分析 , 测得样品中常春藤皂苷元平均含
量为 10.17 mg· g-1 , RSD为 1.14%, 表明方法重复性良好。
2.2.7　稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液 10 μl,分别于 0,
2, 4, 8, 12, 24 h进样分析 , 测得峰面积的 RSD值为 0.97%, 表明
供试品溶液在 24h内稳定。
2.2.8　加样回收率实验 取已测定含量的样品粉末约 0.5 g,精
密称定 6份 , 分别精密加入对照品溶液 14.9 ml和甲醇 10.1 ml,
制备方法参照 “ 2.2.3”项下 , 试剂均减半 ,残渣加甲醇溶液溶解 ,
转移至 25ml容量瓶中 ,定容 ,即得。进样分析 , 计算得常春藤皂
苷元的平均回收率为 100.42%, RSD值为 1.71%。
2.2.9　样品测定 按上述方法对不同来源样品进行测定 , 外标法
计算常春藤皂苷元的含量。色谱图见图 2, 样品测定结果见表 1。
图 2　常春藤皂苷元(A)和红毛五加叶(B)的 HPLC色谱图
3　讨论
经预试验 , 红毛五加叶水解后常春藤皂苷元含量较高 , 而齐
墩果酸含量较低且色谱峰存在干扰。因此本试验对红毛五加叶
中的常春藤皂苷元进行了定性定量鉴别 ,对齐墩果酸进行了定性
鉴别。流动相条件参照《中国药典》 [ 3]木通项下规定 ,略作调整。
《中国药典》流动相条件为:甲醇 -水 -冰醋酸 -三乙胺(87∶13
∶0.04∶0.02),考察发现该条件下常春藤皂苷元分离不理想。
遂降低甲醇比例 ,比较了甲醇 -水 -冰醋酸 -三乙胺(85∶15∶
0.04∶0.02);甲醇 -水 -冰醋酸 -三乙胺(83∶ 17∶ 0.04∶
0.02), 前者出峰时间合适且分离良好 , 选择作为流动相条件。
表 1　样品测定结果 mg· g-1
样品来源 采集时间 常春藤皂苷元
　茂县石大关乡阳雀寨 2007-05 5.40
　茂县石大关乡阳雀寨 2008-07 10.17
　茂县石大关乡阳雀寨 2008-10 27.15
　小金县达维乡木尔寨沟 2007-06 4.58
　小金县达维乡红军坪 2008-08 2.96
　小金县达维乡红军坪 2008-08 5.87
　小金县达维乡红军坪 2008-08 4.74
　小金县达维乡木尔寨沟 2008-08 5.82
　小金县日隆乡双桥沟 2008-08 5.00
　小金县日隆乡双桥沟 2008-08 5.33
　小金县科牛村香路堂沟 2008-08 9.87
　小金县科牛村香路堂沟 2008-08 8.85
　小金县科牛村小太子坡 2008-08 7.00
　马尔康县梭磨乡坎竹沟 2008-08 7.28
　红原县刷经寺镇 329沟 2008-08 6.02
　红原县刷经寺镇 2队 2008-08 7.22
　　n=2
对样品提取方法进行了考察。分别比较了超声和回流提取;
盐酸和硫酸的水解效果;水解时加入的不同酸体积。结果表明 ,
回流提取常春藤皂苷元含量较高;盐酸的水解效果较好;盐酸与
甲醇比例为(1∶20)时水解效果最好。
对 15批红毛五加叶样品进行了测定 , 常春藤皂苷元的含量
在 2.96 ～ 27.15 mg/g之间。在同一地点采集的样品 , 随生长时
间的增长 ,常春藤皂苷元含量有逐渐增高的趋势。亦对红毛五加
茎皮中的常春藤皂苷元进行了测定 , 共测定了 12批不同来源样
品 , 其含量均在 0.02%以下 , 有的样品甚至无 , 茎皮中的齐墩果
酸含量亦甚低。
常春藤皂苷元为红毛五加叶中三萜皂苷元的主要类型 ,含量
较高。常春藤皂苷已证实具抗炎 、溶血 、细胞毒性 、诱导细胞凋亡
等生物活性 [ 4, 5] ,常春藤皂苷元可作为红毛五加叶含量测定的主
要指标 。
参考文献:
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