全 文 ：2016年9月第22卷第17期 September.2016 Vol.22 No.17
*基金项目：浙江医药高等专科学校校级课题（ZPCSR2014009）
木槿（Hibiscus syriacus L.），别名朝开暮落花、篱障花。
属锦葵科木槿属，落叶灌木或小乔木，除具有绿化、观赏、经
济和食用价值外，还具有较高的药用价值，木槿叶味苦，性
寒，具有清热凉血，解毒消肿的功效，主治赤白痢疾、肠风、痈
肿疮毒等症 [1-2]。木槿叶中含有多种黄酮类化合物，如：山奈
酚、异牡荆素、牡荆素、芹菜素、芦丁等[3]，植物类黄酮具有清
除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等抗氧化能
力，在医药、食品领域应用越来越广泛[4-5]。本文在蒋新龙等木
槿花花叶总黄酮的提取和含量测定[6]的基础上，通过单因素
试验和正交试验，具体探讨了木槿叶中黄酮类化合物的最佳
提取工艺，对其醇提取物的抗氧化活性进行了探究，以期为
木槿叶的开发和综合利用提供理论依据。
1 材 料
1.1 实验原料 新鲜木槿叶采自浙江省宁波市内，由中药专
业王和平教授鉴定为锦葵科植物木槿Hibiscus syriacus L.的
叶，将鲜叶去杂处理，清水清洗，蒸馏水漂洗2～3次并沥干水
分，（60±1）℃鼓风干燥24 h，冷却后粉碎备用。
1.2 主要试剂 芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批
号：100080-200707，纯度>98%），DPPH购自sigma公司，乙醇、
石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，亚硝酸钠、硝酸铝、氢
氧化钠均为分析纯。
1.3 实验仪器 DHG-9070A烘干箱：宁波江南仪器厂；JFSD-
100粉碎机：北京环亚天元机械技术有限公司；旋转蒸发仪
RE-52：上海亚荣生化仪器厂；UV-1240紫外可见分光光度
计：日本岛津公司；数显恒温水浴锅HH-2：国华电器有限公
司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
2 方 法
2.1 总黄酮提取工艺研究
2.1.1 标准曲线的绘制 精密称取105℃减压干燥至恒重的
木槿叶总黄酮提取工艺
及其抗氧化活性研究*
陈 磊，孙崇鲁
（浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100）
[摘要] 目的：研究木槿叶总黄酮的提取工艺及其抗氧化活性。方法：通过单因素试验和正交试验，确定木
槿叶总黄酮的提取工艺，并通过测定木槿叶不同极性部位提取物对DPPH自由基的清除率，评价其抗氧化活性
能力。结果：木槿叶总黄酮最佳提取条件是：70%乙醇，料液比为1∶30，提取时间为3 h，提取温度为55 ℃。抗氧化
活性结果显示不同部位的提取物对DPPH自由基均有一定的清除能力，且随浓度的增加而增强。结论：木槿叶
总黄酮具有较好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯极性部位效果最强。
[关键词] 木槿叶；总黄酮；提取工艺；抗氧化性
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X（2016）17-0049-02
Extraction and Antioxidant Property of Total Flavonoids
from Hibiscus Leaves
CHEN Lei, SUN Chong-lu
(Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo Zhejiang 315100, China)
[Abstract] Objective: To study the extraction technology and antioxidant property of total flavonoids from
Hibiscus leaves. Methods: The proper condition was determined by single-factor test and orthogonal experiment.
And antioxidative activity of the extract was evaluated by DPPH scavenging activity of different fracions from
hibiscus. Results: It was found that the highest extraction conditions were 70 % eheanol, solid- liquid ratio
1∶30, and 3.0 hours immerge extract at 55 ℃ . DPPH radical scavenging experiment showed that the different
polarities extract possessed certain scavenging activity to DPPH, and the scavenging activity increased with the
increasing concentration. Conclusion: The flavonoids from Hibiscus leaves show good antioxidant activities. And
the ethyl acetate parts showed the strongest effect.
[Keywords] Hibiscus leaves; total flavones; extraction; antioxidant property
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2016.17.016
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芦丁对照品20.00 mg，用95%乙醇溶解，再用30%乙醇定容到
100 mL容量瓶中，得到浓度为0.20 mg/mL的标准溶液。
精密吸取芦丁标准溶液0.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mL
分别置于50 mL的容量瓶中，用60%乙醇补充至20 mL，然后加
入1 mL的5 %NaNO2，摇匀，放置6 min，再加入1 mL的10%
Al（NO3）3，摇匀，放置6 min，最后加入10 mL的1 mol/mL NaOH，
用60%乙醇定容到50 mL容量瓶后摇匀，放置15 min。以第1
个为空白，于510 nm测吸光度（A）。以浓度(C)为横坐标，吸光
度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
2.1.2 木槿叶总黄酮的提取及提取率的计算 称取一定量
的木槿叶粉，按一定的料液比加入乙醇溶液，在恒温水浴中
加入回流提取，趁热过滤，定容到50 mL容量瓶中，即为待测
样品液。精密吸取4 mL待测样品液于50 mL容量瓶中，平行3
管，按绘制标准曲线的方法显色，在510 nm处，按照2.1.1的方
法测定吸光度后，带入标准曲线方程计算，得出样品总黄酮
含量。
木槿叶总黄酮的提取率按一下公式计算：提取率（%）=
（V×50×C×10-3×100）/4m
V：提取液定容体积（mL），C：测定液的黄酮含量（mg/mL），
m：木槿叶重量（g）。
2.1.3 单因素试验 分别研究乙醇浓度、料液比（原料质量：
溶剂体积，g/mL）、提取温度、提取时间对木槿叶总黄酮含量
的影响
2.1.4 正交试验设计 根据单因素试验结果，选择乙醇浓
度、料液比、提取温度、提取时间为考察因素，以测得的木槿
叶样品中总黄酮得率为考察指标，采用L9（34）进行正交试验。
筛选提取木槿叶总黄酮的最佳提取工艺参数。因素水平表见
表1。
2.1.5 重现性试验 准确试验称量1.0 g木槿叶粉末5份，在
最佳提取工艺条件下进行5次平行试验，按照“2.1.2”的方法
进行样品总黄酮含量的测定。
2.2 木槿叶抗氧化活性研究
2.2.1 木槿叶不同极性萃取部位的制备 取木槿叶粉末
20 g，于55℃条件下加入70%乙醇（料液的质量与体积比是1：
30），回流提取3 h，过滤。滤渣按上述条件重复提取2次，将3次
得到的滤液在50 ℃下减压浓缩得到木槿叶的提取物。提取物
用水打散，按极性由小到大顺序依次用石油醚、三氯甲烷、乙
酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别回收溶剂得到石油醚、三氯甲
烷、乙酸乙酯、正丁醇和水5个化学部位。挥干溶剂，称定浸膏
重量。
2.2.2 不同极性部位样品溶液的制备 根据不同极性部位
所得物的重量，分别用70%乙醇溶解、摇匀、定容，得到浓度为
10 mg/mL各各提取物溶液，避光保存备用。
2.2.3 木槿叶不同极性部位清除DPPH自由基活性的方法
参照文献[7]的方法，分别量取不同极性部位样品溶液各10、
20、30、40、50 μl，量取浓度为25 μg/mL的DPPH溶液至2 mL，摇
匀，室温下避光静置15 min后在517 nm波长处测吸光值。通过
下式计算对DPPH的清除率。
DPPH清除率（%）=[1-A1/A0] ×100%
式中：A0为未加试样的DPPH溶液在517 nm处的吸光度
值；A1为抗氧化性物质与DPPH反应后在517 nm处的吸光度值。
3 结 果
3.1 芦丁标准曲线 用最小二乘法作线性回归，结果表明在
0.016~0.080 mg/mL的浓度范围内，吸光度值与浓度呈良好的
线性关系。（见图1）
图 1 芦丁标准曲线
3.2 总黄酮提取的单因素试验
3.2.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 乙醇有较好的溶解
性能，对植物细胞的穿透能力强。亲水性的成分除蛋白质、
淀粉、黏液质、果胶和部分多糖等外，大多都能溶解在乙醇
中。不管是游离的苷元还是苷，黄酮类化合物均易溶于乙醇
溶液中。因此，总黄酮的提取一般用有机溶剂乙醇提取 [8]。在
60 ℃、1 ∶25（g/mL）条件下，用35%、45%、55%、65%、75%、
85%、95%浓度的乙醇溶液回流提取2 h。随着乙醇浓度的升
高，总黄酮的得率增加，但当乙醇浓度超过65%以后得率反而
下降。造成这种现象的原因可能是乙醇浓度过大时，水溶性
的黄酮类化合物溶出减少而脂溶性杂质如鞣质、色素等溶出
增多，由于杂质与脂溶性黄酮类化合物竞争溶剂，从而使总
黄酮得率下降[9]。因此选定乙醇浓度为65%。（见图2）
图 2 乙醇浓度对总黄酮得率的影响
3.2.2 浸提温度对总黄酮得率的影响 温度越高，分子运动
越剧烈，渗透、扩散、溶解速度加快，同时，高温可以引起细胞
膜结构的变化，使黄酮类化合物容易转移到溶剂中，因此，随
提取温度的升高，黄酮类化合物的得率也升高 [10]。在65%乙
醇、料液比为1∶25（g/mL）的条件下，选择30 ℃、40 ℃、50 ℃、
60 ℃、70 ℃、80 ℃的温度进行回流提取2 h。随着温度的升高，
提取液中总黄酮含量增加，当温度超过60 ℃后，黄酮的总得
率下降，且提取液颜色呈现明显的黄褐色。这可能是因为过
高温度引起木槿叶黄酮类化合物结构被氧化破坏，同时其它
更多的杂质被提取出来，不利于进一步分离纯化 [11]。此外，当
温度超过溶剂沸点时，容易造成溶剂的损失，这也会导致得
率的下降。因此，选择提取温度为60℃。（见图3）
3.2.3 浸提时间对总黄酮得率的影响 在60 ℃、65%浓度的
乙醇、料液比为1：25（g/mL）的条件下，选择1、1.5、2、2.5、3、3.5、
4 h的时间进行回流提取。在2.5 h条件下，黄酮的得率最高。
浓度（mg/mL）
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因此选择提取时间为2.5 h。（见图4）
图 3 提取温度对总黄酮得率的影响
图 4 提取时间对总黄酮得率的影响
3.2.4 料液比对总黄酮得率的影响 在60 ℃、65%乙醇条件
下，选择1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）的料液比
回流提取2 h。选择1∶30左右为最佳料液比，过少的溶剂不能
充分提取木槿叶中的总黄酮，而过多的溶剂则会造成浪费，且对
后续的浓缩带来困难。因此选择料液比为1∶30。（见图5）
图 5 料液比对总黄酮得率的影响
3.3 黄酮提取最佳条件的确定 根据单因素试验结果，确定
以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）提取温度（D）为4
因素，每因素3水平，按表1进行L9（34）正交试验，计算黄酮的
提取率结果。
根据表2正交试验极差分析可见，考察的4因素对黄酮得
率的影响从大到小依次是：提取温度﹥提取时间﹥乙醇浓度
﹥料液比；根据正交试验的结果，从木槿叶中提取总黄酮类
化合物的最佳条件为A3B2C3D1，即乙醇浓度为70%，料液比为
1∶30，提取时间为3 h，提取温度为55℃。（见表1-2）
3.4 重复性试验 按选定的A3B2C3D1条件进行5次平行试验。
由此可知，在此工艺条件提取木槿叶总黄酮，相对标准偏差
小，结果重复性良好，工艺稳定可行。（见表3）
表 1 木槿叶总黄酮提取工艺因素水平表
水平 乙醇浓度(%) 料液比(g/mL) 提取时间(h) 提取温度(℃)
1 60 1∶25 2 55
2 65 1∶30 2.5 60
3 70 1∶35 3 65
表 2 正交试验结果
实验号 乙醇浓度(%) 料液比(g/mL) 提取时间（h） 提取温度(℃) 吸光度值(A) 得率（%）
1 1 1 1 1 0.419 1.25
2 1 2 2 2 0.435 1.29
3 1 3 3 3 0.415 1.23
4 2 1 2 3 0.357 1.06
5 2 2 3 1 0.458 1.36
6 2 3 1 2 0.370 1.10
7 3 1 3 2 0.449 1.33
8 3 2 1 3 0.348 1.14
9 3 3 2 1 0.484 1.44
K1 3.77 3.643.49 4.05
K2 3.52 3.793.79 3.72
K3 3.91 3.773.92 3.43
R 0.39 0.150.43 0.62
表 3 重复性试验结果 （%）
指标 1 2 3 4 5
得率 1.48 1.50 1.49 1.50 1.47
3.5 木槿叶不同极性部位对DPPH自由基的清除能力 在体
外抗氧化活性研究中，最常见的是DPPH自由基的清除，其原
理是DPPH在溶液中生成一种稳定的以氮为中心的自由基，
且溶液呈紫色，在517 nm波长处有特征吸收峰，当DPPH溶液
中加入抗氧化物质时，抗氧化物质将电子和质子传递给
DPPH自由基，生成稳定的分子态DPPH2，从而使DPPH溶液紫
色消退，吸光谱强度随加入的抗氧化物质的量的增加而减
小。因此，加入被测样品后，被测样品清除DPPH自由基而引
起吸光度值的减少，通过计算自由基清除率，可评价其抗氧
化能力的强弱[12]。木槿叶提取物的不同极性部位清除DPPH自
由基的能力随浓度的增加而增大，其中乙酸乙酯部位对
DPPH自由基的清除作用最强，正丁醇部位次之。浓度为0.25
mg/mL时，不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力由大到小依
次为：乙酸乙酯﹥正丁醇﹥总提取物﹥水﹥石油醚﹥三氯甲
烷。浓度为0.25 mg/mL时，乙酸乙酯、正丁醇、总提取物、水、石
油醚、三氯甲烷提取物清除DPPH自由基能力分别为67.81%、
54.29%、43.78%、41.14%、37.91%、36.76%。（见图6）
图 6 木槿叶不同极性部位清除DPPH自由基能力的测定结果
4 讨 论
以乙醇为溶剂，木槿叶总黄酮提取率为考察指标，通过
单因素和正交试验，得出木槿叶总黄酮最佳提取工艺条件
是：乙醇溶液作为70%，料液比为1∶30，提取时间为3 h，提取温
度为55 ℃。此工艺操作简单，条件易于控制，重复性好，提取
效率高，提取溶剂无毒性且易于回收，本研究为木槿叶总黄
料液比（g/mL）
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表 4 方差分析
因素 Ⅲ型平方和 自由度 均方 F值 Sig.
A 0.011 2 0.005 0.497 0.617
B 0.022 2 0.011 1.018 0.381
C 0.004 2 0.002 0.176 0.840
D 0.230 2 0.115 10.868 0.001
误差 0.190 18 0.011
根据直观分析与方差分析结果，可知消肿止痛中药复方
提取工艺影响因素顺序为D>B>A>C，即乙醇浓度>回流时间>
乙醇用量>提取次数，其中乙醇浓度具有显著性影响；最佳提
取工艺为A2B3C3D3，即10倍量90%乙醇提取3次，每次120 min。
2.3 验证试验 准确称取处方用量的药材粗粉3份，按照2.2
项下所得最佳提取工艺条件提取，进行验证试验。（见表5）
表 5 验证试验结果
序号 大黄素（mg/g） x（mg/g） RSD（%）
1 1.914
2 1.837 1.883 2.176
3 1.898
3 结 论
3.1 供试品溶液制备方法选择 大黄含有游离型和结合型
两种蒽醌成分，其中大黄素为游离型蒽醌，因此需采用酸水
解的方法将结合型蒽醌转化为游离型蒽醌，进而测定其含
量。根据药典 [1]和孙新建等 [2]的研究，发现8%浓度的盐酸溶
液效果最好。且进一步实验考察发现增加盐酸溶液的加入量，
对供试品中大黄素的含量无明显影响，说明10 mL8%的盐酸
溶液足以将苷键充分水解。
3.2 流动相的选择 参考《中国药典》[1]及文献方法[3-6]，考察
了甲醇、乙腈、水、磷酸等多种流动相体系，发现甲醇-磷酸体
系峰型较好且保留时间合适；考察磷酸浓度发现，0.1%磷酸
分离度优于纯水相，0.2%磷酸与0.1%磷酸无显著区别，由此
选择0.1%磷酸溶液；调整甲醇-0.1%磷酸溶液不同配比，最终
选择流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（76:24），其分离效果好，峰
型对称且保留时间适宜。
根据文献[7-8]与光谱扫描结果，大黄素有4个主要吸收峰，
通常选择254 nm为检测波长，但实验表明254 nm时阴性对照品
存在干扰，由此考察其他波长下结果，发现在438 nm时可排除
干扰，且灵敏度达到定量要求，因此将438 nm设定为检测波长。
消肿止痛中药复方由正交试验得到了最佳提取工艺条
件，但从方差分析结果可知，提取工艺影响因素顺序为乙醇
浓度>回流时间>乙醇用量>提取次数，其中仅乙醇浓度具有
显著性影响，因此，可根据实际生产条件和经济成本考虑，对
提取工艺作适当调整，保证提取效果的同时简化工艺。
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（收稿日期：2016-02-01 编辑：李海洋）
酮类物质的开发利用提供参考。
抗氧化活性实验以木槿叶为原料，用回流提取获得木槿
叶乙醇提取物，分别采用4种不同极性溶剂（石油醚、氯仿、乙
酸乙酯和正丁醇）萃取木槿叶提取物，获得石油醚相、氯仿
相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相5个不同极性部位，测定总
提取物和不同极性部位提取物对DPPH自由基的清除率。结
果表明，木槿叶不同极性部位提取物对DPPH自由基均有清
除作用，且随浓度的增加而增强，其中乙酸乙酯极性部位效
果最强。木槿叶提取物清除DPPH自由基的能力，为开发天然
抗氧化剂提供理论参考，同时也有利于更好的开发利用木槿。
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（收稿日期：2015-09-22 编辑：李海洋）
（上接第48页）
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