全 文 ：52 2016, Vol.37, No.18 食品科学 ※工艺技术
响应面法优化甜叶菊残渣中总黄酮提取工艺及
抗氧化活性
陈 婷，徐文斌，洪怡蓝，李 丹，奚印慈*
（上海海洋大学食品学院，上海 201306）
摘  要：研究甜叶菊残渣中总黄酮的提取工艺，同时测定甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化活性。首先以乙醇体积分
数、超声功率和超声时间为因素进行单因素试验，找到每个因素的较优水平，然后在此基础上采用Box-Behnken
法进行试验设计，并进行响应面分析，得到提取工艺的数学模型，预测出最佳提取工艺及最高总黄酮浸提量。结
果显示：甜叶菊残渣中总黄酮物质的最佳提取工艺为乙醇体积分数70%、超声功率420 W、超声时间42 min，此
时总黄酮浸提量为5.928 mg/g，与由数学模型得到的理论值5.949 mg/g基本符合。抗氧化实验结果表明，甜叶菊残
渣中总黄酮具有很强的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和·OH的能力，其半抑制浓度（EC50）相应为7.096、
22.065 μg/mL，分别是VC的1.37、1.61 倍，表明甜叶菊残渣中黄酮类化合物有很好的抗氧化能力。
关键词：甜叶菊残渣；超声提取；总黄酮；响应面法；抗氧化性
Total Flavonoids from Stevia rebaudiana Residue: Optimization of Extraction Process by Response Surface
Methodology and Antioxidant Activity Evaluation
CHEN Ting, XU Wenbin, HONG Yilan, LI Dan, XI Yinci*
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)
Abstract: In this experiment, we optimized the conditions for extracting total flavonoids from stevia (Stevia rebaudiana)
residue left after stevioside extraction and determined the antioxidant activity of the total flavonoids. Firstly, we selected
ethanol concentration, ultrasound power, and ultrasound treatment time as factors to conduct single factor investigations for
the purpose of establishing the appropriate levels for each of these factors. Then, we developed a predictive mathematical
model of the yield of total flavonoids using Box-Behnken experimental design for the optimization of extraction conditions
by response surface analysis. The optimal extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration, 70%;
ultrasound power, 420 W; and ultrasound treatment time, 42 min. Experiments conducted under these conditions gave the
maximum yield of total flavonoids of 5.928 mg/g, which was close to the predicted value of 5.949 mg/g. Moreover, antioxidant
experiments showed that total flavonoids from stevia residue left after stevioside had very strong scavenging capabilities for DPPH
and hydroxyl radicals with EC50 values of 7.096 and 22.065 μg/mL, respectively, which were approximately 1.37 and 1.61 times
that of vitamin C, respectively. Therefore, the total flavonoids had strong antioxidant capacity.
Key words: stevia residue left after stevioside extraction; ultrasonic extraction; total flavonoids; response surface
methodology; antioxidant activity
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009
中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2016）18-0052-06
引文格式：
陈婷, 徐文斌, 洪怡蓝, 等. 响应面法优化甜叶菊残渣中总黄酮提取工艺及抗氧化活性[J]. 食品科学, 2016, 37(18): 52-57.
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009. http://www.spkx.net.cn
CHEN Ting, XU Wenbin, HONG Yilan, et al. Total flavonoids from Stevia rebaudiana residue: optimization of extraction
process by response surface methodology and antioxidant activity evaluation[J]. Food Science, 2016, 37(18): 52-57. (in
Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-01-04
基金项目：上海海洋大学-日本维科株式会社合作研究基金项目
作者简介：陈婷（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：chentingjs@163.com
*通信作者：奚印慈（1957—），女，副教授，博士，研究方向为天然物质的生物活性成分。E-mail：xiyinci@gmail.com
※工艺技术 食品科学 2016, Vol.37, No.18 53
甜叶菊（Stevia rebaudiana）是被称作“甜菊”、
“甜草”原产于南美洲巴拉圭[1]的一种菊科植物，含甜菊
糖苷和黄酮类成分[2]。其中甜菊糖苷是一种新型的天然甜
味剂[3]，可替代蔗糖，有甜度高、热量低、安全无毒等特
点[4]，已经广泛应用到医药和食品等领域[5]。其具有抗氧
化性、抗菌性等功效，且能够调节免疫力[6-8]，同时具有
很好的软化血管、降血脂和降血糖等功能[9-10]。目前国内
已有对甜叶菊中甜菊糖苷提取方面的研究[11]，其发酵制
剂抗氧化活性的研究也有报道[12]；但甜叶菊残渣中总黄
酮的提取[13]并鉴定其抗氧化活性却鲜有报道。
本实验以甜叶菊残渣为试验原料，先运用B o x -
Behnken试验设计及响应面分析对从甜叶菊残渣中总黄酮
的超声提取工艺进行优化；再通过测定1,1-二苯基-2-三
硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基
和·OH的清除率，评价甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化活
性，旨在为甜叶菊残渣中总黄酮物质的研究开发利用提
供实验数据及理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甜叶菊残渣，由日本维科株式会社提供。
DPPH（纯度≥95%） 美国Fluka公司；芦丁标准品
（光谱纯）、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、无水乙醇、
亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为分析纯） 上海
国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-3000PC型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有
限公司；ALC-210.4电子分析天平 上海精密仪器仪表
有限公司；HSS-11-6电热恒温水浴锅 上海沪粤明科仪
器有限公司；SK5210HP超声波仪 上海科导超声仪器有
限公司；80-5微电脑离心机 江苏国华电气有限公司；
SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵 杭州明远仪器有限公司；
GZX-9146 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公
司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 甜叶菊残渣中总黄酮浸提量的测定
1.3.1.1 芦丁标准曲线的绘制[14]
精确称取5.00 mg芦丁标准品，溶于60%乙醇溶液中，
充分溶解后转移到25 mL容量瓶内，定容即得0.2 mg/mL
芦丁标准溶液。依次吸取芦丁标准溶液0.00、0.40、
0.80、1.20、1.60、2.00 mL置于10 mL容量瓶内，加
0.2 mL的5 g/100 mL亚硝酸钠溶液，混匀，室温条件下静
置反应6 min，加0.2 mL的1 g/10 mL硝酸铝溶液，混匀，
室温条件下静置反应6 min，加2.0 mL的1.0 mol/L氢氧化
钠溶液，然后用60%乙醇溶液定容，混匀，室温条件下
静置反应15 min，于波长510 nm处测定吸光度，y（吸光
度）为纵坐标，x（总黄酮质量）为横坐标，绘制标准曲
线，线性回归方程为：y=0.836x＋0.007（R2=0.999）。
1.3.1.2 总黄酮浸提量的计算[14]
准确称取5.00 g甜叶菊残渣样品，在不同条件下进行
总黄酮的提取，抽滤得到提取溶液，用60%乙醇溶液定
容到一定体积，精确吸取一定量提取液，根据1.3.1.1节方
法配制待测液。测定其在510 nm波长处的吸光度，总黄
酮浸提量计算见式（1）：ᘏ咘䝂⍌ᦤ䞣/˄mg/g˅˙hm1V1 V2m2 （1）
式中：m1为根据标准曲线计算出提取液中黄酮含
量/mg；m2为甜叶菊残渣质量/g；V1为测定液体积/mL；
V2为定容体积/mL。
1.3.2 甜叶菊残渣中总黄酮提取工艺优化
1.3.2.1 单因素试验设计
甜叶菊残渣为样品，以样品的总黄酮浸提量为考察
对象，分别以3 个因素：乙醇体积分数、超声时间和超声
功率[15-16]进行单因素试验，得到各因素对甜叶菊残渣中总
黄铜提取量影响的试验结果。
1.3.2.2 Box-Behnken试验设计
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计法，选
3 个因素：乙醇体积分数、超声功率和超声时间作为自变
量，总黄酮浸提量（Y）为响应值，设计试验的因素和水
平，见表1。
表 1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and their levels used in response surface methodology
因素
水平
－1 0 1
A乙醇体积分数/% 65 70 75
B超声功率/W 370 400 430
C超声时间/min 35 40 45
1.3.3 甜叶菊残渣中总黄酮抗氧化性的测定
1.3.3.1 清除DPPH自由基的测定[17-18]
将上述甜叶菊残渣提取液进行梯度稀释，之后依次
吸取3 mL上述不同浓度稀释液于试管内，加入0.04 g/L
DPPH溶液3 mL，混匀，避光反应20 min。上述液体在
3 500 r/min离心10 min，取上清液，于517 nm波长处测
定吸光度Ai；依次吸取3 mL上述不同浓度稀释液于试管
内，依次添加3 mL无水乙醇，摇匀，避光反应20 min。
上述液体在3 500 r/min离心10 min，取上清液测定其在
517 nm波长处的吸光度Aj；取0.04 g/L DPPH溶液3 mL和
无水乙醇3 mL反应作为校准液，在517 nm波长处测定其
吸光度A0。DPPH自由基清除率计算见式（2）：
54 2016, Vol.37, No.18 食品科学 ※工艺技术␵䲔⦷/%＝˄ˉ˅hAiˉAjA0 （2）
1.3.3.2 清除·OH的测定[18]
将上述甜叶菊残渣提取液进行梯度稀释，依次吸取
2 mL上述稀释液，依次添加6 mmol/L的硫酸亚铁溶液
2 mL、6 mmol/L的过氧化氢溶液2 mL，摇匀后室温条件
下静置10 min，再添加6 mmol/L水杨酸2 mL，摇匀后室
温条件下静置30 min，测定其在510 nm波长处的吸光度
Ai；同时测定用去离子水替换水杨酸时的吸光度Aj。校准
液是用去离子水替换总黄酮溶液，然后测定其吸光度为
A0。·OH清除率计算见式（2）。
1.4 数据分析
实验得到的数据均为多次重复实验得到的平均值，
选择单因素试验结果较好的水平，采用Design-Expert 8.0
软件进行分析，得到回归模型及最优工艺。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮浸提量的影响
当超声时间20 min、超声功率300 W时，分别考察乙
醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%和80%对甜叶
菊残渣中总黄酮浸提量的影响，结果如图1所示。
30
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
40 50҉䞷փ〟࠶ᮠ/%60 70 80ᙫ哴䞞⎨ᨀ䟿/ ˄mg/g ˅
图 1 乙醇体积分数对总黄酮浸提量的影响
Fig. 1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids
图1显示，当乙醇体积分数在30%～70%内，甜叶菊
残渣中总黄酮浸提量随乙醇体积分数的增加呈现增加趋
势；但当乙醇体积分数高于70%时，总黄酮浸提量呈现
下降趋势；当乙醇体积分数为70%时，总黄酮浸提量的
最大值是5.397 mg/g。因此，后续试验选定乙醇体积分数
最优值为70%。
2.1.2 超声功率对总黄酮浸提量的影响
当乙醇体积分数70%、超声时间20 min时，分别考察
超声功率300、350、400、450、500、550 W对甜叶菊残
渣中总黄酮浸提量的影响，结果见图2。
300
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.5
6.0
350 400䎵༠࣏⦷/W450 500 550ᙫ哴䞞⎨ᨀ䟿/ ˄mg/g ˅
图 2 超声功率对总黄酮浸提量的影响
Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids
由图2可得，超声功率从300～400 W时，总黄酮浸提
量逐步增大；但当超声功率超过400 W时，总黄酮浸提量
逐渐下降，可能因为过大的超声功率破坏了黄酮分子，
导致总黄酮浸提量的下降[19]；当总黄酮浸提量到达最大
（5.647 mg/g）时，超声功率为400 W。因而，当其他条
件保持不变的时候，为了提取出更多黄酮物质，超声功
率选择400 W。
2.1.3 超声时间对总黄酮浸提量的影响
控制乙醇体积分数70%、超声功率400 W，分别考察
超声时间10、20、30、40、50、60 min时甜叶菊残渣中
总黄酮浸提量受超声时间的影响。
10
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
20 30䎵༠ᰦ䰤/min40 50 60ᙫ哴䞞⎨ᨀ䟿/ ˄mg/g ˅
图 3 超声时间对总黄酮浸提量的影响
Fig. 3 Effect of ultrasonication duration on the extraction
rate of total flavonoids
由图3可知，当超声时间为40 min时，总黄酮浸提
量最大可达5.129 mg/g；当超声时间在40 min内时，随
着超声时间的延长甜叶菊残渣中总黄酮的浸提量逐渐
增大；随着超声时间不断的延长，总黄酮物质的浸提
量呈下降趋势，由于超声时间延长，超声波的作用增
强，破坏了黄酮的结构 [19]，因此甜叶菊残渣中总黄酮
浸提量减少。
2.2 响应面分析设计及结果
通过Design-Expert 8.0软件对表2的数据进行分析，结
果如表3所示。由表3可知，乙醇体积分数（P＜0.01）、
超声时间（P＜0.01）和超声功率（P＜0.01）3 个因素均
对甜叶菊残渣总黄酮提取影响显著[20-21]。以甜叶菊残渣
※工艺技术 食品科学 2016, Vol.37, No.18 55
中总黄酮浸提量为响应值，经回归拟合，得到的回归方
程为：
Y=5.83＋0.18A＋0.45B＋0.39C－0.007 5AB＋
0.012AC＋0.017BC－0.52A2－0.72B2－0.16C2
表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Program and experimental results of RSA
试验号 A乙醇体积分数/%
B超声
功率/W
C超声
时间/min
Y总黄酮浸
提量/（mg/g）
1 65 400 45 5.32
2 70 400 40 5.82
3 70 400 40 5.87
4 70 370 45 4.87
5 65 400 35 4.59
6 75 400 45 5.74
7 70 370 35 4.12
8 70 400 40 5.79
9 70 430 45 5.81
10 75 370 40 4.32
11 75 430 40 5.19
12 65 370 40 3.98
13 70 400 40 5.81
14 70 430 35 4.99
15 65 430 40 4.88
16 70 400 40 5.85
17 75 400 35 4.96
表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance for the fltted regression model
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 6.75 9 0.75 730.89 ＜0.000 1**
A乙醇体积分数 0.26 1 0.26 252.70 ＜0.000 1**
B超声功率 1.60 1 1.60 1 561.89 ＜0.000 1**
C超声时间 1.19 1 1.19 1 156.07 ＜0.000 1**
AB 0.000 25 1 0.000 25 0.22 0.653 8
AC 0.000 625 1 0.000 625 0.61 0.460 6
BC 0.001 225 1 0.001 225 1.19 0.310 6
A2 1.12 1 1.12 1 089.80 ＜0.000 1**
B2 2.18 1 2.18 2 129.49 ＜0.000 1**
C2 0.11 1 0.111 105.42 ＜0.000 1**
剩余项 0.007 18 7 0.001 026
失拟项 0.003 1 3 0.001 033 1.01 0.474 5
纯误差 0.000 408 4 0.001 02
总和 6.75 16
注：**. P＜0.01，影响极显著。
方差来源项的P值若小于0.01，则此项为极显著，在
本试验中，模型A、B、C、A2、B2和C2皆显著，仅AB、
AC、BC三项不显著，说明模型具有较好的拟合效果；该
方程是甜叶菊残渣中总黄酮浸提量与提取工艺各项参数
的核实数学模型，因此，该回归方程可以用来确定甜叶
菊残渣中总黄酮的最优提取工艺。离均差平方和的数值
大小反映来源项所引起的响应值变异程度，数值越小所
引起的变异越小，在本试验中，A、B、C三因素对响应
值影响大小依次为B＞C＞A，即超声功率＞超声时间＞
乙醇体积分数。
响应面图形是响应值Y对应于试验因素A、B和C所
构成的三维空间的曲面图，其在二维平面上的等高线图
可直观反映各因素及他们之间的交互作用对响应值的影
响[22-23]。图4是根据回归方程得到的不同因素的响应面图
和等高线图。
65370382
394406
418430
67 69
71 73
75
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5ᘏ咘䝂⍌ᦤ䞣/%
B䍙ໄࡳ⥛/W
AЭ䝛ԧ⿃ߚ᭄/%ᙫ哴䞞⎨ᨀ䟿/%
5.04.5 4.5
75737169
A҉䞷փ〟࠶ᮠ/%6765
5.0 5.5
5.5
370
382
394
406
418
430
B 䎵༠࣏⦷/W 5
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5ᘏ咘䝂⍌ᦤ䞣/%
6535 6737
6939
C䍙ໄᯊ䯈/min 7141 7343 7545
AЭ䝛ԧ⿃ߚ᭄/%ᘏ咘䝂⍌ᦤ䞣/%
75737169
AЭ䝛ԧ⿃ߚ᭄/%6765353739C 䍙ໄᯊ䯈/min 414345 6.05.85.655.45.2 5.25.0 5.04.8
56 2016, Vol.37, No.18 食品科学 ※工艺技术
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5ᘏ咘䝂⍌ᦤ䞣/%
370
382394
406418
430
B䍙ໄࡳ⥛/W353739C䍙ໄᯊ䯈/min414345 ᘏ咘䝂⍌ᦤ䞣/%
6.0
5.0
5.5
5
4.5
370 382 394
B䍙ໄࡳ⥛/W406 418 430353739414345C 䍙ໄᯊ䯈/min
图 4 两因素交互作用对总黄酮浸提量的响应面和等高线图
Fig. 4 Response surface and corresponding contour plots showing the
effects of operating parameters on the extraction rate of total flavonoids
图4中的立体图显示乙醇体积分数对总黄酮浸提量的
影响显著，曲面弯曲程度大，超声时间的影响不明显，
曲面弯曲程度小[24]。在超声功率和乙醇体积分数交互作
用等高线图中，等高线沿体积分数降低方向密集，增高
方向稀疏，说明降低乙醇体积分数会更显著地影响总黄
酮浸提量。同理，降低超声功率、缩短超声时间都会更
显著地影响总黄酮浸提量。
对响应面模型进行优化分析，得到的最优因素组
合为乙醇体积分数70%、超声功率420 W、超声时间
42 min，最高总黄酮浸提量的理论值为5.949 mg/g，按此
工艺进行实际实验，得到的总黄酮浸提量为5.928 mg/g，
这与理论值基本吻合。
2.3 甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化活性分析
2.3.1 甜叶菊残渣中总黄酮对DPPH自由基清除效果
y＝5.741x＋20.42
y＝6.364x＋5.012
R2＝0.974
R2＝0.968 ⭌ਦ㧺↻⑓哴䞞
VC䍘䟿⎃ᓖ/˄µg/mL˅201020DPPH 㠚⭡ส␵䲔⦷/% 30405060708090100 4 6 8 10 12 14
图 5 VC和甜叶菊残渣黄酮对DPPH自由基的清除作用
Fig. 5 DPPH radical scavenging effects of vitamin C and the total flavonoids
VC和甜叶菊残渣中总黄酮对DPPH自由基清除效
果见图5。甜叶菊残渣中总黄酮的EC50（即清除率达到
50% 时所需药物的质量浓度）为7.069 μg/mL，而VC的
EC50为5.152 μg/mL，甜叶菊残渣中总黄酮的EC50约是VC
的1.37 倍。表明甜叶菊残渣中总黄酮有较好的抗氧化活
性，虽然不及纯度很高的VC，但对DPPH自由基清除率
最高可达92.74%。
2.3.2 甜叶菊残渣中总黄酮对·OH清除效果
y＝1.976x＋22.85
y＝1.879x＋8.54
R2＝0.952
R2＝0.957
⭌ਦ㧺↻⑓哴䞞
VC 䍘䟿⎃ᓖ/˄µg/mL˅001020gOH ␵䲔⦷/% 30405060708090 10 20 30
图 6 VC和甜叶菊残渣黄酮对·OH的清除作用
Fig. 6 Hydroxyl radical scavenging effects of vitamin C and the total flavonoids
目前的研究表明黄酮类化合物能够抗癌和防癌，且
可以有效阻止脂质过氧化破坏细胞[24]。由图6可知，当
甜叶菊残渣中总黄酮质量浓度是22.065 μg/mL时，50%
的·OH得到清除，而VC的EC50是13.74 μg/mL，甜叶菊
残渣中总黄酮的质量浓度是VC质量浓度的1.61 倍。因
此，相比于VC，甜叶菊残渣中总黄酮清除·OH的能力
较弱。
3 结 论
通过响应面分析法对各单因素的试验结果进行优
化，得到的最优工艺条件为乙醇体积分数70%、超声功
率420 W、超声时间42 min，按此工艺进行试验操作，得
到的总黄酮浸提量为5.928 mg/g，这与理论值5.949 mg/g
相符。表明模型能够对试验结果较好的拟合。各因素对
总黄酮浸提量影响的显著性依次为超声功率、超声时间
和乙醇体积分数。
通过对甜叶菊残渣中总黄酮的抗氧化实验表明，甜
叶菊残渣中总黄酮具有很强的清除DPPH自由基和·OH
的能力，其EC50相应为7.096、22.065 μg/mL，分别是VC
的1.37、1.61 倍，实验结果表明甜叶菊残渣中黄酮类化合
物有很好的抗氧化能力。这为甜叶菊残渣中总黄酮物质
的研究开发利用提供了理论依据。
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