全 文 ：·论　　著 ·
　　基金项目:山西省农业科技攻关项目(2008031042)
　　通信作者:谢树莲:Email:xiesl@sxu.edu.cn
林问荆山柰素的薄层鉴别及含量测定
山西大学生命科学学院(030006)　刘计权　谢树莲　蔡　瑾
山 西 中 医 学 院　　　　　尹晓琴
【摘　要】　目的　以山柰素为指标成分 , 对林问荆进行定性鉴别和含量测定。 方法　采用薄层层析法
(TLC)对林问荆中的山柰素进行定性鉴别。采用高效液相色谱法(H PLC)测定山柰素的含量 ,色谱柱为 Hype rsil
C18柱(4.6 mm×250 mm , 5μm);流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(56∶44);检测波长 365 nm;流速 1.0 mL/ min;
柱温为室温。结果　林问荆中山柰素的薄层色谱鉴别特征明显 ,山柰素的进样量在 0.057～ 1.14 μg 范围内呈良
好的线性关系。回归方程为 Y=4 636.2 X-47 562 , r=0.999 9 , 平均回收率为 99.1%, 相对标准偏差(RSD)=
1.7%(n =6)。结论　本方法简单灵敏 , 准确可靠 ,重复性好 , 适用于林问荆中山柰素的定性鉴别和含量测定。
【关键词】　色谱法 , 薄层;　色谱法 , 高压液相;　林问荆;　山柰素
Identification and determination of kaempferol in Equisetum sy lvaticum　LIU J i-quan ＊ , X IE Shu-lian , CA I J in ,
Y IN X iao-qin.＊School of Li f e Science and Technology Shan xi University , Taiyuan 030006 , China
【Abstract】　Objective　To identify and determine Equisetum sy lvaticum by taking kaempfe rol a s the index
composition.Methods　Thin lay er chroma tog raphy (TLC)was used fo r the identification and high-perfo rmance
liquid chroma to g raphy(HPLC)w as adopted for the determination.Chromatog raphic co lumn:Hype rsil C18 col-
umn (4.6 mm×250 mm , 5 μm);mobile phase:methanol-0.4% phosphoric acid(56∶44);flow rate:1.0 mL/ min;
detection waveleng th:365 nm;colum n temperature:ambient tempe rature.Results　The cha racteristic o f TLC
w as distinct.The linea r rela tion of kaempfero l wa s good in the range from 0.057 μg to 1.14 μg.Reg ression equa-
tio n:y=4 636.2X-47 562;r=0.999 9.Ave rage recover y w as 99.1%, and RSD w as 1.7 (n =6).Conclusion
　 This method is simple , rapid , accurate in opera tion and good in repeat.I t is suitable for the identification and
determination o f kaem pfero l in Equisetum sylvaticum.
【Key words】　 Chromatog raphy , thin lay er;　 Chromatog raphy , high pre ssure liquid;　Equisetum
sy lvaticum ;　Kaempfer ol
　　林问荆 Equisetum sy lvaticum L .为木贼科
Equisetaceae多年生药用植物 ,以地上部分入药 ,
具有利尿 、止血 、清热 、止咳之功效[ 1] 。据文献[ 2]
报道 ,木贼科问荆属药用植物问荆中含有多种黄酮
类化合物 ,如山柰素 、槲素 、异槲皮素等 ,这类化合
物既是主要成分 ,又是有效成分[ 3 , 4] 。山柰素属于
黄酮醇类 ,黄色针晶 ,熔点 276 ～ 278 ℃,微溶于水 ,
易溶于甲醇和乙醇。山柰素具有抗菌作用 ,对黄色
葡萄球菌 、绿脓杆菌 、伤寒杆菌及痢疾杆菌均有抑
制作用。但有关林问荆中山柰素的薄层色谱鉴别
和含量测定尚未见报道 。本文采用薄层层析法
(T LC)和高效液相色谱法(HPLC)对林问荆中的
山柰素进行了定性鉴别和含量测定 ,为准确评价林
问荆药材质量提供科学依据。
1　仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪(515 泵 , 2996 紫外检测器)。
山柰素对照品购自中国药品生物制品检定所(含量测定用 ,
批号 110861-200808);甲醇为色谱纯 , 水为双蒸水 , 磷酸
为优级纯 , 其他试剂均为分析纯 。硅胶板购自青岛海洋化
工厂(厚度 0.20 ～ 0.25 mm ,规格 30 mm×100 mm)。材料
采自山西省庞泉沟国家级自然保护区 , 经鉴定为木贼科
Equisetaceae 问荆属 Equisetum 植物林问荆 Equisetum
sy lvaticum L.。
2　定性鉴别
2.1　对照品溶液的制备:取山柰素对照品适量 , 加甲醇制
成 1 mg/ mL 的溶液 ,作为对照品溶液。
2.2　供试品溶液的制备:取林问荆药材粉末(过三号筛)1
g ,加 75%甲醇 25 mL , 盐酸 1 mL ,加热回流 1 h ,滤过 , 滤液
蒸干后残渣加水 10 m L 使溶解 , 用乙酸乙酯提取 3 次 , 每
次 10 mL , 合并乙酸乙酯溶液 , 蒸干 ,残渣加甲醇 1 mL 使溶
解 , 作为供试品溶液。
2.3　薄层鉴别:按照 T LC 试验[ 5] , 吸取供试品溶液 5 μL
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及对照品溶液 2 μL , 分别点于一硅胶 G 薄层板上 , 以环己
烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.4)为展开剂 。展开后取出
晾干 ,喷以 5%三氯化铝乙醇溶液 , 立即置 365 nm 紫外光
灯下检视。供试品色谱中 ,在与对照品色谱相应的位置上 ,
显示相同颜色的荧光斑点(图 1)。
1 、3 、5:山柰素对照品;2 、4 、6:问荆供试品
图 1　山柰素薄层色谱图
3　定量测定
3.1　色谱条件:色谱 Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm , 5
μm);流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(56∶44);检测波长
为 365 nm;流速为 1.0 mL/ min;柱温为室温。
3.2　对照品溶液的制备:精密称取山柰素对照品 2.85
mg , 置 50 mL 容量瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 ,
即得每 mL 含山柰素 0.057 mg 的对照品溶液 , 作为储备
液。
3.3　供试品溶液的制备:精密称取林问荆粉末(过三号筛)
0.75 g ,置于具塞圆底烧瓶中 , 精确加入 75%甲醇 50 mL ,
密塞 ,称定质量 , 加热回流 1 h , 放冷后称定质量 , 用 75%甲
醇补足减少的质量 , 摇匀后滤过 , 精密量取续滤液 20 mL ,
加盐酸 2.5 m L ,置 60 ℃水浴中水解 0.5 h , 水解液于水浴
中蒸干 ,残渣加蒸馏水 10 m L溶解 , 用乙酸乙酯萃取 3 次 ,
每次 10 m L , 合并萃取液 , 水浴挥干溶剂 ,残渣加甲醇溶解
并转移至 2 mL 量瓶中 , 加甲醇定容至刻度 , 摇匀 , 作为供
试品溶液。
3.4　线性关系考察:精密吸取上述储备液 0.5 、1、2 、4 、6、
8 、10 m L分别置于 10 mL 容量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 ,
摇匀:分别吸取 10 μL , 按上述色谱条件测定峰面积 , 以山
柰素进样量(X)为横坐标 , 峰面积积分值(Y)为纵坐标 , 绘
制标准曲线。计算得回归方程为 Y =4 636.2X -47 562 , r
=0.999 9。结果表明 ,山柰素在 0.057 ～ 1.14μg 范围内线
性关系良好。
3.5　精密度试验:精密吸取对照品溶液 10 μL , 按上述色
谱条件测定 , 重复进样 6 次 ,记录所测峰面积的积分值 , 相
对标准偏差(RSD)为 2.3%(n =6), 试验结果表明精密度
良好。
3.6　重复性试验:取林问荆药材 , 按上述供试品溶液制备
方法分别制备 6份供试品溶液 ,精密吸取 10 μL , 按上述色
谱条件测定峰面积积分值 , RSD为 0.5%, 重复性良好。
3.7　稳定性试验:取新制备的同一供试品溶液分别于配制
后室温放置 0 、2 、4 、8 、12 h ,精密吸取 10 μL , 按照上述色谱
条件测定峰面积积分值 , RSD为 1.5%, 结果表明供试品溶
液在 12 h 内稳定性良好。
3.8　回收率试验:精密吸取对照品储备液 7.20 mL ,置 10
m L容量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 即得对照品溶液
(含山柰素 0.040 8 mg/ mL)。 精密称取已知山柰素含量
(0.06 mg/ g)的同批林问荆药材 6 份 , 每份约 0.37 g , 分别
精密加入山柰素对照品的甲醇溶液(0.040 8 mg/m L)0.6
m L ,按上述供试品溶液制备方法制备样品供试液 , 按上述
色谱条件进行测定 , 平均回收率为 99.1%, RSD=1.7%
(n=6)(表 1)。
表 1　回收率试验结果
实验序号 取样量(g) 样品中山柰素量(mg) 加入山柰素量(mg) 测得山柰素总量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%)
1 0.367 2 0.024 6 0.024 5 0.048 6 97.8
2 0.374 3 0.025 1 0.024 5 0.049 1 98.2
3 0.388 6 0.026 0 0.024 5 0.050 1 98.4
4 0.370 9 0.024 9 0.024 5 0.049 9 102.2 99.1 1.7
5 0.375 6 0.025 2 0.024 5 0.049 3 98.6
6 0.364 7 0.024 4 0.024 5 0.048 8 99.4
3.9　样品的含量测定:取林问荆药材 , 依法平行制备供试
品溶液 3 份 ,在上述色谱条件下 , 精密吸取上述对照品溶液
0.040 8 mg/m L与各供试品溶液 10 μL , 进样测定峰面积
积分值 ,计算含量 , 得林问荆中山柰素的平均含量为 0.066
6 mg/ g(n =3)(表 2)。
表 2　林问荆中山柰素的含量测定结果(n =3)
取样量
(g)
山柰素含量
(mg/ g)
平均含量
(mg/ g) RSD(%)
0.7514 0.0665
0.7534 0.0670 0.0666 0.6
0.7509 0.0664
4　讨　　论
为改善林问荆样品 HPLC 色谱峰分离效果 ,
HPLC 测定前尝试将样品过聚酰胺色谱柱进行纯
化 ,结果显示样品峰形均有所改观 ,但待测成分山
柰素含量大幅下降 ,由于已对上样后的聚酰胺色谱
柱进行了充分洗脱 ,故分析山柰素含量下降可能是
由于聚酰胺对山柰素的吸附作用所致 ,因此本次实
验供试品的制备未采用聚酰胺色谱柱进行纯化 。
实验中以不同浓度的甲醇和乙醇为溶剂进行了
提取效果考察 ,结果示 ,采用75%甲醇为溶剂提取较
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完全 ,所测目标成分山柰素含量高。林问荆药材成
分复杂 ,用甲醇作溶剂提取后 ,在主峰前有大量的极
性组分 ,为减小色谱柱的负荷以及其他组分的干扰 ,
故用乙酸乙酯对样品进行萃取 ,并且进行萃取次数
的考察。测定结果表明 ,用乙酸乙酯萃取 3次即可
提取完全 ,第 4次萃取液中未检出山柰素。
本文参考文献[ 6 , 7] ,采用甲醇 0.4%磷酸溶
液为流动相 ,比较了 50∶50 、55∶45 、60∶40 、56∶
44不同比例的流动相 ,结果以甲醇-0.4%磷酸溶
液(56∶44)为流动相时 ,山柰素与其相邻组分的色
谱峰可获得良好分离 。在检测波长选择中 ,山柰素
对照品甲醇溶液经紫外全波长扫描 ,发现在 264.9
nm 和 365 nm 处有两个最大吸收峰 ,但以 365 nm
处峰形及分离效果好 ,故采用 365 nm 作为检测波
长。比较了 0.8 mL/min 和 1.0 mL/min 两种流
速 ,以流速为 1.0 mL/min的效果较好。本研究选
择山柰素为指标成分对林问荆进行定性鉴别和含
量测定 ,方法简便 ,准确可靠 ,重现性好 ,可为林问
荆的质量控制提供参考依据。
参 考 文 献
[ 1] 姚振生.药用植物学.北京:中国中医药出版社, 2007:200-202.
[ 2] 周朵汉 , 于朵敏.木贼种植物化学成分的研究.中药通报 ,
1985 , 10(3):3.
[ 3] 李淑惠 , 靳丹虹.木贼科植物研究概况.中草药 , 2000 , (7):
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[ 4] 佟丽华 ,赵艳.不同产地木贼有效成分的研究.黑龙江中医药 ,
1992 , 35(5):43.
[ 5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部).北
京:中国医药科技出版社 , 2010:附录 34.
[ 6] 吕武清 ,虞金宝 ,宋友晰 ,等.HPLC法测定满山香中山柰素的
含量.中草药 , 2004 , 35(4):457-459.
[ 7] 路玫 ,朵延平 ,蒙大干.反相高效液相色谱法测定苦丁茶含片中
槲皮素和山柰素的含量.时珍国医国药, 2009 , 20(1):119-120.
(收稿日期:2010-08-27)
作者简介:刘计权 , 男 , 1972 年 11 月生 , 讲师 , 山西大学生
命科学学院 , 030006
·病例报告 ·
硬皮病致肺间质纤维化一例
中国人民解放军第 251 医院(075000)　邢　彬
河 北 北 方 学 院　　　　　郓　精
　　患者女 , 34岁 , 因反复胸闷 、呼吸困难 9 个月 ,加重 3 d
于 2010 年 2 月 21 日入院。查体:体温 36.3 ℃, 心率 110
次/ min ,呼吸 24 次/min , 血压 120/ 80 mm H g(1 mm Hg=
0.133 kPa)。双手背皮肤光滑 , 呈蜡黄色 , 口唇轻度发绀 ,
唇周存在放射状沟纹 ,颈静脉无怒张 , 双肺底可闻及细小湿
啰音。心腹部未见明显异常。双下肢无水肿。肺功能提示
限制性肺通气功能障碍。 64 排胸部 CT 示:两下肺粗细不
等的索条状阴影 ,两肺周边呈毛玻璃样 、蜂窝状改变。胃镜
示慢性浅表性胃炎。结合临床症状 、体格检查及胸部 CT
表现 ,初诊为特发性肺间质纤维化 、慢性浅表性胃炎。给予
泼尼松 30 mg , 每日 1 次 , 口服 4 周后 , 改为 15 mg , 每日 1
次 ,口服 8 周后继续减量 , 7.5 mg , 每日 1 次 ,再同时给予环
磷酰胺进行冲击治疗 ,开始剂量为 30 mg/ d ,第 7～ 14 天增
加 25 mg , 直至最大剂量 150 mg/ d。患者胸憋症状有所好
转 ,但皮肤病变进行性加重。 2010 年 7 月全身皮肤较 2 月
份明显发黑 、变硬 , 皮纹消失 ,无法捏起 , 以头面部 、双上肢 、
腹 、背部尤著 , 张口上下齿距一横指 , 舌伸唇外 0.4 cm , 双
手冰凉 ,指关节屈曲畸形 , 双腕 、肘 、肩关节活动明显受限 ,
双下肢轻度浮肿。结合患者现有的症状 、体征诊断为硬皮
病及硬皮病导致的肺间质纤维化 ,进一步查红细胞沉降率 、
球蛋白 、类风湿因子 、自身抗体 、抗核抗体等相关实验室检
查 ,结果示:红细胞沉降率 16.6 mm/1 h ,类风湿因子阳性 ,
抗核抗体阳性 , IgG 17.3 g/ L , IgM 3.6 g/ L , 补体 C3 1 068
mg/ L ,符合硬皮病的诊断。
讨论　硬皮病是一种原因不明的以皮肤 、血管和内脏
器官(包括胃肠道 、肺 、心 、肾等)的纤维化为特征的结缔组
织病。本病呈慢性经过。多发于中青年 ,女性发病率为男
性的 3 倍。按累及范围可分为局限性硬皮病和系统性硬皮
病[ 1] 。前者分片状 、带状和点滴状 3 种 ,尽管不侵犯任何系
统 , 但常能造成残废和毁容 , 是一种自限性皮肤病:后者有
肢端硬皮病和弥漫性硬皮病之分 , 可使人身体部分皮肤硬
化 , 并伴有内脏器官病变 , 以肺 、食管受累较普遍 , 约 68%
的硬皮病患者合并肺部病变 , 以非特异性的 、对称性的肺间
质纤维化最为常见。此型病情重 , 呈进行性。以往认为是
一种胶原性疾患 , 目前认为也系自身免疫性疾病 , 迄今尚无
满意的疗法。在治疗上局限性硬皮病主要是糖皮质激素治
疗 , 系统性硬皮病主要是糖皮质激素和抗硬化治疗。中西
医结合治疗硬皮病 , 虽然取得了一些初步的突破和一定的
疗效 , 但疗程过长并且痊愈和根治还比较困难 , 因此早期诊
断早期治疗将是一个现实的途径。
参 考 文 献
[ 1] 卜素玲.系统性硬皮病的治疗进展.山西医药杂志 , 2004 , 33
(5):409-411.
(收稿日期:2010-09-28)
作者简介:邢彬 ,男 , 1979 年 9 月生 , 主治医师 , 中国人民解
放军第 251 医院 , 075000
·221·山西医药杂志 2011年 3月第 40卷第 3期上半月　Shan xi Med J , March 2011 , Vol 40 , No.3 the Firs t