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裂褶菌多糖的研究进展



全 文 :食用菌学报2016.23(2):88~93
收稿日期:2016-02-24原稿;2016-06-05修改稿
基金项目:国家科技支撑计划项目(2013BAD16B05)、广东省农业攻关项目(2012A020100010)、广东省重点实验室
建设支撑项目(2013A061402008)和广州市科技计划项目(201508020095)资助
作者简介:贺 凤(1987-),男,硕士,研究助理,主要从事微生物代谢产物研究。
*本文通讯作者 E-mail:hhp201@126.com
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2016.02.018
裂褶菌多糖的研究进展
贺 凤,黄龙花,刘远超,李诚斌,胡惠萍*
(广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室省部
共建华南应用微生物国家重点实验室,广东广州510070;广东粤微食用菌技术有限公司,广东广州510663)
摘 要:裂褶菌多糖(Schizophylan)是裂褶菌(Schizophylum commune)的主要活性成分之一。综述了裂褶
菌多糖结构、提取纯化工艺和生理活性功能等方面的研究进展。
关键词:裂褶菌;多糖结构;提取纯化工艺;生理活性功能
裂褶菌(Schizophyllum commune)又称白参、树花、八担柴,隶属于真菌门(Eumycophyta),担子菌
纲 (Basidiomycetes),伞 菌 目 (Agaricales),裂 褶 菌 科 (Schizophylaceae),裂 褶 菌 属
(Schizophyllum)[1]。裂褶菌子实体幼时稚嫩,味鲜美,是一种营养非常丰富的食材,同时裂褶菌也是
一种具有较高药用价值的大型真菌,其性平,味甘,具有滋补强壮、扶正固本和镇静作用[2]。裂褶菌多
糖(Schizophylan,简称SPG),又称裂褶菌素,是裂褶菌主要活性物质之一,是从子实体、菌丝体或发酵
液中提取出来的水溶性多糖。自上世纪60年代末KIKUMOTO等[3]最先发现SPG,迄今为止,许多研
究者对其结构和生理功能进行了研究工作,并开发了相关的抗肿瘤药物。国内对SPG的研究刚刚起
步,较国外的研究和生产水平有较大的差距。笔者对SPG结构、提取纯化工艺、生理活性功能等方面
的相关研究进行综述,以期为国内SPG的研究及开发利用提供参考。
1 多糖结构
  同其他的活性大分子一样,多糖的生物活性也依赖于自身的化学组成、空间构象及分子量大小。1971
年KIKUMOTO等最先对SPG结构进行研究,发现其是以3个β-(1→3)连接的D-吡喃型葡萄糖为重复结
构单元,通过β-(1→6)连接一个D-吡喃型葡萄糖侧链,构成的β-D-葡聚糖
[4]。在此基础上,NORISUYE
等研究发现SPG在水中是呈三股螺旋的构象,单链上重复残基间隔为(0.30±0.01)nm,而螺旋结构上股
沟之间的距离为(180±30)nm[5]。研究者进一步研究表明:SPG,在水溶液中具备三股螺旋结构、相对
分子质量大于100000的有较高的活性[6];而分子量小于50000不具备三股螺旋结构的,没有抗肿瘤活
性[7-8]。HIRATA 等利用人类的单核细胞系THP-1和U-937以及外周单核血细胞系构建细胞因子体
外检测模型,对SPG的三重螺旋结构及经碱处理后得到的单一螺旋构象异构体进行研究,研究数据显
示单一螺旋构象的SPG能够刺激THP-1细胞系对白细胞介素-12高水平表达,也能刺激 U-937细胞
系中白细胞介素-8和肿瘤坏死因子的高表达,但三重螺旋结构的SPG没有表现这些作用,这些实验结
果证明了SPG生物活性与构象密切相关[9]。OHNO等发现,三重螺旋构象的SPG以及经碱处理后的
螺旋构象异构体SPG-OH在增强因环磷酸酰胺引起的小鼠白血球减少症的造血功能方面起到显著效
果;在腹膜巨噬细胞中拮抗酵母聚糖过氧化氢合成作用上,SPG比SPG-OH更强;在启动脂多糖引起
肿瘤坏死因子的合成中以及体内一氧化碳和过氧化氢的合成中,SPG-OH的作用更强[10],这些药理免
疫学现象都揭示SPG的活性依赖于其空间构象。国内最先对SPG进行研究及结构鉴定的是南京大学
第2期 贺 凤,等:裂褶菌多糖的研究进展
的李兆兰教授,在试验中依次对提取的水溶性多糖进行醇析、Sevag法脱蛋白、透析、SephadexA-50和
SephadexG-200柱层析纯化,确定了SPG结构为β-葡聚糖,主链为β-(1→3)连接,支链为β-(1→6)连
接,并测得提取的SPG相对分子质量为10000[11-12]。冀颐之等对深层培养裂褶菌胞外多糖进行了研
究,测得其相对分子质量为40000,并证明SPG是以葡萄糖为单一组分,β-(1→3)和β-(1→6)糖苷键组
成的β-D葡聚糖
[13]。另外,叶诚等鉴定高相对分子质量的SPG结构为具有(1→6)分支的β-(1→3)-D-
葡聚糖,测得相对分子质量为436000[14]。
2 提取及纯化工艺
  SPG的制备主要有两条途径:其一是从野生或人工栽培的子实体中提取获得,其二是从发酵培养
的发酵液或菌丝体中提取获得。由于野生裂褶菌子实体产量低,而人工栽培裂褶菌存在周期长、效率
低等缺点,从子实体中大量提取SPG受到制约;液体发酵具有生产周期短、产量大、易于大规模工业生
产等优点,是获取SPG的主要途径;固体发酵虽具有培养所用设备简单、培养基成本低、能耗低等优
点,但存在发酵周期长的缺点,所以相比液体发酵工艺研究,固体发酵产SPG的研究报道相对比较少。
SPG提取的目的就是将多糖从其子实体、菌丝体或者发酵液中分离出来,同时要保持多糖原有空
间结构不变。酶法提取、热水提取、稀碱提取等传统提取方法存在提取率相对偏低的缺陷,超声提取、
微波提取、闪式提取等较新提取工艺,主要是在传统提取方法的基础上利用新的技术或辅助手段来提
高提取效率,与传统方法相比较具有明显的优势,应用前景广阔。提取获得的SPG是粗多糖,里面含
有非多糖成分,为了获得高品质的SPG需要进行进一步的纯化,主要工艺涉及脱色、脱杂蛋白、透析以
及柱层析等处理。常用的多糖脱色方法有:活性炭吸附法、硅胶吸附法和白土吸附法等。去除杂蛋白
方法有:Sevag法、三氯乙酸法、蛋白酶法和等电点法等。进一步纯化多糖的常用方法有:凝胶柱层析、
离子交换层析、亲和层析、纤维素柱层析、盐析法、透析法以及制备性色谱等。
赵岳等使用传统的酶解法提取裂褶菌子实体,优化液体果胶酶提取工艺,最优条件下对SPG的提取
率为54.76%[15]。杨娜等利用响应面法优化超声波辅助法工艺,在超声时间30min、超声功率200W、液
料比40∶1和提取温度40℃时,提取率达69.56%[16]。两者相比,在裂褶菌子实体多糖提取率上超声波辅
助提取法明显高于传统的酶解法。孟秀梅等利用闪式提取法(建立在热水提取法的基础上,加入了高速剪
切和快速搅拌,提高了提取效率,缩短了提取时间)提取,优化后体系为料水体积比1∶7、提取时间90s、提
取温度为80℃、pH为7、提取电机电压50V,提取所得的裂褶菌深层发酵多糖总量达到5.495g/L,比热
水提取法和微波提取法多糖得率分别提高了29.2%和15.6%[17]。德国学者RAU等对运用错流过滤法
对SPG进行纯化,相比传统的离心和终端过滤纯化方法效率有明显的提高,同时也降低了成本[18]。冀颐
之改进了传统的真菌多糖提取方法,确定提取SPG的新工艺为裂褶菌发酵液经去菌丝体、脱色、真空浓
缩、脱蛋白、乙醇沉淀得到均一组分的SPG,其中运用了等电点法与Sevag法相结合的去除粗多糖中的蛋
白质,效果极好,且该方法成本低、简便有效,特别适用于蛋白质含量较低的真菌多糖除蛋白[19]。叶诚通
过实验优化后得出最佳纯化工艺为:0.4%活性炭去色素,酶-Sevag结合法脱蛋白,经透析、SephadexG-
2000柱层析得到均一SPG,相对分子质量约为436000[20]。
3 生理活性功能
3.1抗肿瘤及免疫调节作用
  恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一,近年来该病发病率呈上升趋势,已经成为继心血管疾
病的第二大死亡病因。世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014》指出,中国新增癌症病例数量位居世
界第一。研究表明,多糖类化合物是一种免疫调节剂,能激活免疫受体,提高机体的免疫功能,在用于
肿瘤治疗中安全有效[21]。KOMATSU 等最先对SPG抗肿瘤活性展开研究,发现SPG水溶液在实验动
物体内对肉瘤180具有抑制作用[22]。SPG能够单独对大鼠或者小鼠体内同源或者异源的肿瘤细胞
(如:子宫内膜癌细胞 MM-60和 MH-134,膀胱肿瘤细胞BC-47,纤维肉瘤细胞AMC-60和乳腺癌细胞
A-755)起作用。同时也能与化疗药物联合作用抑制肿瘤细胞,如:白血病L1210,黑色素瘤细胞B-16,
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食 用 菌 学 报 第23卷
纤维肉瘤细胞 Meth-A[21]。ALEEM研究了SPG在体外对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制作用,实验研
究表明1500μg/mL的SPG能够将乳腺癌细胞阻滞在G2/M 期,主要是通过加强抑制CDK1激酶的
磷酸化以及人体抑癌基因p53的积累起作用[23]。MANSOUR等发现SPG对小鼠乳腺癌的抑制作用
与他莫昔芬 (乳腺癌临床用药)效果一样[24]。
新的研究成果不断地证明SPG对更多种类的肿瘤细胞具有抑制作用,ZHOU等将神经胶质瘤植
入小鼠脑内后,实验组每天注射20、40和60mg/kg SPG,7d后,与相对应的3个剂量对照组(每天分
别注射与实验组等量的0.9%生理盐水)相比,3个实验组对肿瘤抑制率分别为(30.8±4)%、(38.3±
3.5)%和(55.3±5.1)%;另外,在体外用 MTT法检测到,经终浓度40和60mg/L的SPG处理24h
后,神经胶质瘤细胞CNS-1凋亡和坏死率显著提高[25]。宋爱荣等通过采用体外细胞培养和 MTT检
测技术进行研究,结果显示SPG剂量150μg/mL时,对肝癌HepG2和喉癌Hep-2细胞抑制率最高,分
别达到22.74%~22.83%和23.81%~24.49%;剂量75μg/mL时,对肝癌Bel-77402细胞抑制率最
高,达到28.14%~28.78%[26]。
人体免疫系统,不仅可以抵御外来抗原的侵入,及时清除体内衰老、死亡和损失的细胞,还能识别
和清除体内产生的异常细胞(如肿瘤细胞)。SPG本身不具有细胞毒性,可以单独作用,也可与其它药
物联合作用。SAKAGAMI等研究表明,SPG抗肿瘤效果主要是通过外周血单个核细胞(PBMC)产生
的白介素-2和干扰素-γ起作用[27]。TSUCHIYA等对小鼠注射SPG后,通过与对照组比较,发现注射
SPG能够刺激NK细胞、淋巴细胞和脾细胞产生白介素1、2和3等细胞因子或者外源凝集素,证实
SPG的作用与免疫因子密切相关[28]。KIMURA等将SPG作为一种免疫辅助药物临床应用于头颈癌
患者身上,5年后服用SPG的患者存活率为86.7%,对照组存活率为73.4%,表明SPG作为一种免疫
辅助药物在头颈癌患者身上是有效的[29]。刘伟峰等研究裂褶菌胞内多糖和胞外多糖对环磷酰胺
(CTX)化疗S180荷瘤小鼠的影响,研究显示中、低剂量(250、125mg/kg)裂褶菌胞内多糖、胞外多糖分
别联合CTX治疗可抑制肿瘤细胞S180生长,与对照组CTX组无显著差别,但联合治疗可使荷瘤小鼠
体重有不同程度的增加;另外,与对照组相比,低剂量(125mg/kg)裂褶菌胞外多糖联合CTX组小鼠的
胸腺系数有显著性升高(P<0.05),脾系数有极显著性升高(P<0.01),实验结果表明裂褶菌发酵多糖
作为生物反应调节剂可提高机体的免疫力,同时减轻CTX化疗毒性,起到了减毒增效的作用[30]。杨
娜等对小鼠腹腔注射环磷酰胺建立免疫低下模型,通过灌胃不同剂量的SPG,从非特异性免疫、细胞免
疫和体液免疫3种途径研究SPG的免疫活性作用,实验结果表明,SPG对免疫低下小鼠的胸腺、脾脏
器官具有一定的恢复作用,SPG的供试剂量与免疫低下的模型组小鼠相比,血清中血清溶血素、IgG、
IgA、IL-2均有不同程度的提高,另外实验结果也表明SPG可增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力[31]。
3.2其它作用
  SPG在抗肿瘤以及免疫调节方面良好的功效,推动了探索SPG在其他方面的活性功能研究,相关
研究主要涉及抑菌、抗炎、保湿功效以及新型生物絮凝剂材料等方面。
赵岳等研究结果表明,0.7mg/mL SPG对大肠杆菌的抑制率为42.8%,浓度为0.25mg/mL时对假
单胞杆菌的抑制率为34.15%[15]。JAYAKUMAR等研究发现用高碘酸盐氧化后的SPG对革兰氏阳性菌
和革兰氏阴性菌都具有抑制作用,最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)在3.0~8.0mg/L之
间[32]。刘伟峰等利用昆明小鼠建立角叉菜胶致小鼠足肿胀模型,与空白组相比,高剂量(500mg/kg)的裂
褶菌胞内、胞外粗多糖能极显著减轻小鼠足肿胀度,对足肿胀抑制率分别为57.1%和62.45%;对棉球肉
芽组织的增生也有极显著的抑制作用(P<0.01),对肉芽肿的抑制率分别为63.00%和63.84%,所以高剂
量的SPG具有明显的抗炎作用[33]。周林等研究结果显示,SPG在48h内的吸湿率和保湿率分别为
44.75%和63.06%,同时与常用的化妆品保湿剂甘油、透明质酸钠、壳聚糖、聚乙二醇(PEG)进行比较,
实验结果显示SPG 48h的综合保湿能力最强,168h的综合保湿能力只比甘油弱,表现出良好的吸湿
和保湿性能,是一种很有开发潜力的天然保湿剂[34]。张琪等研究微波提取SPG(MES)和热水提取
SPG(HWES)在化妆品中的应用性能,采用单一保湿剂体外实验和人体保湿实验两种方法,与对照品
(甘油和燕麦β-葡聚糖)进行保湿功效比较研究,体外保湿实验结果表明,在相对湿度62%条件下,24h
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第2期 贺 凤,等:裂褶菌多糖的研究进展
内保湿性大小顺序为甘油>HWES>MES>燕麦β-葡聚糖>空白;人体保湿实验结果表明,SPG的保
湿效果优于燕麦β-葡聚糖,MES的综合保湿效果较 HWES更好,综上微波提取的多糖保湿性能优良,
具备开发作为日用化妆品中保湿剂的潜力[35]。SPG作为潜在的一种新型生物絮凝剂材料成为一个研
究的热点[36]。GAO研究表明,由于SPG在高盐和高温环境下能保持很好的粘度,可用于提高原油采
收效率,在石油开采方面具有潜在的应用价值[37]。JOSHI等报道SPG在采油试验中显示在残余油饱
和度下能够额外使28%的重油恢复[38]。另外,HOTTA 等实验研究结果表明,注射SPG的小鼠血清
中抗病毒血清抗体比未注射SPG的对照组小鼠在仙台病毒感染和传播中能够更加有效地抑制仙台病
毒感染[39];刘伟峰等发现SPG发酵胞内多糖能增加小鼠呼吸道酚红排泌量,具有一定的祛痰作用[40]。
有研究者对SPG进行化学改性后研究其活性功能:ITOH等研究结果显示含硫量越高的SPG抗艾滋
病病毒感染能力越强[41]。也有研究者发现,c-Src肽包裹SPG对脓毒症和结肠炎具有显著的效果[42];
还有研究报道了SPG作为一种中间载体在治疗小鼠体内动脉粥样硬化实验[43]和治疗小鼠炎症性肠病
实验[44]中起作用。
4 开发与研究展望
  SPG抗肿瘤药物“Sizofiran”(施佐非兰)于1986年上市,临床上主要用来治疗宫颈癌,取得非常显
著的社会效益和经济效益。MIYAZAKI等[45]对宫颈癌患者进行了临床研究,其中只进行化疗治疗的
为对照组有82名患者,既进行化疗治疗的同时又服用抗肿瘤药物药物“Sizofiran”为实验组有90名患
者。5年后对照组存活率约为51.2%,实验组存活率约为67.8%,可见实验组存活率明显高于对照组。
由于SPG在免疫调节和抗肿瘤方面功效非常明显,也引起了国内研究者的兴趣。国内对SPG的
研究起步较晚,相关研究主要集中在裂褶菌营养生理和人工栽培,为裂褶菌的开发利用奠定了基础,也
提供了一定的科学依据,但与国外的研究相比存在一定的差距。SPG作为一种临床抗肿瘤用药其功效
和安全性得到一致认可,应用前景非常广阔,接下来国内主要研究的突破点应该集中在工业化生产
SPG技术,SPG分子量和空间结构与活性之间的关系,SPG抗肿瘤和增强免疫机理研究以及临床应用
研究等方面。
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HE Feng,HUANG Longhua,LIU Yuanchao,LI Chengbin,HU Huiping*
(Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Colection
and Application,Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology,State Key Laboratory of Applied
Microbiology South China,Guangzhou,Guangdong 510070,China;Guangdong Yuewei Edible Fungi
Technology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong 510663,China)
Abstract:Structural features,extraction and purification techniques,and physiological activity of
schizophylan,a major functional component of Schizophylum commune,have been reviewed.
Key words:Schizophylum commune;schizophylan structure;technology of extraction and purification;
physiological activity
[本文编辑] 于荣利
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