全 文 ：中国农学通报 2015,31(28):112-116
Chinese Agricultural Science Bulletin
甜叶菊同源四倍体与二倍体基因组差异分析
李雅婷，王红娟，向增旭
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：为探究甜叶菊二倍体经染色体加倍后得到四倍体的过程中，基因组序列的变化情况，采用 ISSR
分子标记技术对1个甜叶菊二倍体及其5个同源四倍体株系的遗传差异进行分析。ISSR结果显示：从
60个 ISSR引物中筛选出多态性强、重复性好的5个引物进行扩增，共扩增出34条谱带，其中有19条呈
多态性，多态性占55.88%；6个甜叶菊株系间Neis基因多样性指数范围在0.0059~0.2778之间；利用聚类
分析，发现CK与5个四倍体最先分开，这说明聚类分析可以很好的将甜叶菊二倍体和同源四倍体区分
开，1和2、4和5两两株系最先聚在一起，这表明2组株系各自间遗传相似度高。甜叶菊不同倍性间遗传
差异较大，同一倍性不同株系间也存在一定的遗传差异。
关键词：甜叶菊；同源四倍体；ISSR；基因组差异
中图分类号：S566.9 文献标志码：A 论文编号：casb15030034
Analysis of Genetic Variation in Autotetraploid and Diploid Stevia rebaudiana Bertoni
Li Yating,Wang Hongjuan, Xiang Zengxu
(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)
Abstract: In order to research the changes of genomic sequence after Stevia rebaudiana Bertoni diploid
chromosome doubling, ISSR molecular marker technique was used to analyze the genetic variation between 1
diploids and 5 autotetraploids of Stevia rebaudiana Bertoni. 5 primers with good polymorphic and steady bands
were selected from 60 ISSR primers, and 34 bands were amplified totally. 19 of 34 bands were polymorphic,
the polymorphic rate was 55.88% . The genetic diversity index were 0.0059-0.2778 in 6 Stevia rebaudiana
Bertoni lines. The UPGMA dendrogram showed that CK and 5 tetraploids separated firstly, which explaining
that Stevia rebaudiana Bertoni diploids and autotetraploids were separated well by cluster analysis. 1 and 2
lines, 4 and 5 lines clustered together firstly, which indicating that the genetic similarity coefficient of the two
groups were high. There was significant genetic variation between autotetraploid and diploid of Stevia
rebaudiana Bertoni, and different lines with the same ploidy also had genetic variation.
Key words: Stevia rebaudiana Bertoni; autotetraploids; ISSR; genetic variation
0 引言
甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科多年生
草本糖料作物，它所含有的甜菊糖甙的甜度是蔗糖的
250~300倍，但所含热量只是蔗糖的 1/300[1-2]。目前已
替代糖精在食品、医药等工业中广泛应用，并被国际上
誉为“世界第三健康糖源”[3-5]。甜叶菊多倍体育种技术
在国内已有一些报道[6-8]，但关于甜叶菊四倍体分子遗
传机制的研究鲜有报道，为此探讨亲本及其同源四倍
体材料的DNA遗传结构差异极为重要。ISSR(inter-
simple sequence repeat)是 1994 年 Zietkiewicz 等 [9]由
SSR(simple sequence repeat)发展而来的，由于其稳定
性好、多态性高、适用范围广、易操作，结合位点丰富，
基金项目：中央高校基本科研业务费基金项目“江淮分水岭项目”(YZ201210)。
第一作者简介：李雅婷，女，1989年出生，在读硕士，主要从事药用植物育种技术研究。通信地址：210095江苏省南京市卫岗1号南京农业大学园艺
学院，E-mail：2013804181@njau.edu.cn。
通讯作者：向增旭，男，1972年出生，甘肃张掖人，副教授，博士研究生，主要从事药用植物育种技术研究。通信地址：210095江苏省南京市卫岗1号
南京农业大学园艺学院，E-mail：zxxiang@njau.edu.cn。
收稿日期：2015-03-03，修回日期：2015-04-20。
李雅婷等：甜叶菊同源四倍体与二倍体基因组差异分析
已广泛应用植物遗传多样性、分子鉴定、辅助育种、物
种分类与物种进化关系等研究中[10-13]。韦荣昌等[14]利
用 ISSR分析多倍体无籽果及其亲本遗传背景发现，子
代与亲本相似的遗传现象。王小平等[15]、赵卫国等[16]、
段英姿等[17]利用 ISSR技术分别对四倍体刺梨、桑树、
菘蓝等的遗传差异进行研究，发现同源四倍体与其亲
本之间存在较大的遗传差异。本研究采用 ISSR分子
标记技术，从DNA分子水平上分析甜叶菊二倍体与其
同源四倍体遗传结构的差异，为多倍体和突变体的鉴
定提供一种新方法，并为深入探讨甜叶菊多倍体育种
遗传规律奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选取生长期一致的甜叶菊同源四倍体及其二倍体
试管苗共6份，同源四倍体甜叶菊试管苗5份（编号为：
1、2、3、4、5），二倍体甜叶菊作为对照(CK)，本试验于
2014年9月在南京农业大学园艺学院中药系进行。
1.2 方法
1.2.1 ISSR分析 采用改良的CTAB法[18]提取6个甜叶菊
样品叶片的总DNA，首先随机选择4(CK、1、3、4)个样品
的DNA对60个 ISSR引物进行了3次筛选，选出5个扩
增反应稳定，条带清晰，多态性强的引物，用于所有样品
的扩增。PCR反应体系 20 μL：10×Buffer 2 μL，MgCl2
1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq酶 0.5 U，ISSR引物
0.2 μmol/L，DNA模板为 20 ng，ddH2O补足至 20 μL。
扩增程序：94℃预变性4 min；35个循环（94℃变性30 s，
52℃退火 30 s，72℃延伸 2 min），72℃延伸 10 min。扩
增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测[19]。
1.2.2 数据统计和分析 PCR扩增产物按照同一迁移
位置对 ISSR条带的有无进行统计。有带记为 1，无带
记为 0，建立二元数据矩阵。利用NTSYS-PC2.1软件
计算各材料间相似系数，并且按照遗传距离进行
UPGMA聚类分析。
2 结果与分析
2.1 多态性分析
利用5个 ISSR引物对1个甜叶菊二倍体及5个同
源四倍样品体进行扩增，6个样品共扩增34条DNA片
段，平均每个引物扩增出6.8条，其中19个位点的片段
具有多态性，多态性位点百分比为 55.88%，各多态性
引物中，引物P10多态性比率最高达到100%，引物P12
多态性比率最低为14.28%，从表1中可以看出，各引物
的多态性比率集中在 14.28%~100%，说明 1个甜叶菊
二倍体与5个同源四倍体株系间具有较高的遗传差异
性。图1为多态性引物的扩增结果。
引物
P10
P12
P24
P29
P32
总计
序列(5-3)
(GACA)4
G(AC)8
(GT)8YG
(GGGTG)3
(AG)8YG
扩增条带
6
7
9
5
7
34
多态性条带
6
1
8
3
1
19
多态性百分比/%
100.00
14.28
88.89
60.00
14.29
55.88
表1 ISSR扩增引物和多态性
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
A B
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2.2 遗传多样性分析
通过对 6个株系遗传参数进行计算，结果表明，6
个甜叶菊株系平均观察等位基因数为 1.5262，平均有
效等位基因数为1.3273，平均Neis基因多样性指数为
0.1901，平均Shannon指数为0.2836。有效等位基因数
变化范围相对较大，为1.0240~1.7720，但平均数较低，
Neis基因多样性指数范围在 0.0059~0.2778，Shannon
指数范围为 0.0068~0.2860，表明 6个甜叶菊株系种间
存在较大的遗传多样性变异（表2）。
2.3 聚类分析
利用19条多态性条带，计算出6个样品两两之间
的遗传相似性系数并进行聚类分析（表 2，图 2）。6个
甜叶菊株系间相似性系数为0.5000~0.9412，可看出其
变化范围较大，说明这些株系间存在着显著的遗传差
异。其中1和2，4和5两两株系间的相似性系数最高，
为 0.4912。即遗传距离最近；CK与 1 2个株系间相似
系数最低。6份材料可分为两大组（图2），第1组为甜
叶菊二倍体CK，第2组为甜叶菊同源四倍株系1、2、3、
A：P10；B：P24；C：P32；D：P12；CK：二倍体；1~5：四倍体
图1 不同引物的 ISSR扩增结果
CK
1
2
3
4
5
CK
1
0.5000
0.5588
0.5588
0.7059
0.6471
1
1
0.9412
0.8824
0.7941
0.7941
2
1
0.8235
0.8529
0.8529
3
1
0.8529
0.9118
4
1
0.9412
5
1
表2 6个株系间的遗传相似系数
4、5。甜叶菊同源四倍体株系1和2，4和5最先分别聚
在一起，四倍体株系3和二倍体株系CK各单独一支。
3 结论
利用 ISSR标记对 6个株系的甜叶菊进行了分子
水平的遗传差异分析，发现扩增出的 34条谱带，
55.88%发生了多态性变化。6个甜叶菊株系可分为 2
个群组，1组为甜叶菊二倍体，1组为甜叶菊四倍体群，
表明甜叶菊二倍体与其同源四倍体间存在丰富的遗传
多样性。但同一倍性的甜叶菊不同株系间遗传距离较
大。结果表明，甜叶菊不同倍性的株系间有较高的遗
传多样性，而同一倍性不同株系间也存在一定的遗传
差异。
4 讨论
本试验利用 ISSR技术对选取的 5个同源四倍体
及其相应的二倍体甜叶菊株系进行遗传差异分析，结
果表明，同源四倍体与二倍体间多态性范围在14.28%
~100%，平均多态性位点占55.88%，多态性比例较大，
这一结论与段英姿等[17]和赵卫国等[16]的遗传多态性相
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
C D
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李雅婷等：甜叶菊同源四倍体与二倍体基因组差异分析
近；6个甜叶菊品种间有效等位基因数介于 1.0240~
1.7720，Neis基因多样性介于在0.0059~0.2778，遗传相
似系数介于 0.5000~0.9412，这与丽穗凤梨[20]、甘薯[21]、
南方葡萄[22]等相当，揭示了甜叶菊二倍体与同源四倍
体株系间较为丰富的遗传多样性；从聚类分析看，以遗
传相似性系数 0.59为标准，将 6个甜叶菊品种分为两
大类，第1类为甜叶菊二倍体，第2类为四倍体，第2类
又分为 2组，其中 1和 2 2个株系，4和 5 2个株系各自
最先聚在一起，这就说明，甜叶菊不同倍性间存在着遗
传差异，同一倍性不同株系间也存在较大的遗传差异，
这与王卓伟等[23]研究结果相似。
本研究中，甜叶菊经诱变获得的同源四倍体多态
性较高，表明DNA碱基序列发生了较大的改变，这是
因为植物在多倍化过程中，基因组因加倍而引起冲击
和核质平衡的重新确立[24]，或是由于同源四倍体的等
位基因发生漂移，基因组DNA表现出多态性[25]。聚类
分析及遗传差异研究表明，同一倍性间遗传差异较大，
这是因为四倍体甜叶菊在加倍过程中，基因组DNA核
苷酸序列产生了可与引物结合的新位点，扩增生成大
小和结构不一的差异片段[26]。关于这些差异片段是如
何改变的，具体受哪些因素的影响，还有待进一步
研究。
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??Coeficient0.59 0.68 0.77 0.85 0.94
CK
CK
1
2
3
4
5
图2 6个株系的UPGMA聚类图
系数
CK
1
2
3
4
5
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