全 文 ：裂褶菌液态深层培养条件的研究
贾士儒 殷海松 邓桂芳 李 政
(天津科技大学天津市工业微生物重点实验室 天津 300222)
摘要 研究了裂褶菌液态深层培养过程中通风量以及控制溶氧浓度(DO)对裂褶菌丝体生长和胞外多糖产量
的影响。通过在发酵过程中的不同时期改变通风量和将溶氧浓度维持在 20%以上,均能有效地控制罐内氧传递
速率,增加菌体对碳源的利用率,且还原糖消耗速率和菌体得率明显提高。当在发酵过程中的不同时期改变通
风量时,菌丝体得率和胞外多糖产量分别为 14.83g/L和 2.12g/L。当溶氧浓度维持在 20%以上时,菌体得率为
15.56g/L,但是多糖产量仅有1.00g/L,说明高溶氧不利于多糖的生产。
关键词 裂褶菌 裂褶多糖 菌丝体得率 胞外多糖产量
文章编号 1009-7848(2006)02-0046-04
裂褶菌(SchizophylumcommuneFr)别名白
参、树花,属于担子菌纲、伞菌目、白蘑科、裂褶菌
属的高等真菌[1]。我国用真菌治疗疾病有悠久的历
史,最早的药书《神农本草经》就有记载灵芝、茯
苓、猪苓等作药用。由于真菌具有抗癌活性,因此
越来越引起人们的重视。李兆兰对裂褶菌的子实
体及其深层培养的发酵液进行了分析,结果表明
其子实体与发酵液中均含有多种增强免疫的活性
成分,其中裂褶多糖是最主要的抗肿瘤成分[2]。裂
褶菌胞外多糖的研究始于20世纪60年代。1969
年,N.Komatsu等人[3]从裂褶菌中分离提取到裂褶
菌胞外多糖,并证明它具有抗肿瘤活性。
本文对裂褶菌的液体深层培养进行了研究,
探讨不同发酵条件对裂褶菌菌丝生长和胞外多糖
产量的影响。
1 材料和方法
1.1 菌株
裂褶菌,天津市工业微生物重点实验室提供。
1.2 培养基
1.2.1 斜面种子培养基——PDA培养基 培养基
配方 (g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0,MgSO4·
7H2O1.5,KH2PO43.0,VB10.01,琼脂20.0,加
入20%的土豆汁至1L。
1.2.2 种子液体培养基 培养基配方(g/L):葡
萄糖 30.0,黄豆粉 10.0,酵母膏 1.0,MgSO4·7H2O
0.5,KH2PO41.0,VB10.01,pH6.0。
1.2.3 发酵培养基 培养基配方(g/L):12°Brix麦
芽汁,0.5%NH4Cl。
1.3 仪器与设备
7L自动发酵罐,722光栅分光光度计,LD5-
2A型低速离心机,DGG型电热鼓风干燥箱,PH-
SJ-4A型数字pH计。
1.4 培养方法
斜面种子26℃培养6d,然后从斜面试管中
用接种钩切1cm2带培养基的斜面菌丝,转入装液
量为150mL的500mL种子瓶中,26℃、150r/min
培养3d,再将种子以10%的接种量转到发酵培养
基中发酵罐培养。发酵罐容积7L,装培养液4L,
培养温度26℃,pH值不调节。
1.5 检测方法
1.5.1 生物量的测定 取发酵液 100mL,3500
r/min离心15min,弃上清液,菌体用蒸馏水洗涤2
次,在60℃恒温烘箱中烘干至恒重,称量。
1.5.2 还原糖的测定[3] 采用 3,5-二硝基水杨酸
比色法。
1.5.3 总糖的测定[4] 取样品1mL于25mL的比
色管中,加入 7mL蒸馏水和 2mL6mol/L的
收稿日期:2004-04-26
基金项目:天津科委重点基金资助项目(No.043801611)
作者简介:贾士儒,男,1954年出生,教授
Vol.6 No.2
Apr.2006JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology
中 国 食 品 学 报第6卷 第2期
2006年 4月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2006.02.008
第6卷 第2期
HCl,沸水浴1h,冷却,加3滴0.5%酚酞,用6mol/
L和0.1mol/L的NaOH调至微红,用蒸馏水稀释
一定倍数,其余步骤同还原糖含量测定。
1.5.4 粗多糖的测定 取发酵液100mL,3500r/
min离心15min,所获上清液用 2倍体积的 95%
乙醇沉淀过夜,得到白色纤维状粗多糖。将粗多糖
用75%乙醇洗涤2次,置于60℃烘箱中烘干至恒
重,称量。
1.5.5 pH值的测定 用pH计测定。
2 结果与讨论
2.1 通风量对菌丝体生长和胞外多糖产量的影
响
搅拌转速一定,改变通风量,培养方法按文中
1.4对裂褶菌进行深层液体培养,观察菌丝生长和
胞外多糖产量的情况。
图1和图2分别是裂褶菌在通风量为 100L/
h和150L/h、搅拌转速均为200r/min时的发酵过
程曲线。从两个图可以看出,发酵罐中裂褶菌生长
的4个时期大体上相同,即0～24h为适应期,24～
96h为对数期,96～104h为稳定期,104h之后为
衰亡期。表明胞外多糖的产量与菌体量呈一定的
相关性。
图1中菌体量在96h达到最高值,而多糖继
续形成,在104h达到最高量。图2中菌体量也在
96h达到最高值,而多糖也同时达到最高量。两图
中pH都比较稳定,在整个发酵过程中变化不大,
发酵后期稍有降低,这是由于在发酵过程中裂褶
菌会分泌少量的苹果酸[5]的缘故。还原糖在发酵
前、中期迅速被利用,这是菌体生长和产物形成的
结果。菌体达到最大量时的还原糖消耗速率分别
为0.344g/(L·h)和0.354g/(L·h)。在多糖达到最
高值时,还原糖都降至 50%以下,之后基本不变。
培养96h后菌体得率系数Yx/s(每消耗1g还原糖
所产的菌丝干重)分别为 0.38和 0.45。而经分别
培养104h和96h后菌体的多糖产量系数Yps/s(每
消耗 1g葡萄糖所产的多糖量)分别为 0.035和
0.034。
图1中菌丝体得率为12.44g/L,胞外多糖产
量为1.20g/L。图2中菌丝体得率为15.45g/L,胞
外多糖产量为1.18g/L。
通过分析发现在一定范围内改变通风量,而
搅拌转速维持不变,对裂褶菌的发酵过程不会有
太大的影响。但是,比较两图可以看出提高通风
量有利于菌体的生长,却对多糖的形成有抑制作
用。图2中多糖产量比图1中的多糖产量稍低一
些,这与 Rau等[6]报道在丝状真菌 Schizophylum
commune的培养过程中充足的氧供应会提高细胞
的生长速率、降低胞外葡聚糖形成速率相符合。但
是,如果氧气供应不足,则不能满足菌体生长的需
要,菌体生长不完全,导致不能充分利用碳氮源而
还原糖
生物量
粗多糖总糖
pH
时间/h
生
物
量
/g·
L-
1 、
pH
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120
图2 裂褶菌在7L发酵罐中通风量为150/h时的
发酵过程曲线
Fig.2 ThecurveoffermentationprocessofSchizophylum
ina7-literfermentorwitha150L/haerationrate
粗
多
糖
/g·
L-
1
还
原
糖
/1
00
g·
L-
1 、
总
糖
/1
00
g·
L-
1
还原糖
生物量
粗多糖总糖
pH
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
14
12
10
8
6
4
2
0
0 16 32 48 64 80 96 112
时间/h
粗
多
糖
/g·
L-
1
还
原
糖
/1
00
g·
L-
1 、
总
糖
/1
00
g·
L-
1
图1 裂褶菌在7L发酵罐中通风量为100/h时的
发酵过程曲线
Fig.1 ThecurveoffermentationprocessofSchizophylum
in7-literfermentorwitha100L/haerationrate
生
物
量
/g·
L-
1 、
pH
裂褶菌液态深层培养条件的研究 47
中 国 食 品 学 报 2006年第2期
生
物
量
/g·
L-
1 、
pH
粗
多
糖
/g·
L-
1
还
原
糖
/1
00
g·
L-
1 、
总
糖
/1
00
g·
L-
1
使多糖产量下降。在整个发酵过程中,若只恒定一
个通风量,对菌丝生长及多糖的形成并非是最好
的选择。这是因为菌丝生长和多糖形成的不同时期
所需的溶氧量不同,这就要求通风量也要做相应的
改变,才能有效地控制发酵向有利的方向进行。
菌体在培养初期,菌球处于适应期,生长缓
慢,需氧量少;至中期,菌丝快速生长,代谢加快,
对氧的需求量加大;而到后期,菌体停止生长,主
要形成多糖,对氧的需求又减少。因此在实验中
0～24h时,通风量为 100L/h;24～72h时,调节通
风量为 160L/h;72～96h时,调节通风量为 125L/
h;96～120h时,调节通风量为100L/h。培养方法
按文中1.4对裂褶菌进行深层液体培养,进一步
考察通风量的大小对菌丝生长和多糖产率的影响
(见图3)。
由图 3可以看出,0～24h为适应期,24～96h
为对数期,96～108h为稳定期,108h之后为衰亡
期。菌体量在96h达到最高值,而多糖继续形成,
在108h达到最高量。菌丝体得率和胞外多糖产
量分别为 14.83g/L和 2.12g/L。多糖产量比前两
组实验分别高出0.92g/L和0.94g/L。菌体达到最
大量时的还原糖消耗速率为0.375g/(L·h),比前
两组实验达到最大量时的还原糖消耗速率快。在
多糖达到最高值时,还原糖降至39.4%,之后基本
不变。培养96h后菌体得率系数Yx/s为0.41,多糖
产量系数Yps/s为0.053。
综上所述,通过在发酵过程中的不同时期改
变通风量能有效地控制罐内氧传递速率,增加菌
体对碳源的利用率,提高胞外多糖产量。
2.2 溶氧浓度(DO)对菌丝体生长和胞外多糖产
量的影响
由于氧供应直接影响菌体生长和产多糖情
况,故采用调节转速与通气量来提高溶氧。调节搅
拌转速100～300r/min和通风量100～250L/h以维
持DO在20%以上,考察 DO对裂褶菌菌丝生长
和多糖产量的影响。
从图4可看出,DO对菌体生长和多糖产量的
影响与前3组实验结果相比,裂褶菌生长周期缩
短了。0～16h为适应期,16～64h为对数期,64～68
h为稳定期,68h之后为衰亡期。菌体生长速率较
快,多糖形成速率也较快,并在 64h达到了最高
量,分别为15.56g/L和1.00g/L。菌体达到最大量
时的还原糖消耗速率为0.469g/(L·h),比前3组
菌体达到最大量时的还原糖消耗速率快。在发酵
结束时,还原糖含量降至40%以下。培养64h后
菌体得率系数 Yx/s为 0.52,比前 3组实验结果分
别高出27%、13%和21%,所以将溶氧浓度维持在
一个较高的水平可导致较高的还原糖消耗速率和
菌体得率。在 Azotobactervinelandi的培养过程
中[7]有过类似的报道。多糖产量系数Yps/s为0.033,
还原糖
生物量
粗多糖总糖
pH
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96108120
时间/h
图3 裂褶菌在7L发酵罐中不同时期通入不同
通风量时的发酵过程曲线
Fig.3 Thecurveoffermentationprocessof
Schizophylumina7-literfermentorwithdiferent
aerationratesindiferenttime
还原糖
生物量
粗多糖总糖
pH
时间/h
1.4
1.2
.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
图4 裂褶菌在7L发酵罐中DO维持在20%以上时
的发酵过程曲线
Fig.4 Thecurveoffermentationprocessof
Schizophylumin7-literfermentorwithDOabove20%
生
物
量
/g·
L-
1 、
pH
粗
多
糖
/g·
L-
1
还
原
糖
/1
00
g·
L-
1 、
总
糖
/1
00
g·
L-
1
48
第6卷 第2期
与前3组实验结果相比有所降低。这可能是由于
充足的氧满足了菌体生长的需要,促进其对糖的
快速利用,从而影响了代谢产物积累的缘故。
通过调节转速和通气量,提高了溶解氧,使氧
传递速率得以改善,优化了罐内发酵条件,促进了
菌体对碳源的利用,菌体得率系数大大提高,并且
生长周期也随之缩短,为工业化生产节约了成本。
但是胞外多糖产量较低,证实了充足的氧有利于
菌体的生长,却对多糖的形成有抑制作用。
3 结论
在发酵过程中的不同时期改变通风量能有效
地控制罐内氧传递速率,增加菌体对碳源的利用
率,提高胞外多糖产量。菌丝体得率和胞外多糖产
量分别为 14.83g/L和 2.12g/L。多糖产量比单一
改变通风量的两组实验结果分别高出 0.92g/L和
0.94g/L。
溶氧浓度直接影响菌体生长和产多糖情况。
通过调节转速和通气量,将溶氧浓度控制在20%
以上,提高了溶解氧,菌丝体生长较快,还原糖消
耗速率和菌体得率明显提高。菌丝体得率和胞外
多糖产量分别为 15.56g/L和 1.00g/L。实验结果
还表明充足的氧供应对多糖的形成有抑制作用,
降低了胞外葡聚糖形成速率。
参 考 文 献
1.裘维蕃主编.菌物学大全 [M].北京:科学出版社,1998.156
2.李兆兰.裂褶菌的发酵产物 [J].食品与发酵工业,1989,6:1～8
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genlimitationandfed-batchprocessing[J].IndMicrobiol,1992,9:12～26
7.PenaC,Trujilo_RoldanMA,GalindoE.Influenceofdissolvedoxygentensionandagitationspeedonalginatepro-
ductionanditsmolecularweightinculturesofAzotobactervinelandi[J].EnzymeMicrobTech.,2000,27:390～398
StudiesontheSubmergedCultureConditionsofSchizophylumCommune
JiaShiru YinHaisong DengGuifang LiZheng
(TianjinUniversityofScience&Technology,TianjinKeyLaboratoryofIndustryMicrobiology,Tianjin300222)
Abstract TheefectsofaerationrateandDOonyieldofmyceliumandproductionofexopolysaccharidewerestud-
iedduringthesubmergedcultureofSchizophylum commune.Theoxygentransferrateinthefermentorcouldbecon-
troledefectivelybychangingaerationrateindiferentperiodsduringthefermentationprocessandkeepingDOabove
20%,andcarbonsourcecouldbeutilizedquicklyandtheconsumerateofreducingsugarandyieldofmyceliumwere
increasedremarkably.Whenaerationratewaschangedindiferentperiodsduringthefermentationprocess,yieldof
mycelium andproductionofexopolysaccharidewere14.83g/Land2.12g/L,respectively.Yieldofmycelium reached
15.56g/LwhenDOwaskeepedabove20%,butproductionofexopolysaccharidewasonly1.00g/L.Itshowedthathigh
DOwasnotadvantageoustotheproductionofexopolysaccharide
Keywords Schizophylumcommune Schizophylan Yieldofmycelium Productionofexopolysaccharide
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