全 文 ：酶解条件对条斑紫菜单细胞
成活率影响的比较研究
杨　震　唐学玺　戴继勋　沈颂东　宫相忠　贾鹏举
(青岛海洋大学海洋生命学院 ,青岛 , 266003)
摘　要　该文分别选用不同浓度的海螺酶 ;葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、氯化钠 5种渗透剂 ;维
生素 C和甘露醇 2种抗氧化剂 ;对条斑紫菜酶解单细胞的成活率进行了研究。实验结果表明:用浓
度为 10%的海螺酶酶解条斑紫菜 ,成活率最高 ;选用 2mo l / L葡萄糖作渗透剂 ,效果最好 ,成活率达
85. 2% ;加入抗氧化剂对细胞成活率没有影响。
关键词　条斑紫菜 ;酶 ;单细胞 ;成活率 ;抗氧化剂 ;渗透剂
中图法分类号　 Q949. 2; Q813. 1　　　　　文章编号　 1001-1862( 2001) 03-407-04
紫菜是味道鲜美蛋白质含量丰富的海产品 ,也是国内外栽培最多的经济海藻之一。其传统
的育苗方法是春天采集果孢子 ,在室内培养成丝状体 ,到秋天再采集壳孢子育苗 [1, 2 ]。这种方法
培养周期长 ,受季节限制 ,且丝状体易受病害侵袭。 为此国内外在研究如何改进育苗方法上做
了大量工作。李世英等用单孢子育苗法 [3 ] ,赵焕登等用研磨法 [4 ] ,卢澄清等用微生物分解法 [5 ]
分离营养细胞并培养成幼苗。唐延林等 [ 6]、刘万顺等 [12 ]用酶法分离紫菜成功获得紫菜幼苗。其
后 ,国外 Polne-Fuller也有报道 [7 ]。 方宗熙等将紫菜酶解分离应用于育苗 [ 8]。戴继勋等 [9 ]王素
娟等 [ 10]利用条斑紫菜、坛紫菜进行的紫菜体细胞育苗法在生产上的应用获得初步成功 ,为紫
菜的规模化育苗开辟了新的途径。
与传统方法相比 ,酶法育苗周期短 ,不受季节限制 ,且可多茬育苗 [10 ] ,有很好的应用前景。
但目前在大规模生产中仍存在一些问题 ,如酶解后细胞的存活率低和发育成正常苗比例低以
及附苗问题等。本实验拟研究酶解条件对条斑紫菜单细胞成活率的影响 ,以找出合适的酶解条
件 ,为酶法育苗应用于生产提供科学依据。
1　材料与方法
1. 1实验材料
1. 1. 1种菜的采集与冷藏　　条斑紫菜 ( Porphyra yezoens Ueda )采自胶南信阳镇养殖场。 选
择几乎全是营养细胞的幼嫩紫菜。经阴干处理 ,虽紫菜上出现盐霜但仍富有弹性 ,其含水量约
第 31卷　第 3期　
2001年 5月　 　　
青 岛海 洋 大学 学 报
JOU RNAL O F OCEAN UNIV ERSITY OF QINGDAO 　　　　
31( 3): 407～ 410
May, 2001
国家“九五”科技攻关项目 ( 96-Co1-05-01)资助
收稿日期: 2000-07-10;修订日期: 2001-03-08
杨　震 ,男 , 1960年 8月出生 ,工程师。
35%左右时 ,用塑料袋封好 ,速冻保存于- 20℃冰箱中备用。
1. 1. 2酶液　　由海洋生命学院生物化学实验室提供。 酶的制备详见文献 [6]。
1. 2实验方法
1. 2. 1条斑紫菜酶解单细胞的制备　　将经冷冻处理的条斑紫菜放入消毒海水中 ,在温度为
20℃ ,光照为 2 000lx左右进行恢复。 24h后取出。用消毒海水洗刷 3次 ,洗掉表面泥沙。最后
用剪刀将紫菜叶状体剪成 2mm2左右碎片 ,按不同处理酶解 3h。
1. 2. 2不同浓度酶液的配制　　用原酶液与蒸馏水分别配制浓度为 5% , 10% , 15% , 20% ,
40% , 60% , 80% , 100%的酶液 ,分别加入 2mol /L的葡萄糖作渗透剂。
1. 2. 3　 5种渗透剂酶液的配制　　用原酶与蒸馏水配制浓度为 10%的等量酶液 5份 ,分别加
入葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、氯化钠作为渗透剂 ,渗透剂浓度均为 2mol /L。
1. 2. 4抗氧化剂酶液的配制　　用原酶与蒸馏水配制浓度为 10%的等量酶液 11份 , 2mol /L
葡萄糖作渗透剂 ,分 3组。 维生素 C作抗氧化剂为一组 ,设 0. 05g /L, 0. 1 g /L, 0. 2 g /L , 0. 5 g
L
- 1 , 0. 8 g /L 5个浓度梯度 ;甘露醇作抗氧化剂为一组 ,设 0. 05 g /L, 0. 1 g /L, 0. 2 g /L , 0. 5 g
L
- 1
, 0. 8 g /L 5个浓度梯度 ;另设一对照组 ,不加抗氧化剂。用各实验组的酶液将紫菜酶解 3h。
1. 2. 5酶解单细胞的纯化　　酶解后的液体用筛绢过滤 ,滤液经 1 000r /min离心 2min,倒掉
上清液 ,加入消毒海水 ,再悬浮离心 ,如此反复洗涤 3次 ,收集原生质体。
1. 2. 6酶解单细胞的培养　　取收集到的酶解单细胞 ,加消毒海水稀释摇匀 ,使细胞分布均
匀 ,将其注入各培养皿中 ,放在光照培养箱中培养。 温度: 20± 1℃ ,光强: 2 000～ 2 500lx ,光暗
比 12L: 12D。
1. 2. 7成活率计算　　培养 12h后换水一次。 用记号笔在每个培养皿底部点 10个点 ,分别对
应 10个显微镜视野。计细胞数 (单细胞或 2～ 3个细胞形成的细胞团作为一个记数单位 ) ,结果
作本底值。每天进行观察。第 3天 ,再选这 10个视野中星状色素体清晰、颜色为紫红色的细胞
记数 ,所得结果与本底值相比即为成活率。
2　结果与讨论
2. 1酶浓度对条斑紫菜单细胞成活率的影响　　酶解紫菜叶状体制备单细胞是酶法育苗的重
图 1　酶浓度对条斑紫菜细胞成活率的影响
Fig . 1　 Effect o f enzym e
concentration on cell surviva l
要环节之一。 而酶液的浓度不仅关系到细胞解离的
速度 ,而且对酶解后细胞的成活率产生影响。由图 1
可知 ,酶液浓度在 10～ 100%范围内 ,紫菜单细胞成
活率在 10～ 15%时细胞成活率最高。 本实验所用的
海螺酶是从海螺消化组织中提取的复合酶制剂 ,其
成分较复杂 [6 ]。我们认为 ,产生上述结果的主要原因
是复合酶中除含有分解紫菜细胞壁的有效酶之外 ,
还含有活性较高的蛋白酶 ,脂酶 [6 ]等 ,这些酶对原生
质体特别是细胞膜有明显的伤害作用。 酶液的浓度
越高 ,蛋白酶、脂酶的相对含量越高 ,其伤害程度也
越大。酶浓度在 10～ 100%范围内 ,紫菜解离速度没有明显差异 , 3h内叶状体 90%以上的细胞
解离。酶液浓度在 5%时叶状体细胞解离速度明显减慢 , 7h仅有 50%的细胞解离。其成活率最
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低 ,分析可能是酶液浓度的降低 ,有效解壁酶含量减少所致。虽然酶液中蛋白酶、脂酶等酶类含
量降低 ,但其作用时间延长 ,造成其成活率降低。
2. 2抗氧化剂对条斑紫菜单细胞成活率的影响　　在酶解叶状体成单细胞的过程中 ,由于考
虑到复合海螺酶成分的复杂性 ,细胞要受到一定程度的伤害 ,所以选用了常用的抗氧化剂维生
素 C和甘露醇。但从实验结果看 ,它们对酶解单细胞的成活率没有明显影响 (见表 1)。
表 1　不同抗氧化剂对条斑紫菜酶解单细胞成活率的影响
Table 1　 Effect on cell surviv al rate o f different antio xidants
浓　度
Concen t ration
g /L
维生素 C　 Vitamin C 甘露醇　 Manni tol
细胞总数
Cell totali ty
活细胞数
Living cell t otali ty
成活率%
Survival rate
细胞总数
Cell totali ty
活细胞数
Living cell t otali ty
成活率%
Su rvival rate
0. 05 725 476 65. 7 689 429 62. 4
0. 1 702 473 67. 5 713 488 68. 4
0. 2 731 502 68. 7 714 483 67. 6
0. 5 698 476 68. 2. 745 489 65. 7
0. 8 715 475 66. 5 702 459 65. 4
对照
comparison
731 503 68. 9 731 503 68. 9
2. 3几种渗透剂对条斑紫菜单细胞成活率的影响　　由于细胞壁对细胞有良好的保护作用 ,
酶解祛除细胞壁后 ,如果溶液中的渗透压与细胞内的渗透压不同 ,原生质体就可能涨破或收
缩 [10 ]。因此 ,需加入渗透剂以维持溶液中的渗透压与细胞内的渗透压大致相等。基于上述考
虑 ,我们在酶解紫菜时加入了葡萄糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、氯化钠 5种渗透剂 ,以选择最佳的
渗透剂。首先 1～ 2. 5mol /L的范围内作预备实验 ,找出使用以上 5种渗透剂的合适浓度均在
2mol /L左右。由表 2可知 ,葡萄糖作渗透剂时 ,紫菜酶解单细胞的成活率最高 ,山梨醇、甘露醇
次之 ,蔗糖、氯化钠最差。我们认为葡萄糖、山梨醇、甘露醇均可作为紫菜酶解的渗透剂 ,但在生
产上应用既要使用效果 ,又要考虑成本 ,选用葡萄糖最为理想。
表 2　几种渗透剂对紫菜酶解单细胞成活率的影响比较
Table 2　 Effect on cell surv iv al rate o f different penetrants
渗透剂
Penetrant
葡萄糖
Glucos e
山梨醇
Sorbitol
甘露醇
Manni tol
蔗糖
Saccharoe
氯化钠
Salt
细胞总数
Cell totali t y
764 682 730 654 621
成活细胞数
Living cell totali t y
651 520 541 393 265
成活率
Su rvival rate
85. 2% 76. 3% 74. 2% 60. 1% 42. 7%
4093期 杨　震 ,等:酶解条件对条斑紫菜单细胞成活率影响的比较研究
3　小结
紫菜酶法育苗尽管有其十分广阔的应用前景 ,但大规模生产还受到某些因素的影响 ,提高
紫菜单细胞成活率就是其中之一 ,而单细胞成活率又和种菜的质量、酶解条件、培养条件等有
关。酶解条件是酶法育苗中非常重要的一环。我们通过对酶解条件的研究认为:选择 10%的海
螺原酶、 2mol /L的葡萄糖作渗透剂来解离紫菜 ,可以使单细胞成活率大幅度提高。
参考文献
1　中国科学院海洋研究所藻类实验生态组、藻类分类形态组编 . 条斑紫菜的人工养植 . [M ]北京:科学出版社 ,
1978. 126～ 127
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3　李世英 ,崔广法 . 条斑紫菜单孢子和壳孢子幼苗生长发育的初步观察 . [ J]海洋与湖沼 , 1980, 11( 4) , 370～ 37
4　赵焕登 ,张学成 .条斑紫菜营养细胞的分离与培养 . [ J]山东海洋学院学报 , 1981, 11( 1): 61～ 65
5　卢澄清 .紫菜叶状体营养细胞的研究Ⅰ . [C ] 1979年第一届中国藻类学术讨论会论文集 ,北京:科学出版社 , 1983.
45～ 55
6　唐延林 .紫菜营养细胞和原生质体的分离与培养 . [ J]山东海洋学院学报 , 1982, 12( 4): 37～ 50
7　M. Poln e-Fuller. Veg etative propagagation of porphyra perforata. . [ J] Hyd robiologia, 1984. 116 /117: 308～ 313
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47
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10　王素娟 ,张小平 ,徐志东 ,等 .坛紫菜营养细胞和原生质体培养研究Ⅱ .直接育苗下海养殖的实验研究 . [ J ]海洋科
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12　 Liu Wan shun , Tang Yanlin. Studies on th e p reparation and on the properties of sea snai l enzym es. [ J] Hyd robi-
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Effects of Different Enzymalysis Conditions on the Survival
Rate of Single -cells of Porphyra yezoens Ueda
Yang Zhen　 Tang Xuexi　 Dai Jixun　 Shen Songdong　 Gong Xiang zhong　 Jia Peng ju
(College of Marine Li fe Sciences , Ocean University of Qingdao, Qingdao, 266003)
Abstract　 Effects o f dif ferent enzymalysis conditions on the surv iv al rate of sing le-cel ls
of Porphy ra ye zoensis Ueda have been studied. The main results a re: 1. The ef fectiv e-
ness o f enzyme was posi tiv ely cor related to enzyme concentration. When the enzyme
concentration w as 10% the resul t w as the best. 2. Dif ferent penet rants show ed dif ferent
effects on cell surv iv al rate. Among 5 kinds of penet rants, Glucose w as the best.
3. Antioxidants had no ef fect on the cell surviv al ra te.
Key words　 Porphyra yezoensis Ueda; enzyme; surviv al rate; penetrants; antioxidants
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