全 文 ：!!#
四种生长因子
对裂褶菌胞外多糖产量影响的优化研究
郑文科!，乔长晟!，郝利民，!，贾士儒!，江建梅!，张晓娟
（!天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津 #$$%&’；
(总后勤部军需装备研究所，北京 !$$$!$）
摘) 要：对 *+!、,-谷氨酸、柠檬酸和油酸等四种生长因子对裂褶菌胞外多糖产量的影响进行了优化研究。研究发现，
四种因子可不同程度地促进裂褶菌菌丝生长和其胞外多糖的生成。通过单因子实验，初步确定了各种生长因子的适
宜添加浓度。采用 *+!、,-谷氨酸、柠檬酸和油酸为四个实验因素，进行了 ,!.（%
&）正交实验，四种因子对裂褶多糖产
量影响的显著顺序为：油酸 /柠檬酸 / *+! / ,-谷氨酸；获得四种因子的优选水平组合：*+! $&01 2 ,、,-谷氨酸 $&01 2 ,、
柠檬酸 $$&1 2 ,、油酸 $(01 2 ,；在该优化条件下进行裂褶菌培养，其胞外多糖产量达到 &’#1 2 ,，比空白对照样提高了
.#’!3（4 5 $$&）。
关键词：裂褶菌，裂褶多糖，影响因子，正交实验
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中图分类号：IM($!#) ) ) ) 文献标识码：U) ) ) ) 文 章 编 号：!$$(-$#$.（($$V）$&-$!W!-$%
收稿日期：($$V-$!-!W) !通讯联系人
作者简介：郑文科（!V’V-），男，硕士，研究方向：生物高分子。
) ) 裂褶菌（!#$%&’#())*+ &++*,- X<）又称白参、树
花、八担柴，属于真菌门（.*+(&’#(/0），担子菌纲
（102$3$&+(-/-2），伞菌目（ 4506$0)-2），裂褶菌科
（!#$%&’#())0-0-），裂褶菌属（!#$%&’#())*+），是一种
药食两用菌［!］。裂褶菌及其发酵液含有多种糖类、氨
基酸、蛋白质、有机酸、酚性物和生物碱等成分，并具
有显著的抗缺氧和抗疲劳功效［(］。裂褶多糖主链为
!-!，#-糖苷键，主链上每隔三个葡萄糖分子有一个
以 !-!，.-糖苷键连接的侧链，裂褶多糖具有多种
潜在的应用前景，可作为增稠剂应用在石油开采行
业，可作为保鲜膜用于食物保存，还可用于高附加
值药物的生产等，同时其在调节免疫、抗肿瘤、抗辐
射等方面也有明显的疗效［#］。目前，在裂褶菌发酵
过程中，存在胞外多糖产量偏低的问题，为了进一
步提高裂褶菌菌丝体的生长速度，增加其胞外多糖
的产量，本文探讨了 *+!、,-谷氨酸、柠檬酸和油酸
等四种生长因子对裂褶菌菌丝体及胞外多糖产量
的影响，研究了相关生长因子促进菌丝体生长和胞
外多糖产生的最适作用浓度，并利用正交实验确定
了上述四因子对裂褶菌胞外多糖产量影响优选
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2009.05.039
!#$
组合。
! 材料与方法
!#! 实验材料
裂褶菌（!#$%&’#())*+ &++*,- !）# 由总后勤
部军需装备研究所提供；斜面种子培养基 # $%& 培
养基；液体种子培养基（’ ( )）# 葡萄糖 *+,+，豆饼粉
-+,+，酵母膏 -,+，.’/01·2340 +,5，634$01 -,+，73
8,+，-4-9灭菌 4+:;<；发酵培养基# 配制 -4=>;? 麦
芽汁 -+++:)，称取 -,+’ ( ) @31AB 溶于其中，-4-9灭
菌 4+:;<。
!#$ 培养方法
从 4C9下培养 8D 的种子斜面上用接种铲斜刮
下菌丝，用 5:)无菌水洗入装有 -5+:) 液体种子培
养基的 5++:) 三角瓶中；于 489、-5+ ( :;< 的条件
下振荡培养 *D。将液体种子以 -+E的接种量转接到
装有 -5+:)添加不同因子的发酵培养基的摇瓶中；
于 489、-5+ ( :;<的条件下振荡培养 8D。
!#% 检测方法
-,*,-# 菌体量测定 # 量取发酵液 -++:)，5+++ ( :;<
的条件下离心 -5:;<，收集菌体，用蒸馏水洗涤 * 次，
8+9烘干 5F，称重；每组实验做三个平行样。
-,*,4# 粗多糖测定［1］# 取发酵液 -++:)，5+++ ( :;<
离心 -5:;<，取上清液用 1 倍体积 G5E 乙醇沉淀
41F，获得白色纤维状粗多糖；8+9烘干 1F，称重；每
组实验做三个平行样。
-,*,* # 还原糖值的测定 # *，5 H二硝基水杨酸比
色法［5］。
-,*,1# 73的测定# 采用 73计测定。
$ 结果与讨论
$#! &’!对裂褶菌菌丝生长和胞外多糖产量的影响
I>-是脱羧辅酶的主要成分，参与碳水化合物代
谢中丙酮酸及 !H酮戊二酸的氧化脱羧作用，它和蛋
白质、氨基酸、糖类及脂类的生物合成及呼吸链等许
多重要代谢有密切关系。真菌代谢过程中，通过氧
化态与还原态的互变，I>-具有促进代谢物脱氢或传
递氢的作用。已有研究表明，I>-中的嘧啶环是合成
裂褶多糖的促进因子［8］。在装有发酵培养基的
5++:)摇瓶中，分别加入 +,5、-,+、-,5、4,+、4,5:’ ( )的
I>-培养 8D后，裂褶菌菌丝体和胞外多糖产量变化情
况如图 - 所示。
图 -# I>-对裂褶菌菌体量和胞外多糖产量的影响
由图 - 可知，添加适宜浓度的 I>-，对菌丝生长
和胞外多糖合成有一定程度的促进作用，添加 I>-
后，还原糖含量较未添加时有所下降；73 较空白对
照样有所下降（降低约 +,4-）；I>-添加量为 -,+:’ ( )
时，裂褶菌菌丝体和胞外多糖产量达到最高值，分别
为 -4,*G J +,*4’ ( ) 和 1,55 J +,*5’ ( )，分别比空白对
照样提高了 4G,5E和 *+,-1E。
$#$ 油酸对裂褶菌菌丝生长和胞外多糖产量的影响
在发酵体系中加入油酸等氧载体可以强化传
氧，氧载体的加入是以小液滴的形式存在，由于其对
氧气具有较高的溶解度而自动会聚集在气液界面之
上。油酸强化氧传递的作用是相当于一种表面活性
剂，降低了气泡膜的表面张力，使得气泡直径明显减
小，从而使气泡的比表面积大大增大；另一方面，油
酸的加入可能会有利于增加气相到液相的传质系
数，从而使 K)L 值也随之增加，强化了传氧；另外油
酸可能对细胞表面的絮凝性能发生作用，使菌丝能
相对分散生长，这增加了菌丝与液相的接触面积，有
利于传质的进行［2］。
在装有发酵培养基的 5++:) 摇瓶中，分别加入
+,-、+,4、+,*、+,1、+,5:’ ( ) 的油酸培养 8D 后，裂褶菌
菌丝体和胞外多糖产量变化情况如图 4 所示。
图 4# 油酸对裂褶菌菌体量和胞外多糖产量的影响
由图 4 可知，添加适宜浓度的油酸，对菌丝生长
和胞外多糖合成有一定程度的促进作用，添加油酸
后，还原糖含量较未添加时有所下降；73 较空白对
照样有所下降（降低约 +,42）；油酸添加量为 +,*:’ ( )
时，裂褶菌菌丝体和胞外多糖产量达到最高值，分别
为 -*,52 J +,45’ ( ) 和 5,*1 J +,*-’ ( )，分别比空白对
照样提高了 1+,GE和 12,GGE。
$#% ()谷氨酸对裂褶菌菌丝生长和胞外多糖产量
的影响
谷氨酸是某些氨基酸的前体。在氮代谢过程
中，所形成的第一个有机氨类化合物均为谷氨酸（或
谷氨酰胺），因此几乎所有氨基酸的合成都以谷氨酸
作为氮的供体［C］。
为了了解谷氨酸对裂褶菌菌体量和胞外多糖产
量的影响情况，在装有发酵培养基的 5++:) 摇瓶中，
分别加入 +,5、-,+、-,5、4,+:’ ( ) 的谷氨酸培养 8D 后，
裂褶菌菌丝体和胞外多糖产量变化情况如图 *
所示。
由图 * 可知，添加适宜浓度的 )H谷氨酸，对菌
丝生长和胞外多糖合成有一定程度的促进作用，添
加)H谷氨酸后，还原糖含量较未添加时有所下降；
73较空白对照样有所下降（降低约 +,-G）；)H谷氨
酸添加量为 -,+:’ ( )时，裂褶菌菌丝体和胞外多糖
产量达到最高值，分别为 -4,4* J +,14’ ( ) 和 1,CC J
+,44’ ( )，分 别 比 空 白 对 照 样 提 高 了 42,24E
和 *C,81E。
!#$
图 ! #$谷氨酸对裂褶菌菌体量和胞外多糖产量的影响
!#$ 柠檬酸对裂褶菌菌丝生长和胞外多糖产量的
影响
纵观裂褶菌的发酵过程，%& 呈逐渐下降的趋
势，这可能是由于糖酵解途径通量超出了三羧酸循
环代谢能力，从而糖酵解途径生成的丙酮酸会发生
积累，因此出现过量碳溢流，导致有机酸和其它物质
的生成［’］。有研究显示，在裂褶菌连续培养过程中，柠
檬酸和葡萄糖的联合代谢会阻遏有机酸等副产物的生
成，糖酵解途径减弱，这是因为加入柠檬酸时可增加
()* +的吸收，而 ()* +是丙酮酸激酶的强烈抑制剂，使得
乙酸等有机酸的生成量大大降低，因而更多的碳源进
入磷酸戊糖途径，使胞外多糖产量获得提高［,-］。
在装有发酵培养基的 .--/# 摇瓶中，分别加入
-0-.、-0,、-0*、-0!、-01、-0.2 3 # 的柠檬酸培养 45 后，裂
褶菌菌丝体和胞外多糖产量变化情况如图 1 所示。
图 1 柠檬酸对裂褶菌菌体量和胞外多糖产量的影响
由图 1 可知，添加适宜浓度的柠檬酸，对菌丝生
长和胞外多糖合成有一定程度的促进作用；添加柠
檬酸后，还原糖含量较未添加时有所下降；%& 较空
白对照样有所下降（降低约 -0!,）；柠檬酸添加量为
-0,2 3 #时，裂褶菌菌丝体和胞外多糖产量达到最高
值，分别为 ,!066 7 -0!42 3 # 和 .0,- 7 -0!!2 3 #，分别比
空白对照样提高了 1!0!!8和 1*0498。
!%$ 采用正交实验优化几种生长因子对裂褶菌胞外
多糖产量的影响
为了提高裂褶裂菌胞外多糖产量，在前述单因
素实验基础上，对 :;,、#$谷氨酸、柠檬酸和油酸等四
种生长因子进行 #,4（1
.）正交实验，实验设计见表 ,。
表 , #,4（1
.）正交实验设计
水平
因素
< :;,
（/2 3 #）
; #$谷氨酸
（/2 3 #）
(柠檬酸
（2 3 #）
=油酸
（/2 3 #）
, -0. -0. -0-. -0,
* , , -0, -0*
! ,0. ,0. -0* -0!
1 * * -0! -01
正交实验的结果和方差分析分别见表 * 和表 !。
表 * 正交实验结果与极差分析
实验号 < ; ( = >空白 多糖量
（2 3 #）
, , , , , , .0-*
* , * * * * 109.
! , ! ! ! ! !04’
1 , 1 1 1 1 !0.’
. * , * ! 1 !0!!
4 * * , 1 ! 10-4
9 * ! 1 , * !0-9
6 * 1 ! * , !06.
’ ! , ! 1 * !01’
,- ! * 1 ! , !0-1
,, ! ! , * 1 .0.,
,* ! 1 * , ! !0*4
,! 1 , 1 * ! .0,4
,1 1 * ! , 1 !09’
,. 1 ! * 1 , !011
,4 1 1 , ! * 10*-
?, 10*4* 10*.- 104’9 !096. !06!9
?* !0.99 !0’,- !04’. 106,9 !0696
?! !06*. !0’*9 !09-. !0.4. 10-1!
?1 10,19 !09*. !09,. !041. 10-..
@ -046. -0.*. ,0--* ,0*.* -0*,6
通过极差分析可知，四种因子对裂褶菌胞外多
糖生成影响的顺序为：油酸 A柠檬酸 A :;, A #$谷氨
酸；四个实验因素的优选组合为：<,;,(,=*，即 :;,
-0./2 3 #、#$谷氨酸 -0./2 3 #、柠檬酸 -0-.2 3 #、油酸
-0*/2 3 #。在上述四种因子优选组合的验证实验中，
裂褶菌胞外多糖产量可达 .09!2 3 #，比空白对照样提
高了 4!09,8（B C -0-.）。
表 ! 正交实验方差分析
因素 离差 自由度均方离差 D值 D-0 -.（!，!）显著性
:;, ,0,41 ! -0!6.! 9094- ’0*6-
#$谷氨酸 -0.9, ! -0,’-- !06-9 ’0*6-
柠檬酸 *0’.4 ! -0’619 ,’09-9 ’0*6- !
油酸 10-61 ! ,0!4-9 *90**9 ’0*6- !
误差 -0,. ! -0-.--
总和 6099. ,.
由正交实验的方差分析（表 !）可知，油酸和柠檬
酸对裂褶菌胞外多糖的生成有显著性影响（ B C
-0-.）。由于裂褶菌发酵是好氧发酵，且在发酵后期
发酵液十分粘稠，不利于氧的传递，故添加油酸后，
溶氧条件显著改善，从而胞外多糖产量获得较大提
高；而在发酵培养基中添加柠檬酸，有利于 E(<循环
产能，促进碳源代谢，使得裂褶菌菌丝体和胞外多糖
的产量获得提高。
&$ 结论
通过在裂褶菌液体深层培养过程中添加四种影
响因子，对裂褶菌菌丝生长和胞外多糖生成进行了
研究。:;,添加量为 ,0-/2 3 # 时，裂褶菌菌体量和裂
褶菌多糖产量分别比空白对照样提高了 *’0.-8和
!-0,18；油酸浓度为 -0!/2 3 #时，裂褶菌菌体量和胞
外多糖产量分别比空白对照样提高了 1-0’-8 和
190’’8；#$谷氨酸浓度为 ,0-/2 3 #时，裂褶菌菌体量
（下转第 ,69 页）
!#$
测得酶解液的 !#$%&’为 ()*))+，表明经碱性
蛋白酶和胰蛋白酶双酶分步水解后的小麦蛋白酶解
液中，含有较多的小分子肽。
!#$ %&’(法测定小肽的相对分子量分布结果
对制备的 ,-.活性肽的相对分子质量进行测定，
测得其由相对分子量为 /(01 和 /223 的两组分组成，
峰面积百分比为 )0*45+和 41*)2+。
图 46 789法测定活性肽的相对分子量结果
)$ 结论
)*6 以小麦蛋白为原料，先用碱性蛋白酶在温度
4:;、<75*0、底物浓度 1+（ = > ?），酶用量 2*0+
（= > =）条件下水解 /@，水解度为 /2*/0+，再用胰蛋
白酶在温度 1:;、<75*:、酶用量 2*0+（= > =）的条件
下进行二次水解 /@，水解度提高 )*):+。
)!6 离心干燥后，得到粉末状的白色活性肽制品，活
性肽的得率为 42*)(+，活性肽中谷氨酰胺的含量为
))*21+，!#$%&’指数为 ()*))+。
))6 789法测定谷氨酰胺活性肽由相对分子量为
/(01 和 /223 的两组分组成，峰面积百分比为
)0*45+和 41*)2+。
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40B43*
（上接第 2() 页）
和胞外多糖产量分别比空白对照样提高了 /3*3/+
和 )(*41+；柠檬酸浓度为 :*2O > 9 时，裂褶菌菌体量
和胞外多糖产量分别比空白对照样提高了 1)*))+
和 1/*43+。
通过正交实验确定了四种因子对裂褶菌胞外多
糖生成影响的顺序为：油酸 ‘柠檬酸 ‘ a[2 ‘ 9$谷氨
酸；四种实验因子的优选组合为：a[2 :*0IO > 9、9$谷
氨酸 :*0IO > 9、柠檬酸 :*:0O > 9、油酸 :*/IO > 9；在此优
化组合条件下进行裂褶菌培养，其胞外多糖产量比
空白对照组提高了 4)*32+（8 b :*:0）。
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