全 文 ：真 菌 学 报 6 (3 ) :17 0一 x7 7 , x夕5 7
A e t。 用恤` 。 10 9 ,’C a iS n ,’C 。
裂褶菌深层培养及多糖测定
李 兆 兰
(南京大学生物系 , 南京 )
摘要 为了深层培养裂褶菌 s动云oz p句 lu 、 co m 、 “ , 。 rF · 产生多 糖 , 对产多糖的适宜 培养基 ,
最佳时间 , 高产菌株进行了研究 。 从南京灵谷寺及南京大学校园生长的裂褶菌子实体分离到
3 株产多糖的裂褶菌菌株 ,编号南大 8 3 5 , 南大 8 ” , 南大 8 5 3 。 对南大 84 3用 6种不同培养基
进行深层培养 ,测定和比较了多糖和菌丝产量 , 其结果表明黄豆粉葡萄糖液体培养基是适于裂
褶菌合成多糖的培养基 ,能培养出密集 、 白色 、 均匀的菌球和丰富的多糖 。其组成为 ( g }L ) : 葡萄
糖3 0 ,黄豆粉 5 , 酵母膏2 , K H Z p o ` z , M g s o ; · 7H : 0 0 . 5 。 p H 5 . 5。 最适发酵条件 : p H s一 5 . 5 ,
温度 26 一 28 ℃ , 振速 : 10 0一 110 次 /分 ,当 p H 降至 4 . ,一 4 . 7 , 残糖量在 1% 以下 , ,一 6天可
终止发酵。 在培养 6天的浓缩滤液中加入等体积的 95 % 乙醇后大量白色粘稠 、 纤维状的多
塘被沉淀下来 。 在上述发酵条件下 , 3个菌株比较结果 , 南大 85 3 能明显提高多糖产量 , 6 天
的培养液中多糖量可达 5 . 5一 6 g ZL , 南大 84 3 和南大 83 5分别是 5 9邝 和 2 . 8 9 / L 。
关锥词 裂褶菌 ;深层培养 ;裂褶多糖 ;真菌多糖
材料 和 方 法
(一 ) 材料
1
。菌种
将采集到的裂褶菌子实体用 1编 升汞对子实体表面灭菌 5 分钟 , 无菌水漂洗 3 次 , 按无菌 操作取
1一2 块米粒大小的组织块移人马铃薯葡萄糖琼脂 ( P D A ) 斜面中央 , 2呼℃ 温箱中培养 , 10 天左右菌丝
布满斜面 , 选长势好的斜面进行转管纯化 , 纯化后的菌种留作母种 , 共分离 3 株裂褶菌 , 编号南大 8 3 5 、
南大 8呼3 、 南大 8 5 3。 以上获得的纯菌株需经菌丝体检验及子实体复栽试验确认无误后方可使用 。 用无
菌液体石蜡保藏菌种或斜面低温保藏菌种 ,尽量少传代。 将裂褶菌母种接种到木屑培养基上 , 子实体长
出后通过组织分离或多抱分离获得新的双核菌丝体做为复壮的母种 。
2
. 培养基
( l) 母种培养基— 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ( P D A ) 。
( 2 ) 子实体培养基— 木屑培养基 。
(习 深层发酵培养基— 黄豆粉葡萄糖培养基 。
(二 ) 方法
1
. 培养方法
温度 26 一s2 ℃ , PH S一 , . , , 摇瓶机振速 : 往返式 1 0 一 1 10 次 /分 , 旋转式 1 8D 转 /分 。 装液量 : 2 50
mI 三角瓶装 10 0 lm 培养液 , , 0 mJ 三角瓶装 150 蒯。 斜面菌种接种量每一斜面接种 2 瓶 , 液体接种量
为 ,% 或 10 % 。
2
. 测定方法
l( ) 菌丝体干重测定 : 按常规法测定
本文于 1 9 8 5年 I Q月 2 8 日收到。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1987. 03. 010
3期 李兆兰 : 裂褶菌深层培养及多糖测定 1 7t
( 2 )P H测定 : p Hs一2 型酸度计侧定 。
( 3 )还原糖测定 : 蕙酮法或碘量法 。
(叼 氨基氮的测定 : 用甲醛滴定法 。
3
. 裂褶多糖的提取
将发酵液用砂忍漏斗抽滤或离心机沉降 , 得菌丝体和滤液 。 将滤液减压浓缩或常压蒸发浓缩 , 浓缩
温度不超过 1 0 ℃ ,得粘稠状液体 , 浓缩液加人等体积的 95 % 乙醇醇析 , 其醇析时间不低于 2牛小时 ,获
白色纤维状沉淀 ,用 ” % 乙醇将沉淀洗涤数次 ,直至洗出液中无还原糖反应为止 , 再用无水乙醇洗涤数
次 , 在 “ ℃以下减压干燥 ,或将多塘溶于蒸馏水中 , 制成多糖溶液 , 滤去不溶物质 , 将多糖溶液喷雾干燥
或冷冻干燥 , 得裂褶多糖粗制品 。 将 10 m l 发酵液所得粗多搪置于试管中 , 加 5 m l 热水溶解 , 离心去
不溶物 , 定容 10 m l , 取 l lm 放入另一试管中 , 加 Z N H CI 在水浴上加热 , 水解 5小时 , 稀释 30 倍后取
l m ] 进行测定 , 所测出的多塘即为纯多糖 。
呼. 裂褶多糖的测定
采用蕙酮法进行裂褶多搪的测定 , 1 m l 多糖溶液加入 4 m l 的蕙酮试剂快速混合 , 置沸水浴中煮沸
10 分钟 ,在管口盖一玻璃球以防蒸发 , 冷却后在 6 20 n m 下测定光吸收值 , 并用空白试剂作对照 。
试 验 结 果
(一 ) 形态观察
1
. 菌丝体 : 菌落在 P D A 培养基上 , 24 ℃ 培养 10 天 , 直径 15 一 20 m m , 纯白色 , 绒
状 , 平薄 , 致密 , 紧贴基质 , 气生菌丝少 , 菌落反面淡黄色 。 扫描电镜观察 , 菌丝透明无色 ,
分枝繁茂 ,具横隔 , 宽 1 . 0一 1 . 7 邢m , 锁状联合大而显见 , 幼菌丝上特别多 . (图 l)
2
. 菌球 : 在 26 ℃ , 深层培养 2 天 , 菌丝相互缠结成菌球 (图 2 ) , 质地胶粘 , 大小不一 ,
直径 0 . 5一 I Cm , 少数小至 0 . 3。 m , 大至 l . s c m , 大菌球表面具放射状毛刺 , 静止培养从不形
成菌球 。
图 1 裂褶菌菌丝上的锁状联合
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图 2 裂褶菌在深层培养中形成菌球
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(二 ) 裂摺菌发醉液中 C 、 N 消耗与发醉终点的判断
南大 8 43 菌株在黄豆粉葡萄糖培养液中进行深层发酵培养 ,温度
发酵时间的延长 , 菌液由深变浅 , 由混浊变清 , 发酵液的粘度逐渐增加
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、
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.
5 , 随着
, 并散发出浓郁的水
果香味。 培养至第 5 天 发酵液中还原糖降到 1多以下 , 氨基氮降到 15 肠 以下 , p H 降到 ,
以下 ,菌丝产量达最高量 (图 3 ) , 菌球体积 占发酵液体积 70 呢 , 此时可终止发酵
5一 6 天 。
, 发酵终点
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培养时间 C u l t u r e t而 e
图 3 裂褶菌发酵液中养分消耗
M 菌丝千重 ( g / 10 0m l )
c 还原糖 ( g / 1 0 0ml )
N 氨基氮 ( m g l l 00 0 1)
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3 期 李兆兰 : 裂褶菌深层培养及多糖测定
(三 ) 不同培养基对多糖和菌丝体产量的影响
对南大 8 43 菌株在上述的培养条件下 , 用 6 种不同配方的培养基进行深层培养 , 测定
培养 6 天的发酵液中多糖和菌丝体产量 , 进一步了解这些培养基对多糖和菌丝体产量的
影响 , 其结果如下 : 从多糖的得率来看 , 以黄豆粉葡萄糖培养基产糖率最高 , 可获得白色 、
粘稠 、 纤维状多糖 , 千重可达 5 9 / L (图 5 ) 。 菌丝产量以鼓皮培养基较优 , 菌丝干重可达
g9 / L
,
(图 4 ) 。 但从鼓皮培养基所培养出的菌丝和多糖其颜色较深 , 对多糖的制备工艺
带来脱色的麻烦 。
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图 4 不同培养基对菌丝产量的影响
人 黄豆粉培养基 B 献皮培养基
c 玉米粉培养基 D 综合马铃薯培养基
E 蛋白陈培养基 F 察氏培养基
凡 9 . 4 T h e d if e r e n t m a d i a a f e ` t e d t h e y i e ld s o f h y p h a e
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(四 ) 在深层培养中多糖和菌丝体产里的动态变化
南大 85 3 菌株在黄豆粉葡萄糖培养液中 , 温度 26 ℃ , 经 8 天深层培养 ,在不同时间内
的多糖和菌丝体产量显示在图 6 , 菌丝产量在第 5 天达最高量 ,每 10 0 lm 培养液可产菌丝
1 7 4真 菌 学 报 6卷
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图 5 不同培养基对多塘产量的影响
〔 习 粗多塘 C r u d e 卯 ly姐 c c h a r id 。
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图 6 深层培养中菌丝及多糖产量的变化
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3
.期 李兆兰 : 裂褶菌深层培养及多糖测定
1
.
2 5 9干重 , 第 6天开始下降。 多糖产量在第 6 天达最高量 , 每升培养液可产多糖 .5 5 9
干重 。 第 7 天开始下降。
(五 ) 三个菌株的多糖产量和生长速度的比较
对南大 8 3 5 , 南大 84 3 , 南大 8 53 三个菌株用黄豆粉葡萄糖作为培养基 , 在 26 ℃ 进行
深层培养 , 用培养 6 天的发酵液测定多糖产量 。 结果表明南大 8” 菌株产多糖量最高 , 可
达 6 9 / L , 南大 8 4 3 菌株次之 , 可达 , g / L。 南大 8 3 5仅 2· 8 9 / L o
将三个菌株培养在木屑培养基上测定其生长速度。 结果是南大 85 3生长速度最快 ,
菌丝柱高 14 c m , 南大 84 3 高 12 c。 。 在子实体原基和子实体形成的时间方面是南大 84 3
最早 , 分别为 巧 天和 20 天形成原基和子实体 ,南大 85 3 分别为 25 和 30 天 , 南大 83 5 最
晚 , 需 50 和 60 天才形成 。
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菌株 5 t r a i n s
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菌丝柱 H y p h a e e o l u , n n
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图 7 三个菌株的多塘产量和生长速度的比较
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讨 论
1
. 通过实验我们选出了一种廉价的适于裂褶菌合成多糖的黄豆粉葡 萄 糖 液体培 养
基 。 日本小松信彦教授 ( 1 9 7 0 )已证实维生素 B : 分子中的吻吮环是裂褶多糖的生长因子 ,
可刺激裂褶菌合成多糖 , 另外他还发现谷氨酸对裂褶多糖的形成有促进作用 。 本试验虽
未直接研究这二因子与多糖的关系 , 但黄豆粉培养基中的酵母浸出汁含丰富的维生素 丑; ,
黄豆粉中所含谷氨酸 占总氨基酸的 20 多 , 因此该培养基可高产多糖 , 显然这二因子是必
需的 。 小松信彦教授研究裂褶多糖时 , 使用 3外 葡萄糖和 3多 酵母浸出汁作培养基 , 未加
学t 76 真 菌 报 6 卷
任何其它成分 ,在 ” 天的裂褶菌培养液中可得 4 9 / L 多糖。 相比之下 , 黄豆粉葡萄糖培
养基产多糖周期短 , 产糖率高。
2
. 用蕙酮法测定多糖 ,快速 、 简便 、 准确 、便于工厂推广和应用 。 而酚硫酸法 、 费林试
剂法 、 铜试剂法虽较准确 , 但操作麻烦 , 故只适用于实验室内。
、
3
. 在多糖醇析中 ,过去一直采用 3一 5 倍于浓缩液体积的 95 呱乙醇去醇析多糖 ,本实
验仅用等体积的 95 多 乙醇即可达到相同效果 。
参 考 文 献
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3期 李兆兰 : 裂褶菌深层培养及多搪测定 认六 、 一心丫f , 、 1孙。 找
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C h a r i d o e o u l d b e p r e e i p i r a t e d f r o m e o n e e n t r a t i v e f i l t r a t e o f 6 d a邓一 o l d e u i r u r e s b y t h e a d d it i o n
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