全 文 ：2015　第十七卷　第九期　★Vol.17 No.9
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1866
　　　收稿日期：2015-01-16
　　　修回日期：2015-02-04
＊　　 吉林农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目（2012023）：复合酶联用大孔吸附树脂技术提取分离刺五加叶中金丝桃苷，负责人：陈秋连。
＊＊　 通讯作者：杨利民，教授，博士生导师，主要研究方向：药用植物生态与资源可持续利用研究。
刺五加为五加科植物 Acanthopanax senticosus
的地上茎或干燥根及根茎，主产于吉林、黑龙江、陕
西、辽宁、河北等地 [1]，别名有豺节五加、五加参等 [2]，
其味辛、微苦，性温，归心、脾、肾经 [3]，主治体虚乏
力、脾肾阳虚、失眠多梦、食欲不振等症 [4]。此外，皮
和叶也可作药用，中药名分别为刺五加皮和刺五加
叶 [5]。在化学成分方面，刺五加含有刺五加多糖、多
种糖苷、总黄酮等 [4]，其中的活性成分金丝桃苷对胰
脂肪酶活性和老化有一定的抑制作用 [6,7]，也是一种
有前途的具有防癌活性的替代物 [8]。
目前，金丝桃苷提取工艺的优化方法多是通过
改变溶媒、乙醇浓度以及提取时间等影响因素 [9]，本
课题组也曾用此传统提取法测得金丝桃苷的最高
提取率为 0.686%[10]，由此可知，传统提取方法的提
取率较低。近年来，复合酶法能辅助提取植物中的
天然产物，具有操作简单、效率高和环境友好等优
点，在天然产物提取方面应用日益广泛 [11]。Chen S
等 [12]利用纤维素酶和果胶酶辅助提取银杏叶中的
黄酮类化合物，其结果显示，提取率提高了 102%。
在菜籽、大豆、薇藻类和番茄的辅助提取中，该方法
的提取效果也较好 [13,14]。但是，复合酶法辅助提取
刺五加中的金丝桃苷的研究尚未见报道。
正交试验在天然产物的提取工艺优化方面也有
较多相关报道，如牡丹皮中丹皮酚的提取工艺 [15]，
对金银花提取液的醇沉工艺 [16] 以及肉苁蓉多糖的
提取工艺 [17]，均是利用正交试验法进行优化的。
本研究以果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶、木聚
糖酶按合理的比例制成复合酶，通过单因素实验和
正交实验法考察复合酶法辅助提取刺五加中金丝
桃的各个影响因素，经方差分析得出最佳的提取
工艺条件，从而较大地提高刺五加中金丝桃苷的提
取率。
复合酶法辅助提取刺五加叶中金丝
桃苷工艺研究＊
陈秋连，郑曼玲，蔡恩博，赵 岩，赵天琦，屠书梅，杨利民＊＊
（吉林农业大学中药材学院 长春 130118）
摘 要：目的：文章通过复合酶法辅助提取刺五加叶中的金丝桃苷，并利用正交试验优化其提取工艺。
方法：利用高效液相色谱法，以金丝桃苷为检测指标，对加酶量、温度、时间和 pH值等因素，采用正交试验
及方差分析法，以确定金丝桃苷复合酶法最佳提取工艺。结果：单因素试验的结果表明，各种酶对金丝桃苷
提取率均有一定程度的提高，各因素的影响水平从高到低分别为 pH、中性蛋白酶、温度、时间、果胶酶、木聚
糖酶和纤维素酶。通过正交试验分析可得：在复合酶为 2%果胶酶、2%木聚糖酶、0.5%中性蛋白酶和 0.5%
纤维素酶，提取温度为 30℃，提取为时间为 10 min，pH=4.5时，提取效果最佳，提取率为 1.84%，与传统工
艺相比，金丝桃苷产率提高了 107%。结论：使用复合酶法辅助提取金丝桃苷可较大的提高产率，具有一定
经济价值。
关键词：刺五加 金丝桃苷 正交试验 复合酶法 提取工艺
doi：10.11842/wst.2015.09.021　　中图分类号：R284.2　　文献标识码：A
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1867
世界科学技术—中医药现代化★中药研究
1 仪器与材料
1.1  仪器与试药
ALLTECH 高效液相色谱仪、SS420X 工作站、
UVIS-201 紫外检测器、Column Heater Model 631
柱温箱、HPLC Pump Model 626泵（美国 ALLTECH
公司）；KQ-5000DE 型数控超声波清洗器（昆山市
超声仪器有限公司）；万分之一电子天平（常熟市
百灵天平仪器有限公司）；101-A 型数显电热鼓风
干燥箱（上海阳光实验有限公司）；实验室常规仪
器等。
金丝桃苷对照品（批号：111521-201004，中国
药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，山东禹王实
业有限公司禹城化工厂）；水经微孔滤膜滤过（娃哈
哈纯净水）；甲醇（分析纯，北京化工厂）；无水乙醇
（分析纯，北京化工厂）。
1.2  药材 
刺五加叶采集于吉林省临江市老岭基地，经吉
林农业大学园艺学院胡全德教授鉴定为刺五加 Acan-
thopanax senticosus（Rupr. et Maxim.）Harms的叶。
2 方法与结果
2.1  溶液的制备
2.1.1  金丝桃苷酶法提取工艺
将刺五加叶干燥至恒重，粉碎，过 60 目筛。取
刺五加叶粉末 0.5 g，精密称定，加入一定量的酶和
pH=5.4 的缓冲液 15 mL，精密称定并记录重量数
据，于 30℃水浴锅中加热 20 min；再加入 95% 的乙
醇 15 mL，超声提取 30 min，静置，冷却至室温，补
足失量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.2  传统提取工艺
取刺五加叶粉末 0.5 g，精密称定，置于 50 mL
三角瓶中，用移液器精密量取 50% 乙醇 30 mL，浸
泡 12 h后超声处理 30 min，作为金丝桃苷对照溶液。
2.1.3  对照品溶液的制备 
取金丝桃苷标准品 0.004 g，精密称定，置于 10
mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，作为金丝桃苷对
照品溶液（溶度为 0.4 mg·mL-1），密封保存，待用。
2.2  色谱条件与系统适用性
色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×150 mm，
5 μm）；流动相：甲醇 -纯水（45%-55%）柱温：室温。
流速：1 mL·min-1；检测波长：360 nm；理论塔板数按
金丝桃苷峰计算不少于 2 000。
2.3  标准曲线的绘制
吸取上述“2.1.2”中配制的金丝桃苷对照品溶
液，分别进样 2、4、8、10、12 μL，按上述色谱条件进
行含量测定，以峰面积（Y）和进样体积（X）进行线性
回归，回归方程为：Y=489 269X-67 761，r= 0.999 7。
2.4  稳定性试验
供试品溶液同“2.1.1”项下方法制备，并分别
于 0，1，2，3，4，5 h 进样测定。结果显示，金丝桃苷
峰面积的 RSD为 1.2%。
2.5  精密度试验   
供试品溶液同“2.1.1”项下方法制备，连续进
样 5次，结果金丝桃苷峰面积 RSD为 1.17%。
2.6  重复性试验　 
供试品溶液同“2.1.1”项下方法制备，重复制
备 6份供试品溶液，分别测定，RSD均为 1.01%。
2.7  回收率试验
取刺五加叶粉末 2.2 g，平行称取 5 份，加入浓
度为 0.4 mg·mL-1 的金丝桃苷对照品溶液 10 mL，
同“2.1.2”项下方法制备，分别进行测定，计算金丝
桃苷平均回收率为 101.57%，RSD为 0.74%。
2.8  样品测定   
精密吸取试验制得的溶液 10 µL，按“2.2”项
下的色谱条件进样测定，将其峰面积代入相应的回
归方程，并按“提取液中金丝桃苷质量 / 药材质量
×100%”计算金丝桃苷的收率。
2.9  提取工艺的优化
2.9.1  单因素试验
选用纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、木聚糖
酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、中温淀
粉酶、甘露聚糖酶等 11 种酶，进行加酶量、温度、提
取时间和 pH 值考察试验。
2.9.2  正交试验
根据单因素酶解试验结果，进行正交试验 L8
（27），确定复合酶法提取刺五加中金丝桃苷的最佳
条件，优化提取工艺。采用直观分析法和方差法进
行结果分析。
3 结果与分析
3.1  传统提取工艺结果
按照“2.1.2”进行实验，平行 3 次，得到金丝桃
苷的平均提取率为 0.89%。
2015　第十七卷　第九期　★Vol.17 No.9
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1868
3.2  酶法单因素试验
3.2.1  各种酶不同加酶量的提取效果
各种酶在 pH 值为 5.4，酶解时间均为 20 min，
温度为 30℃，以及不同加酶量 (质量分数：0.25-2.5%)
的条件下金丝桃苷的提取结果，结果如表 1所示。
根据表 1，与传统工艺下金丝苷提取率（0.89%）
相比，不同的酶均可提高刺五加中金丝桃的提取
率。通过数据的综合对比，选出提取率提高的相对
较大的酶分别是果胶酶、木聚糖酶，中性蛋白酶（7
万）和纤维素酶。
3.2.2  加酶量的影响
选取 3.2.1 实验结果中的果胶酶、木聚糖酶、中
性蛋白酶和纤维素酶进行第 2次考察：pH值为 5.4，
酶解时间为 20 min，温度为 30℃，不同加酶量（质量
分数）条件下金丝桃苷的提取结果如图 1所示。
根据图 1可知，与传统提取的结果相比，刺五加
中金丝桃苷的提取率在不同酶量的作用下均有一
定的提高。其中，果胶酶和木聚糖酶在加酶量为 1%
之前提取率呈上升的趋势，之后微有下降的趋势，
加酶量为 1% 时，金丝桃苷的提取率达到最大；木聚
糖酶在加酶量为 1.5% 之前呈上升的趋势，在 1.5%
加酶量之后呈下降的趋势，在加酶量为 1.5% 时金
丝桃苷的提取率达到最大；纤维素酶对金丝桃苷的
提取率变化影响最小；中性蛋白酶对金丝桃苷提取
率的作用变化较大。因此，4 种酶的加酶量在 1%
左右作用较好，金丝桃苷在果胶酶的作用下提取率
最高。
3.2.3  提取时间的影响
加酶量为 1% 时，其他条件保持不变，分别考察
果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶和纤维素酶在不同
酶解时间的提取结果，见图 2。
根据图 2 可知，随着时间的增长金丝桃苷的提
取率均呈下降的趋势，在酶解时间为 10 min 时，刺
五加中金丝桃苷的提取率在各种酶的作用下达到
最高。其中，在果胶酶酶解时间为 30 min时，金丝桃
苷的提取率有所增加，此后随着时间的增长，提取率
有下降。因此，各种酶的最适酶解时间约为 10 min。
3.2.4  反应温度的影响
果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶和纤维素酶分
别在 pH 值为 5.4，酶解时间均为 10 min，其他条件
不变，在不同酶解温度的作用下金丝桃苷的提取结
果，结果如图 3所示。
由图 3 可知，中性蛋白酶和果胶酶在不同温
度下对刺五加金丝桃苷提取率的影响较小。木聚
糖酶和纤维素酶在不同温度下对金丝桃苷提取率
的影响较大，金丝桃苷的提取率随温度变化较大，
在 40℃和 55℃时，金丝桃苷的提取率达到最高；在
30℃时和 55℃时，金丝桃苷的提取率都较高，这表
明 30℃或 50℃是较好的酶解时间。
3.2.5  不同 pH 的影响
在加酶量均为 1%、酶解温度为 30℃时，分别考
察了木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶在
不同 pH 值条件下的提取效果，结果如图 4所示。
由图 4 可知，随着 pH 值的增大，刺五加中金丝
桃苷的提取率呈下降的趋势，4 种酶均在弱酸性条
件下有较好的酶解效果，pH 值为 4.5 时，金丝桃苷
的提取率最高，随着 pH 值的增大，提取率下降，结
果表明最佳的酶解 pH 值是 4.5。
3.3  正交试验
在单因素试验的基础上，为了优化提取工艺，选
取果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、纤维素酶、温度、
时间、pH 值 7 个对金丝桃苷提取影响较大的因素，
设计 L8（2
7）正交表进行正交试验。复合酶法提取
刺五加金丝桃苷正交试验设计及结果如表 2。
表 1 各种酶在不同加酶量条件下对提取率的影响 /100%
加酶量 对照
木瓜
蛋白酶
α-
淀粉酶
果胶酶 木聚糖酶
中性蛋白
酶（7万）
中温
淀粉酶
漆酶 纤维素酶
甘露
聚糖酶
β-葡萄糖
苷酶
中性蛋白
酶（5万）
0.25
0.89
1.32 1.14 1.43 1.25 1.15 1.38 1.28 1.50 1.65 1.36 1.42
0.5 1.37 1.48 1.52 1.33 1.59 1.48 1.47 1.58 1.29 1.19 1.47
1 1.12 1.37 1.65 1.39 1.03 1.45 1.41 1.41 1.38 1.45 1.43
1.5 1.27 1.16 1.43 1.50 1.57 1.52 1.19 1.35 1.33 1.38 1.25
2 1.39 1.34 1.41 1.29 1.60 1.53 1.39 1.43 1.33 1.52 1.36
2.5 1.20 1.35 1.46 1.44 1.46 0.74 1.40 1.45 1.47 1.51 1.56
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1869
世界科学技术—中医药现代化★中药研究
由表 2，经过简单的直观分析，可知各因
素对实验结果均有一定的影响，因素的主次为
G>C>E>F>A>B=D，即影响的大小顺序为 pH、中性
蛋白酶、温度、时间、果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶；
对各因素和水平进行直观分析，确定各因素的优水
平是 A2、B2、C1、D1、E1、F1 和 G1，各因素的优水平
组合是 A2B2C1D1E1F1，即复合酶对刺五加叶进行前
处理的最佳工艺：果胶酶加酶量为 2%，木聚糖酶的
加酶量为 2%，中性蛋白酶的加酶量为 0.5%，纤维
素酶的加酶量为 0.5%，温度 30℃，时间 10 min、pH
值为 4.5。在此条件下，金丝桃苷的提取率为 1.84%。
3.3.1  正交试验结果方差如表 3。
由表 3 的方差分析结果可知，其中 pH 值的变
化对实验结果的影响最大，对实验结果有一定的相
关性，试验中其他因素对实验结果影响较小。
3 讨论
对 4 种酶进行单因素考察实验，4 种酶的最适
图 1 加酶量对金丝桃苷提取率的影响
图 4 pH 值对金丝桃苷提取率的影响
图 2 酶解时间对金丝桃苷提取率的影响
图 3 温度对金丝桃苷提取率的影响
表 2　复合酶法提取刺五加金丝桃苷正交试验设计及结果
试验号
因素
A果胶酶 /% B木聚糖酶 /% C中性蛋白酶 /% D纤维素酶 /% E温度 /℃ F时间 /min G/pH 金丝桃苷得率
1 1（0.5） 1（0.5） 1（0.5） 1（0.5） 1（30） 1（10） 1（4.5） 2.26
2 1 1 1 2（2.0） 2（50） 2（30） 2（5.5） 1.25
3 1 2（2.0） 2（2.0） 1 1 2 2 1.23
4 1 2 2 2 2 1 1 1.81
5 2（2.0） 1 2 1 2 1 2 1.23
6 2 1 2 2 1 2 1 1.85
7 2 2 1 1 2 2 1 1.9
8 2 2 1 2 1 1 2 1.68
K1 6.55 6.59 7.09 6.62 7.02 6.98 7.82
K2 6.67 6.62 6.12 6.59 6.19 6.23 5.39
k1 1.638 1.647 1.772 1.655 1.755 1.745 1.955
k2 1.665 1.655 1.530 1.647 1.547 1.558 1.347
R 0.027 0.008 0.242 0.008 0.208 0.187 0.608
2015　第十七卷　第九期　★Vol.17 No.9
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕1870
加酶量各不相同。在正交试验中，果胶酶和木聚糖
酶的最佳加酶量是 2%，而中性蛋白酶和纤维素酶
的最佳加酶量是 0.5%，4 种酶相互作用，最适加酶
量也随着变化。
检测酶活性一般考察温度、pH、作用底物和酶
浓度，而作用时间会随着底物的变化而变化。在单
因素试验和正交实验中，酶对刺五加叶细胞壁酶解
的最佳时间是 10 min。然而，随着时间的增加，提
取率下降，因此在短时间内，酶主要作用于细胞壁，
而随着时间的增长，作用的物质更复杂，从而降低
提取率。
果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶和纤维素酶的活
性温度范围分别在 40-60℃，30-40℃，40-50℃和
45-65℃。单因素试验中，最适温度在 30 和 55℃，
大都在各种酶的最适活性温度范围内，正交试验
中，4种酶相互作用下，最适温度是 30℃。
经过正交实验，确定了刺五加金丝桃苷最佳提
取工艺，该工艺条件下金丝桃苷提取率比传统提取
工艺的提取率增加了 1倍多，具有较好的经济效益。
4 结论
本文通过复合酶法对刺五加叶进行预处理，辅
助提取其中的金丝桃苷，并通过单因素考察和正交
实验，优化了金丝桃苷的提取工艺，在较大程度上
提高了金丝桃苷的提取率。而且，复合酶法辅助提
取的工艺操作简单、绿色环保，具有较好的应用价
值和经济价值。
表 3 正交试验结果方差分析
方差来源
离差
平方和
自由度 F值 P值 相关性
A 0.002 1 0.014
B 0.000 1 0.000
C 0.118 1 0.815
D 0.000 1 0.000
E 0.086 1 0.594
F 0.070 1 0.483
G 0.738 1 5.095 <0.1 *
误差 1.01 7
注：F0.1（1，7）=3.590。
1 陈仁寿 . 新编临床中药学 . 北京 : 科学出版社 , 2011׃ 414.
2 傅俊范 ,朴钟云 .中草药栽培技术 .沈阳 :东北大学出版社 , 2010׃ 191.
3 丁学欣 . 北方药用植物 . 广州 : 广东南方日报出版社 , 2009׃ 162.
4 易磊 . 妙用本草良方 . 北京 : 中医古籍出版社 , 2006׃ 216.
5 汉华 . 常见食物药用 . 北京 : 海洋出版社 , 2001׃ 54.
6 刘芳芳 , 张晶 , 张传奇 , 等 . 金丝桃苷在刺五加各部位中的分布及
其对胰脂肪酶活性的抑制作用 . 吉林农业大学学报 , 2013, 35(4)׃
442-445.
7 Kim H Y, Lee J M, Yokozawa T, et al. Protective activity of flavonoid
and flavonoid glycosides against glucose-mediated protein damage.
Food Chemistry, 2011, 126(3)׃ 892-895.
8 Sung K J, Tae G L, Jong E K, et al. Inhibitory effect of ERK1/2 and
AP-1 by hyperoside isolated from Acanthopanax sessiliflorus. Food
Chemistry, 2012, 130(4)׃ 915-920.
9 柯仲成 , 程子洋 , 陈龙 . Box-Behnken 效应面法优化贯叶金丝桃中
金丝桃苷的提取工艺 . 中成药 , 2012, 34(10)׃ 2023-2025.
10 蔡恩博 , 张崇禧 , 雷冰 , 等 . 不同采收期刺五加叶与无梗五加叶活
性成分分析 . 中国药学杂志 , 2010, 45(3)׃ 175-178.
11 Sowbhagya H B, Chitra V N. Enzyme-assisted extraction of flavorings
and colorants from plant materials. Crit Rev Food Sci Nutr, 2010,
50(2)׃ 146-161．
12 Chen S, Xing X H, Huang J J, et al. Enzyme-assisted extraction of
flavonoids from Ginkgo biloba leaves: Improvement effect of flavonol
transglycosylation catalyzed by Penicillium decumbens cellulase.
Enzyme Microb Technol, 2011, 48(1)׃ 100-105.
13 Sari Y W, Bruins M E, Sanders J P. Enzyme assisted protein extraction
from rapeseed, soybean, and microalgae meals. Industrial Crops and
Products, 2013, 43׃ 78-83．
14 Nagendrachari K L, Manasa D, Srinivas P, et al. Enzyme-assisted
extraction of bioactive compounds from ginger (Zingiber officinale
Roscoe). Food Chemistry, 2013, 139 (1-4)׃ 509-514.
15 王丹丹 , 陈俊 , 李俊丽 , 等 . 优选牡丹皮中丹皮酚的提取工艺 . 世
界科学技术 - 中医药现代化 , 2013, 15(9)׃ 1998-2001.
16 孙秀玉 , 王英姿 , 乔延江 , 等 . 正交试验法优化清开灵注射液中
金银花提取液的醇沉工艺 . 世界科学技术 - 中医药现代化 , 2014,
16(1)׃ 187-192.
17 肖道安 . 肉苁蓉多糖的提取工艺优化 . 世界科学技术—中医药现代
化 , 2014, 16(4)׃ 926-929.
参考文献
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1871
世界科学技术—中医药现代化★中药研究
Research on Composite Enzyme Assisted Hyperoside Extraction of Acanthopanax
senticosus and Its Process
Chen Qiulian, Zheng Manling, Cai Enbo, Zhao Yan, Zhao Tianqi, Tu Shumei, Yang Limin
(College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)
Abstract: This study was aimed to optimize the extraction process of hyperoside from leaves of Acanthopanax
senticosus by compounding-enzyme method and orthogonal experiment. The hyperoside compound was regarded
as standard and determined by HPLC. Based on the experiments of 4 factors including the enzyme amount,
temperature, extraction time and PH values, the extraction process of hyperoside was determined by the
orthogonal experiments and variance analysis. The results of single-factor experiments showed that different
enzymes showed different effects on the enhance yield of hyperoside. The effects of different factors showed that
the order of PH, neutral protease, temperature, time, pectinase, xylanase and cellulose was from strong to weak.
Through orthogonal analysis, the optimum conditions were 2% pectinase, 2% xylanase, 0.5% neutral protease, and
0.5% cellulose, under the temperature of 30°C, extraction time of 10 min, and pH = 4.5. Under these conditions,
the extraction rate was 1.84%. The yield was increased 107% compared with traditional process. It was concluded
that the use of compounding enzyme can increase the yield of hyperoside, which possessed a lot of economic
benefits.
Keywords: Hyperoside from Acanthopanax senticosus, orthogonal test, compound enzyme method, extraction
process
（责任编辑：马雅静　张志华，责任译审：王　晶）