全 文 ：毛艳萍，罗明华，黄 梅，等． 甜叶菊愈伤组织诱导及不定芽的形成［J］． 江苏农业科学，2011，39(6) :86 － 88．
甜叶菊愈伤组织诱导及不定芽的形成
毛艳萍1，罗明华2，黄 梅2，易倩倩2
(1．绵阳师范学院科学技术协会，四川绵阳 621000;2．绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳 621000)
摘要:通过建立甜叶菊愈伤组织培养体系，以甜叶菊种子萌发出的无菌苗为材料，以茎尖、叶片及茎段为外植体，
采用正交试验设计，筛选适合愈伤组织诱导的最佳培养基。结果表明，3 种外植体均能成功的诱导出愈伤组织，其中
以叶片的诱导效果最佳，为诱导愈伤的最佳外植体;NAA浓度和 GA3 浓度对愈伤组织诱导的影响较大，最佳的愈伤组
织诱导培养基为 MS + 6 － BA 2． 0 mg /L + NAA 1． 0 mg /L + GA3 3． 0 mg /L。试验的 9 种培养方案中，有 7 种培养方案有
不定芽的产生，以茎尖为外植体的培养方案的不定芽诱导率最高，均达到 65%以上。叶片诱导出的愈伤长势较好，但
难以继续分化，茎尖形成不定芽数量最多，但不定芽长势不佳，不适合进行进一步培养。
关键词:甜叶菊;无菌苗;愈伤组织;不定芽
中图分类号:S566． 903 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2011)
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06 － 0086 － 03
(上接第 85 页)
呈现明显负相关。但是利巴韦林对薯蓣茎尖分化与增殖再生
之间并未表现出很好的一致性。当利巴韦林浓度超过
20 mg /L时，对薯蓣茎尖的增殖再生影响较大，而对薯蓣茎尖
的分化影响相对较小;当利巴韦林浓度上升到 100 mg /L 时，
才出现外植体的半致死效应;因此综合考虑薯蓣的分化与不
定芽增殖再生，在薯蓣茎尖离体脱毒过程中，60 ～ 80 mg /L 是
一个相对比较恰当的抗病毒剂筛选浓度。由于薯蓣茎尖的分
化与不定芽增殖再生之间存在着非同步性，也就是说许多薯
蓣茎尖在分化启动之后，就停止了不定芽的再生，因此在利巴
韦林浓度筛选时，可以考虑采用分级分步的办法，在培养初期
使用较高的利巴韦林浓度，而在培养中后期降低培养基中抗
病毒剂浓度，这样既可以保证外植体的分化启动，又可以保证
形成大量新的不定芽。另外，在薯蓣茎尖离体脱毒过程中，利
巴韦林可以配合其他抗病毒剂或与物理方法处理，一方面提
高对病毒的联合致死效应，另一方面也尽可能降低对外植体
自身的伤害。
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甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科多年生草本植
物［1］，是我国 70 年代从国外引进并发展起来的菊科品种。叶
片中含有的甜叶菊糖苷为非糖质、无毒副作用、低热值的天然
甜味剂，甜味为蔗糖的 300 倍，是一种新型糖源［2］。此外，甜
叶菊糖苷还能防治糖尿病、肥胖症及小儿龋齿等，是此类患者
的理想甜味剂［3］。甜叶菊的繁殖方式主要有播种、扦插等，
但是传统的繁殖方式存在播种成活率不高、扦插植株根系较
弱等缺点。目前在组织培养方面，愈伤组织 ［8 － 9］及不定
芽［10 － 11］诱导方面已经有一定的成果。通过组织培养能尽量
避免外界环境的干扰，且繁殖速度快、效率高、再生植株遗传
收稿日期:2011 － 08 － 15
基金项目:四川省教育厅自然基金(编号:09ZC020) ;绵阳市科技计
划(编号:09Y003 － 7)。
作者简介:毛艳萍(1985—) ，女，四川绵阳人，硕士，助教，从事植物生
殖及生态研究。Tel:(0816)2201051;E － mail:yanping_mao@ 126．
com。
通信作者:罗明华，男，博士，教授，从事植物生理与分子生物学研究。
E － mail:969826049@ qq． com。
了优良品质，本试验为进行大量繁殖优良品种提供了依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
甜叶菊种子购于安徽省明光市富农甜叶菊专业合作社，
当年生。选取饱满种子，利用种子萌发出的无菌苗作为试验
材料。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 种子的消毒 将甜叶菊种子于 25 ℃恒温蒸馏水中预
处理 24 h，酒精消毒 20 s，无菌水冲洗 3 次，浸于 0． 1% HgCl2
中消毒一定时间(2、2． 5、3、4 min) ，无菌水冲洗 5 次，用无菌
滤纸吸取多余水分后接种。12 d 统计染菌率、种胚发苗率及
无菌苗生长状况，筛选出甜叶菊种子最佳消毒方案。
染菌率 =染菌种胚数 /接种的种胚总数 × 100%
种胚发苗率 =发苗的种胚数 /接种的种胚总数 × 100%
1． 2． 2 无菌苗的培养 无菌苗的培养分 2 种方式进行:一是
将消毒后的种子直接接种于萌发培养基上;二是将消毒后种
子先于湿润的无菌滤纸上催芽后，再接种于萌发培养基上。
比较 2 种培养方式的差异，优选出适合本试验的培养方式。
—68— 江苏农业科学 2011 年第 39 卷第 6 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2011.06.136
1． 2． 3 愈伤组织的诱导 待无菌苗长至一定阶段后，取其茎
尖、茎段及叶片为外植体进行愈伤组织的诱导。采用 L9(3
4)
正交试验设计愈伤组织诱导方案，因素及水平见表 1。试验
均以 MS培养基为基本培养基，附加蔗糖 30 g /L、琼脂 7 g /L;
灭菌前调节 pH值至 5． 9 ～ 6． 0;培养温度为(23 ± 1)℃;光照
强度为 2 000 lx，光照时间 10 h /d;重复 3 次。各组合 30 d统
计愈伤组织的出愈率及愈伤组织生长情况。
出愈率 =出愈的外植体总数 /接种的外植体总数 × 100%
表 1 愈伤组织正交设计
水平
因 素
外植体
6 － BA浓度
(mg /L)
NAA浓度
(mg /L)
GA3 浓度
(g /L)
1 茎尖 1． 0 0． 5 1． 0
2 茎段 2． 0 1． 0 2． 0
3 叶片 3． 0 2． 0 3． 0
2 结果与分析
2． 1 不同消毒方案对种胚发育的影响
从表 2 可见，4 种消毒方案对种胚发育影响差异较大，除
消毒 4 min 外，其他 3 种消毒方案均有染菌现象，但消毒 4
min的发苗率极低。消毒 2 min的污染率最高，生长出的无菌
苗胚轴极短且有部分白化;2． 5 min染菌率为 21． 3%，发苗率
为 70． 7%，但无菌苗较瘦弱;3 min染菌率最低，发苗率最高，
且无菌苗长势良好(图 1) ，为最佳消毒方案。
2． 2 2 种无菌苗培养方式的优劣
从表 3 可见，先催芽后接种的种子 2 d就开始发芽，而直
接接种于萌发培养基上的种子于接种后 6 d才开始出现发苗
迹象，先催芽后接种的种子无菌苗前期的生长也优于直接接
种。但是先催芽后接种的无菌苗在转接到萌发培养基上后，
生长情况开始变差，其外植体出愈能力也较弱。直接接种在
培养基上的种胚萌发出的无菌苗整体上生长更好，且更利于
愈伤组织的诱导，直接接种是无菌苗培养的最佳方案。
表 2 不同升汞消毒时间对种胚的影响
消毒时间
(min)
污染率
(%)
发苗率
(%) 种胚生长情况
2 35． 3 41． 8 一般，有白化苗
2． 5 21． 3 70． 7 较好，叶片偏黄
3 1． 5 97． 8 良好，部分叶片呈紫红色
4 0 3． 7 较差，瘦弱
表 3 两种无菌苗培养方式对比
处理 开始发苗时间 前期无菌苗生长情况 后期无菌苗生长情况 对出愈影响
直接接种 6 d 较小，生长较缓慢 良好，逐渐强壮 出愈能力较强
先催芽后接种 2 d 较好，叶片嫩绿，有根 较差，逐渐瘦弱 出愈能力较弱
2． 3 不同因素及水平对出愈的影响
接种后 5 d叶片边缘开始卷曲，出现愈伤化，后期愈伤组
织长势良好;茎尖及茎段在接种 7 d开始出现膨大，长出的愈
伤较蓬松。直观分析(表 4)表明，4 种影响因素对愈伤组织
表 4 不同因素及不同水平对出愈的影响
试验号 A B C D 出愈率
(%)
愈伤组织
生长情况
1 1 1 1 1 29． 4 +
2 1 2 2 2 59． 4 ++
3 1 3 3 3 30． 8 +
4 2 1 2 3 92． 6 +++
5 2 2 3 1 53． 8 ++
6 2 3 1 2 77． 1 ++
7 3 1 3 2 44． 1 +
8 3 2 1 3 58． 5 ++
9 3 3 2 1 55． 3 ++
k1 39． 867 55． 367 55． 000 46． 167
k2 74． 500 57． 233 69． 100 60． 200
k3 52． 633 54． 400 42． 900 60． 633
R 34． 633 2． 833 26． 200 14． 466
注:“ +++”表示愈伤长势较好，“ ++”表示愈伤长势一般，“ +”表示愈伤
长势较差。
影响大小顺序为外植体 ＞ NAA 浓度 ＞ GA3 浓度 ＞ 6 － BA 浓
度。从愈伤组织的生长情况来看，叶片为外植体的处理 4 和
处理 6 的效果最好，诱导出的愈伤组织蓬松且呈青绿色(图
2) ，与直观分析的结果一致;处理 2、处理 8、处理 9 效果其次，
愈伤多为灰绿色;处理 3、处理 5、处理 7 效果较差。从方差分
析结果(表 5)来看，外植体、NAA 浓度、GA3 浓度对愈伤组织
的诱导均有显著影响(P ＜ 0． 05) ，6 － BA 浓度影响不显著。
因此，外植体、NAA浓度、GA3 浓度均对愈伤组织诱导起着重
要作用。
2． 4 不同培养方案对出芽情况的影响
在愈伤组织诱导及培养的过程中，除处理 4、处理 5 外，
其他处理的外植体均有丛生芽长出。从图 3 可以看出，处理
2 出芽率最高，处理 1、处理 3、处理 7 出芽率相当，平均出芽
数相对较高的是处理 1、处理 9，图中反映出芽率和平均出芽
数的相关性不大。3种外植体中，茎尖为外植体的处理丛生芽
诱导率和平均出芽数均相对较高，更适合进行丛生芽的诱导。
从甜叶菊的愈伤组织上长出的丛生芽普遍长势不佳，芽短且
小，较瘦弱，大多芽的叶尖呈紫红色(图 4) ，部分芽出现白化
(图 5)或者玻璃化(图 6) ，因此不适合进行进一步的培养。
—78—毛艳萍等:甜叶菊愈伤组织诱导及不定芽的形成
表 5 不同因素水平出愈率的方差分析
因素 平方和 自由度 F值 F0． 05 显著性
A 1 840． 607 2 147． 876 19． 000 *
B 12． 447 2 1． 000 19． 000
C 1 031． 660 2 82． 884 19． 000 *
D 406． 407 2 32． 651 19． 000 *
误差 12． 45
3 讨论
植物的生长与分化不仅取决于外源激素的添加量，而且
细胞分裂素与生长素的比例也起着至关重要的作用。外源激
素可通过影响内源激素的合成和代谢而最终影响内源生长素
和细胞分裂素的水平［4］。本试验通过添加 6 － BA、NAA 和
GA3 诱导愈伤组织的产生，结果表明 6 － BA 与 NAA 的比例
较小时，愈伤组织生长较好，有研究表明 NAA 的添加有利于
愈伤组织的诱导及生长［5］。GA3 对细胞的分裂也有促进作
用，可以促进细胞的扩大，也有利于愈伤组织的生长［6］。
供试的 3 种材料中，叶片更易诱导出愈伤组织，是较佳的
愈伤组织诱导材料，与其他材料的研究一致［7］。在诱导愈伤
组织的过程中，大多数培养方案同时诱导出了从生芽，但有研
究表明从愈伤组织上生长出的不定芽遗传变异性大，不适合
进一步培养［8］。
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