全 文 ：［制 剂］
返魂草颗粒中 2 种成分在大鼠血浆中的药代动力学行为
于 倩1，2， 王晓波1* ， 杨媛媛1， 张瑞亚1，2
(1． 中国人民解放军第二一 O医院，辽宁 大连 116015;2． 大连医科大学药学院，辽宁 大连 116044)
收稿日期:2016-03-04
基金项目:国家科技重大专项 (2009ZXJ09002-019)
作者简介:于 倩 (1991—)，女，硕士生，研究方向为药代动力学。Tel: (0411)39847094，E-mail:15898187507@ 163． com
* 通信作者:王晓波 (1961—) ，男，博士，教授，研究方向为药学。Tel: (0411)39847094，E-mail:wxbbenson0653@ sina． com
摘要:目的 建立 LC-MS法同时测定返魂草颗粒中对羟基苯甲酸和对羟基苯乙酸在大鼠血浆中的含有量，并研究两
者的药代动力学行为。方法 分析采用 C18色谱柱 (4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相为 0. 1%乙酸-乙腈;体积流量
0. 6 mL /min;进样量 10 μL。测定大鼠灌胃给药后不同时间点的血浆药物浓度，并计算两种成分的药代动力学参数。
结果 对羟基苯甲酸和对羟基苯乙酸线性范围分别为 0. 4 ～ 2 000、5 ～ 2 000 ng /mL，平均回收率分别为 98. 36%、
96. 67%，ＲSD小于 4. 91%;基质效应分别为 89. 82%、95. 94%，ＲSD小于 7. 78%，无交叉干扰，ＲSD小于 15%。两
者药动学参数分别为 t1 /2 (9. 769 ± 2. 766)、 (4. 983 ± 1. 003)h，Tmax (1. 083 ± 0. 204)、 (0. 583 ± 0. 204)h，Cmax
(122. 9 ± 46. 225)、(1 273. 5 ± 316. 491) ng /mL，AUC0 － t(853. 95 ± 242. 035)、(3 066. 109 ± 524. 633)μg /(L·h) ，
CL /F (1 223. 792 ± 389. 327)、(333. 049 ± 53. 07)L /(h·kg) ，MＲT0 － t (12. 602 ± 3. 475)、(5. 225 ± 0. 688)h。结论
该方法快速、精确、可靠，适用于返魂草颗粒的药代动力学研究。
关键词:返魂草颗粒;对羟基苯甲酸;对羟基苯乙酸;药代动力学行为;大鼠;血浆;LC-MS
中图分类号:Ｒ969. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)07-1481-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 07. 009
Pharmacokinetic behaviors of two constituents in Fanhuncao Granules in
rat plasma
YU Qian1，2， WANG Xiao-bo1* ， YANG Yuan-yuan1， ZHANG Ｒui-ya1，2
(1. No. 210 Hospital of PLA，Dalian 116015，China;2． School of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116044，China)
ABSTＲACT:AIM To develop an LC-MS method for determining the contents of p-hydroxylbenzoic acid and p-
hydroxyphenylacetic acid in Fanhuncao Granules in rat plasma and to study their pharmacokinetic behaviors．
METHODS The analysis was performed on a C18 column (4. 6 mm ×150 mm，5 μm) ，mobile phase was 0. 1%
acetic acid-acetonitrile，flow rate was 0. 6 mL /min，and injection volume was 10 μL． The drug concentrations in
rat plasma at different time points were detected after intragastric administration，and thus the pharmacokinetic pa-
rameters of two constituents were calculated． ＲESULTS The linear ranges of p-hydroxylbenzoic acid and p-
hydroxyphenylacetic acid were 0. 4 － 2 000 ng /mL and 5 － 2 000 ng /mL，the average recoveries were 98. 36% and
96. 67% with the ＲSDs of less than 4. 91%，and the matrix effects were 89. 82% and 95. 94% with the ＲSDs of
less than 7. 78%，respectively． And no cross interference existed among the matrices with the ＲSDs of less than
15% ． Their pharmacokinetic parameters were t1 /2 of(9. 769 ± 2. 766)h and(4. 983 ± 1. 003)h，Tmax of(1. 083 ±
0. 204)h and (0. 583 ± 0. 204)h;Cmax of (122. 9 ± 46. 225)ng /mL and (1 273. 5 ± 316. 491)ng /mL，
AUC0 － t of (853. 95 ± 242. 035)μg /(L·h)and (3 066. 109 ± 524. 633)μg /(L·h)，CL /F of (1 223. 792 ±
389. 327)L /(h·kg)and (333. 049 ± 53. 07)L /(h·kg) ，and MＲT0 － t of (12. 602 ± 3. 475)h and (5. 225 ±
0. 688)h，respectively． CONCLUSION This rapid，accurate and reliable method is appropriate for the phar-
macokinetic study of Fanhuncao Granules．
KEY WOＲDS:Fanhuncao Granules;p-hydroxylbenzoic acid;p-hydroxyphenylacetic acid;pharmacokinetic be-
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havior;rats;plasma;LC-MS
返魂草又名麻叶千里光 (Senecio cannabifolius
Less) ，为菊科千里光属多年生草本植物，具有较
明显的抗菌、抗病毒、解热、镇痛、抗炎、调节免
疫、抗急性肺损伤、抗胃溃疡等药理作用［1-6］。其
中，酚酸类成分是抗菌抗病毒的主要活性物
质［7-10］，也是控制返魂草质量的重要指标。返魂草
颗粒是以返魂草为原料所制成的单方制剂，用于治
疗肺内感染、慢性支气管炎、哮喘性支气管炎和急
性呼吸道感染等症状。目前，对返魂草中原儿茶
酸、绿原酸、咖啡酸和金丝桃苷等成分的研究报道
较多［11-14］，但尚未见关于对羟基苯甲酸和对羟基
苯乙酸的报道。本实验以这两种活性成分为研究对
象，利用 LC-MS 法同时测定其在大鼠血浆中的含
有量，并研究了药物在体内动力学行为，可为分析
其体内过程和临床前药代动力学提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试药 返魂草颗粒 (中国人民解放军第二一
O医院制剂中心)、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸
对照品 (沈阳药科大学天然药物化学室提供，含
有量均≥98%);咖啡酸标准品 (批号 D0610AS，
美仑生物技术有限公司，含有量 ＞ 98%)。乙腈、
甲醇、乙酸均为色谱纯 (美国 Tedia 公司);羧甲
基纤维素钠为化学纯 (国药集团化学试剂有限
公司)。
1. 2 仪器 AB Trple QuadTM 4500 质谱仪 (美国
AB SCIEX公司) ;超快速液相色谱仪 (日本岛津
公司) ;BSA 224S 电子天平、Arium 611VF 超纯水
机 (德国 Satoruis公司);KH-100DB 数控超声波清
洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司) ;Vortex-Genie
2 涡旋振荡器 (美国 Scientific Industries) ;TGL-
16M台式高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;移
液枪 (20、200、1 000 μL，德国 Eppendorf 公司)。
1. 3 动物 SD 雄性大鼠 6 只，体质量 250 ～
300 g，SPF 级，动物合格证号 SCXK (辽)2015-
0001，购自辽宁长生生物技术有限公司，实验前适
应性喂养 1 周。
1. 4 色谱条件
1. 4. 1 液相条件 C18色谱柱 (4. 6 mm × 150 mm，
5 μm) ;流动相 0. 1%乙酸-乙腈 (3 ∶ 1) ;体积流
量 0. 6 mL /min;进样量 10 μL。
1. 4. 2 质谱条件 离子源 ESI;喷雾电压 4 500 V
(－);鞘气体积流量 30 L /min;辅助器体积流量
5 L /min;毛细管电压 － 37 V (－) ;毛细管温度
300 ℃;扫描方式为多反应监测 (MＲM)模式，
每种成分选择响应值最高的离子对用于测定，检测
离子见表 1。
表 1 检测离子
Tab. 1 Detection ions
成分 母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 /V 射入电压 /V 碰撞能量 /V 碰撞室射出电压 /V
对羟基苯甲酸 137. 1 93. 1 － 17 － 2. 5 － 21 － 9
对羟基苯乙酸 151. 1 107. 1 － 30 － 7 － 9. 1 － 8. 1
内标 179. 8 135. 9 － 84 － 13 － 20. 4 － 4
1. 5 溶液配制
1. 5. 1 标准品溶液 精密称取对羟基苯甲酸、对
羟基 苯 乙 酸 适 量，甲 醇 溶 解 定 容，配 制 成
0. 2 mg /mL标准品贮备液。使用时以此为母液，根
据实际需要用乙腈逐级稀释，得到一系列不同质量
浓度的工作液。
1. 5. 2 内标溶液 精密称取咖啡酸标准品适量，
加入乙腈溶解，得到 1 μg /mL工作液。
1. 5. 3 返魂草颗粒给药混悬液 取返魂草颗粒样
品适量，于研钵中研细，精密称取适量，置于
50 mL离心管中，加入生理盐水配制的 0. 1%羧甲
基纤维素钠溶液，制得大鼠灌胃混悬液，相当于对
羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸含有量分别为 0. 8、
0. 2 mg /kg。
1. 6 血浆样品处理方法 取血浆 50 μL，置于干
净 EP管中，加入 1 μg /mL内标溶液 20 μL以及乙
腈 150 μL，涡 旋 混 合 1 min，于 4 ℃ 下
14 000 r /min离心 10 min，吸取上清液，与水按
1 ∶ 1比例稀释，进样 10 μL测定分析。
1. 7 血浆样品采集 取 SD 雄性大鼠 6 只，给药
前禁食 12 h，自由饮水，称定质量，均灌胃 1 g /kg
返魂草颗粒混悬液，于给药后 0、0. 083 3、
0. 016 7、0. 25、0. 5、1、1. 5、2、4 (恢复供食)、
6、8、12、24、48 h 眼眶取血约 0. 2 mL，置于肝
素化的离心管中，于 4 ℃ 下 6 000 r /min 离心
10 min，吸取上清液，置于另一干净离心管中，储
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存于 － 80 ℃冰箱中，冷冻待测。
2 方法学考察
2. 1 专属性试验 按照本实验条件，测定给药前
不同来源的大鼠空白血浆、空白血浆中加入标准
品、给药后实际血浆样品，色谱图见图 1。由图可
知，峰形和各成分选择性均良好，均能和血浆中的
内源性成分达到很好的基线分离，空白样品在相应
位置上均无干扰。
1． 对羟基苯乙酸 2． 对羟基苯甲酸
1． p-hydroxyphenylacetic acid 2． p-hydroxylbenzoic acid
图 1 LC-MS色谱图
Fig. 1 LC-MS chromatograms
2. 2 标准曲线 精密吸取 0. 2 mg /mL 标准品贮备
液，配制成 1. 25、2. 5、5、12. 5、25、50、125、
250、500、1 000、2 000、2 500 ng /mL混合标准溶
液，分别取 10 μL，加入装有 50 μL血浆的一次性
EP管中，按 “1. 6”项下方法操作，得到系列质
量浓度溶液，与空白血浆样品一起进样测定。以待
测物质量浓度与内标质量浓度比值为横坐标 (x) ，
待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标 (y) ，
加权最小二乘法［15］线性回归 (权重系数 1 / X2) ，
结果见表 2，可知对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸分
别在 0. 4 ～ 2 000、5 ～ 2 000 ng /mL范围内线性关系
良好。
表 2 回归方程、相关系数及线性范围
Tab. 2 Ｒegression equations，correlation coefficients and
linear ranges
成分 回归方程 相关系数
线性范围 /
(ng·mL －1)
对羟基苯甲酸 y = 0. 098 2x + 0. 859 0. 997 2 0. 4 ～ 2 000
对羟基苯乙酸 y = 0. 012 3x + 1. 29 0. 995 0 5 ～ 2 000
2. 3 精密度与准确度试验 取空白血浆 50 μL，
分别加入混合标准品溶液 10 μL，配制成 12、192、
1 540 ng /mL 质控样品，每个质量浓度平行 5 份，
同法制备，连续测定 3 d，计日内、日间精密度及
准确度。结果，两种成分日内及日间 ＲSD 在
0. 38% ～4. 76%之间，准确度均大于 97. 59%，均
符合生物样品分析方法要求。
2. 4 回收率、基质效应及交叉干扰试验 取空白
血浆样品 50 μL，加入 12、192、1 540 ng /mL质控
样品 10 μL，每个质量浓度平行 5 份，同法处理，
进样分析，所测峰面积记为 A。
取空白血浆样品 50 μL，同法操作，每个质量
浓度平行 5 份，离心后获得上清液，加入与相同质
量浓度的质控样品 10 μL，进样分析，所测峰面积
记为 B。
取流动相 50 μL，加入 12、192、1 540 ng /mL
质控样品 10 μL，每个质量浓度平行 5 份，加入内
标混匀，进样分析，所测峰面积记为 C。
计算公式为提取回收率 = A /B × 100%，基质
效应 = A /C × 100%。
同法制备相同质量浓度的单成分与混合成分血
浆样品，交叉进样测定，考察两种成分是否存在交
叉干扰，结果见表 3。由表可知，该方法满足生物
样品定量分析的要求 (ＲSD ＜ 4. 91%)，血浆中无
明显内源性物质干扰 (ＲSD ＜ 7. 78%)，而且两种
成分不存在交叉干扰 (ＲSD ＜15%)。
表 3 回收率、基质效应及交叉干扰 (%，x ± s)
Tab. 3 Ｒecoveries，matrix effects and cross interferences
(%，x ± s)
成分 回收率 基质效应 交叉干扰
对羟基苯甲酸 98. 36 89. 82 101. 73
对羟基苯乙酸 96. 67 95. 94 88. 61
2. 5 稳定性试验 取空白血浆样品，加入低、中、
高质量浓度的质控样品，每个质量浓度平行 5 份，
同法处理，制成不同质量浓度的血浆质控样品，
于 － 80 ℃放置 10 d后测定，考察长期冷冻放置稳
定性;于 25 ℃放置 2 h 后测定，考察室温短期放
置稳定性;在进样盘于 4 ℃放置 24 h，考察临时储
存稳定性。结果，3 种条件下 ＲSD均 ＜ 15%，表明
该方法稳定性良好。
2. 6 药代动力学研究 取 “1. 7”项下血浆样品，
同法处理，与标准曲线一同进样测定，计算对羟基
苯甲酸、对羟基苯乙酸血药浓度，并绘制血药浓
度-时间曲线，结果见图 2。再用 DAS 2. 0 软件进
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行数据处理，对血药浓度结果采用非房室模型计算
主要的药动学参数，结果见表 4。
图 2 血药浓度-时间曲线 (n =6，x ± s)
Fig. 2 Plasma concentration-time curves (n =6，x ± s)
表 4 药代动力学参数 (n =6，x ± s)
Tab. 4 Pharmacokinetic parameters (n =6，x ± s)
参数 对羟基苯甲酸 对羟基苯乙酸
t1 /2 /h 9. 769 ± 2. 766 4. 983 ± 1. 003
Tmax /h 1. 083 ± 0. 204 0. 583 ± 0. 204
Cmax /(ng·mL －1) 122. 9 ± 46. 225 1 273. 5 ± 316. 491
AUC0 － t /［μg·(L·h)－ 1］ 853. 95 ± 242. 035 3 066. 109 ± 524. 633
(CL /F)/［L·(h·kg)－ 1］ 0. 981 ± 0. 312 0. 067 ± 0. 012
MＲT0 － t /h 12. 602 ± 3. 475 5. 225 ± 0. 688
3 讨论
本实验首次采用 LC-MS 法同时测定返魂草颗
粒中对羟基苯甲酸和对羟基苯乙酸在大鼠血浆中的
含有量，发现该方法准确可靠，灵敏度高，检测时
间短，样品用量少，可满足生物样品分析要求。另
外，药代动力学分析得到灌胃返魂草颗粒后血药浓
度-时间曲线，还通过非房室模型测得药动学参数，
这将进一步应用于返魂草颗粒的临床研究。
流动相考察时，比较了甲酸-水，0. 1%乙酸-
水和 0. 2%乙酸-水，发现水相比例为 75% (0. 1%
乙酸)时，峰形良好，各成分分离度理想，出峰
时间大大缩短至 8 min，检测灵敏度高，提高了分
析效率。而且，质谱条件选择对羟基苯甲酸、对羟
基苯乙酸、内标的质荷比分别为 137. 1→93. 1、
151. 1→ 107. 1、179. 8→ 135. 9 时，各离子对均响
应值较高，而且信号稳定，故作为监测反应离子对
用于定量测定。
乙腈与甲醇相比，其沉淀蛋白效率更高，故本
实验采用 3 倍乙腈蛋白沉淀法后，离心获得纯净的
血浆样品，操作简便，节约样本和处理时间，减少
液体转移步骤，提高了准确性。稀释后，进样与流
动相比例保持一致，增加目标成分检测灵敏度，减
少基质效应干扰，降低离子抑制程度，可满足生物
样品检测要求。
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