全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24: 1270-1273，1291
文章编号: 1001-6880( 2012) 09-1270-05
收稿日期: 2011-11-08 接受日期: 2012-02-06
基金项目: 国际合作课题: 保健中药风险效益评估合作研究
( 1108) ; 重大新药创制( 2012ZX09301002-001)
* 通讯作者 Tel: 86-10-57833275; E-mail: rlpan@ implad． ac． cn
木豆叶醇提物对皮质酮诱导的 PC12 细胞损伤的保护作用
姜保平，刘亚旻，李宗阳，宋 波，潘瑞乐*
中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要:建立皮质酮诱导的 PC12 细胞损伤模型并观察木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤 PC12 细胞的保
护作用。以 100 μmol /L的皮质酮诱导 PC12 细胞损伤;损伤后的 PC12 细胞与木豆叶醇提物及不同组分孵育 24
h，通过形态学观察、MTT检测、LDH测定，研究各组分对皮质酮损伤 PC12 细胞的保护作用。结果表明，PC12 细
胞与皮质酮孵育 48 h后细胞存活率明显降低，而 LDH水平显著升高。而加入木豆叶醇提物及各组分时上述效
果明显减轻，且存在明显的剂量依赖关系。从以上结果可知，木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤的 PC12
细胞均有保护作用，且醇提物的效果最好。
关键词:木豆叶; PC12 细胞;皮质酮; MTT; LDH
中图分类号: R284. 2 文献标识码: A
Protective Effect of Alcohol Extract of Cajanus cajan on
Corticosterone-induced Lesion in Cultured PC12 Cells
JIANG Bao-ping，LIU Ya-min，LI Zong-yang，SONG Bo，PAN Rui-le*
Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China
Abstract: The aim of this paper was to establish the corticosterone-induced damage model in PC12 cells and study the
protective activity of alcohol extracts and its fractions from Cajanus cajan on corticosterone-induced PC12 cells． PC12
cells were exposed to different concentrations of corticosterone to determine the optimum concentration of establishing the
damage model，and then the injured PC12 cells were incubated with the alcohol extract and its fractions for 24 h． After
that the neuroprotective effect on injured PC12 cells was investigated by morphological observation，LDH detection and
MTT determination． The results showed that the survival rate of PC12 cells and the cells exposed to corticosterone ( 100
μmol /L) for 48 h decreased obviously，with an increase in lactate dehydrogenase ( LDH) level，but the effect became
weak when the alcohol extracts and its fractions from the C． cajan was added to the PC12 cells，and it was in a dose-de-
pendent manner． The author suggests that the alcohol extract and its fractions from C． cajan can generate a neuroprotec-
tive effect on injured PC12 cells induced by corticosterone，and that of alcohol extract is the most significant．
Key words: Cajanus cajan; PC12 cell; conticosterone; MTT; LDH
抑郁症( depression) 是一种高发病、高致残、高
复发的精神疾病。临床研究表明抑郁症病人的下丘
脑-垂体-肾上腺轴( hypothalamic pituitary adrenal ax-
is，HPA ) 功能亢进，血中糖皮质激素水平显著升
高［1］。而持续高浓度糖皮质激素可以导致淋巴细
胞、皮层及海马神经细胞损伤［2］。PC12 细胞株为大
鼠肾上腺嗜铬细胞克隆化细胞株，分化的 PC12 细
胞有典型的神经细胞特征，其胞膜上糖皮质激素受
体表达丰富［3］。用高浓度的皮质酮诱导 PC12 细胞
损伤，已成为研究抑郁症的一种常用体外模型［4］。
木豆叶为豆科木豆属植物木豆［Cajanus cajan
( L． ) Millsp．］的干燥叶子。现代研究表明木豆叶
主要成分有芪类和黄酮类化合物，具有抗骨质疏松、
降血脂、抗老年性痴呆等多种药理活性［5，6］。而木
豆叶提取物对皮质酮损伤的 PC12 细胞的保护作
用，国内外未见文献报道。
本研究用高浓度的皮质酮与 PC12 细胞共同孵
育，模拟抑郁症病人的大脑神经元损伤状态，以此观
察木豆叶醇提物及不同组分对神经细胞的保护作
用，为木豆叶中抗抑郁新药研发提供科学依据。
1 材料
1． 1 药材
木豆叶采自广西凤山县，经中国医学科学院药
用植物研究所张本刚教授鉴定为木豆属植物木豆的
干燥叶子。
1． 2 试剂
大鼠嗜铬细胞瘤 PC12 细胞( 上海细胞库) ; 精
制胎牛血清、DMEM高糖培养基( Gibco 公司) ; 二甲
基亚砜 DMSO、MTT、Corticosterone ( Sigma 公司 ) ;
LDH检测试剂盒( STANBIO，USA) 。
1． 3 仪器
纯水仪( 美国 Millipore公司) ; 二氧化碳培养箱
( NAPCO 6500 TC 法国) ; 连续波长酶标仪 ( 美国
BIO-TEK) 。
2 方法
2． 1 样品制备
用 80%乙醇回流提取干燥木豆叶 3 次，每次 1
h，合并滤液，减压回收乙醇，即得乙醇浸膏。乙醇浸
膏溶解后，与硅胶拌匀，干燥;用索氏提取器提取，依
次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和 95%的乙醇洗
脱，分别减压浓缩即得石油醚洗脱部位( PEP) 、二氯
甲烷洗脱部位( DMP) 、乙酸乙酯洗脱部位( EAP) 和
乙醇洗脱部位( EP) 。
2． 2 PC12 细胞培养
PC12 细胞液置于 15 mL 的离心管中，1000
rpm，离心 5 min，弃上清液，将细胞用含有 5%胎牛
血清和 10%马血清的高糖 DMEM培养基悬浮，分装
于 25 mL的培养瓶中，置于 37 ℃的二氧化碳培养箱
中培养，每 2 ～ 3 d换液 1 次。
2． 3 PC12 细胞皮质酮损伤模型的建立
PC12 细胞培养至对数生长期，用含 5%胎牛血
清、10%马血清的 DMEM 培养基 ( 含青霉素钠 200
kU /L，链霉素 100 mg /L，pH 7． 4) 重悬细胞，调细胞
浓度为每毫升 1 × 105 个。细胞接种于 96 孔板中，
各孔加入 100 μL细胞液，置于 37 ℃、CO2 培养箱中
贴壁培养 2 ～ 4 d，待细胞长满孔底后即可用于实验。
加入不同浓度的皮质酮( 0． 01、0． 1、1、10、100 μmol /
L) ，作用 12、24 和 48 h 后，用 MTT法检测细胞的活
力，利用酶标仪在 570 nm处测定各组细胞吸光度 A
值。以对照组平均吸收值为 100%，以各处理组吸
收值与对照组的比值计算存活率。
2． 4 木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤的
PC12 细胞存活力影响
将 PC12 细胞以每毫升约 1 × 105 个接种于 96
孔板( 每孔 100 μL) ，正常培养 24 h 后加入终浓度
100 μmol /L 皮质酮损伤 PC12 细胞 48 h，加入不同
浓度( 12． 5，25，50，100，200 μmol /L) 的木豆叶醇提
物及不同组分作用 24 h 后，用 MTT 法检测细胞存
活率，在多功能酶标仪上测定 570 nm 的吸收度值。
2． 5 乳酸脱氢酶活性测定
细胞以每孔 1 × 105 个接种于 24 孔中，培养 24
h后加入 100 μmol /L的皮质酮损伤细胞 48 h，加入
不同浓度的木豆叶醇提物及不同组分作用 24 h 后，
收集细胞上清液，按照说明书的方法测定 LDH 活
性。
2． 6 数据处理
应用 SPSS 17． 0 统计软件进行数据处理，实验
图 1 不同浓度皮质酮作用 PC12 细胞不同时间对存活率的影响
Fig. 1 The effect of corticosterone of different concentration on PC12 cell survival rate on different time
A． 12 h，B． 24 h，C． 48 h＊＊P ＜ 0． 01 与对照比较; * P ＜ 0． 05 与对照比较。＊＊P ＜ 0． 01 vs control; * P ＜ 0． 05 vs control．
1721Vol. 24 姜保平等: 木豆叶醇提物对皮质酮诱导的 PC12 细胞损伤的保护作用
数据以 x ± s表示，单因素 ANOVA( 方差分析) 方法
进行显著性检验。
3 结果
3． 1 不同浓度的皮质酮在不同时间对 PC12 损伤
的 MTT测定结果
实验结果显示皮质酮对 PC12 细胞的损伤程度
随浓度和时间呈依赖性上升，10 μmol /L 和 100
μmol /L浓度的 CORT作用 PC12 细胞 12 h 时，其细
胞存活率分别为 94． 3%和 89． 8%，作用 24 h 后分
别下降为 92． 6%和 86． 9%，至 48 h 后，其细胞存活
率 72． 6%和 47． 5%。详见图 1。因此，本研究中采
用 100 μmol /L CORT 作用 48 h 建立 PC12 损伤模
型。
3． 2 木豆叶醇提物对皮质酮诱导 PC12 细胞形态
的影响
形态学结果显示，100 μmol /L的皮质酮与 PC12
细胞孵育 48 h 后，细胞形态发生了显著的变化，表
现为突起断裂，包膜不完整，胞体膨胀，胞核固缩
( 详见图 2a，2b) ; 再加入不同浓度的木豆叶醇提物
对细胞损伤有一定的逆转作用( 详见图 2c，2d) 。
图 2 木豆叶粗提物对皮质酮诱导的 PC12 细胞神经毒性的
保护作用形态学观察( × 40)
Fig. 2 Protective effect of alcohol extract of C． cajan on conti-
costerone-induced lesion in cultured PC12 cells mor-
phological observation ( × 40)
a．对照; b．模型( 100 μmol /L的皮质酮) ; c． 100 μmol /L皮质酮 +木
豆叶乙醇提取物 ( 50 mg /L) ; d． 100 μmol /L皮质酮 +木豆叶乙醇提
取物 ( 25 mg /L) a． control; b． model ( 100 μmol /L conticosterone) ; c．
100 μmol /L conticosterone + alcohol extract of C． cajan ( 50 mg /L) ; d．
100 μmol /L conticosterone + alcohol extract of C． cajan ( 25 mg /L)
3． 3 木豆叶醇提物及不同组份对皮质酮损伤的
PC12 细胞存活力影响
MTT结果显示木豆叶醇提物、石油醚洗脱部位
和乙酸乙酯洗脱部位在 100 ～ 12． 5 mg /L 对皮质酮
损伤的细胞表现出明显的保护作用，50 mg /L 达到
最大值; 二氯甲烷部位在 50 ～ 12． 5 mg /L 有明显的
保护作用;而乙醇部位在 200 ～ 12． 5 mg /L均表现出
明显的活性且其活性的大小有明显的剂量依赖关
系。然而，高浓度 ( 200 mg /L) 的木豆叶醇提物、石
油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位对细胞产
生明显的毒性作用。详见表 1。
表 1 木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮损伤 PC12 细胞的
保护作用( n = 5)
Table 1 Protective effect of the alcohol extract and its fractions
from C． cajan on corticosterone-induced lesion in cul-
tured PC12 cells ( n = 5)
组别 Group 剂量 Dose( mg /L) A570 nm
空白对照 Control – 0． 6745 ± 0． 03845
模型 Model – 0． 4457 ± 0． 0383＊＊
木豆叶醇提物 CC 200 0． 2844 ± 0． 0084# #
100 0． 9986 ± 0． 0524# #
50 1． 1196 ± 0． 1331# #
25 0． 9314 ± 0． 0264# #
12． 5 0． 8640 ± 0． 0296#
石油醚部位 PEP 200 0． 2016 ± 0． 0316# #
100 0． 2082 ± 0． 0467# #
50 0． 7454 ± 0． 0590# #
25 0． 6334 ± 0． 0896# #
12． 5 0． 6852 ± 0． 0543# #
二氯甲烷部位 DMP 200 0． 1802 ± 0． 0022# #
100 0． 2613 ± 0． 0939# #
50 0． 5593 ± 0． 0481#
25 0． 6394 ± 0． 0339# #
12． 5 0． 5650 ± 0． 0328#
乙酸乙酯部位 EAP 200 0． 1796 ± 0． 0108# #
100 0． 6976 ± 0． 0816# #
50 0． 7340 ± 0． 0593# #
25 0． 5858 ± 0． 0495#
12． 5 0． 5884 ± 0． 0738#
乙醇部位 EP 200 1． 0432 ± 0． 0651# #
100 0． 8830 ± 0． 0421# #
50 0． 6866 ± 0． 096# #
2721 天然产物研究与开发 Vol. 24
25 0． 5526 ± 0． 0182
12． 5 0． 5308 ± 0． 0382
3． 4 LDH活性的测定
乳酸脱氢酶( LDH) 释放法，进一步证实木豆叶
醇提物及不同组分对皮质酮损伤的 PC12 有细胞保
护作用。木豆叶醇提物 100 ～ 12． 5 mg /L、石油醚部
位 50 ～ 12． 5 mg /L、二氯甲烷部位 50 ～ 12． 5 mg /L、
乙酸乙酯部位 50 ～ 12． 5 mg /L 和乙醇部位 100 ～ 50
mg /L处理 24 h，能显著的降低了 LDH的释放率，结
果见图 3。
图 3 木豆叶醇提物及不同组分对皮质酮诱导的 PC12 细
胞 LDH释放率的影响( n = 5)
Fig. 3 The effect of the alcohol extract and its fractions from
C． cajan on LDH level of corticosterone-induced PC12
cells on different concentrations ( n = 5)
注: ＊＊P ＜ 0． 01 与对照比较; * P ＜ 0． 05 与对照比较; # #P ＜ 0． 01
与模型比较; #P ＜ 0． 05 与模型比较
Note: ＊＊P ＜ 0． 01 vs control; * P ＜ 0． 05 vs control; # # P ＜ 0． 01 vs
model; #P ＜ 0． 05 vs model．
4 讨论
本研究采用高浓度皮质酮损伤体外培养的
PC12 细胞，模拟慢性心理应激抑郁时糖皮质激素升
高的状态作为抗抑郁药的筛选模型。结果表明，当
皮质酮浓度为 100 μmol /L，作用 48 h，PC12 细胞生
长状态差，悬浮细胞明显增多，细胞存活率低于正常
细胞，可以在一定程度上体现抑郁模型的病理特征。
本研究采用皮质酮损伤的 PC12 作为筛选模
型，以 MTT和 LDH两种方法检测，研究木豆叶醇提
物及不同组分对细胞损伤的保护作用，结果表明在
浓度 ( 50 mg /L ) 各个部位不但能逆转皮质酮对
PC12 细胞造成的损伤，且能促进细胞的增殖，并且
发现醇提物的活性最好。
木豆叶主要含芪类和黄酮类化合物［7，8］。而芪
类化合物主要含木豆素、木豆素 A、木豆素 C等脂溶
性成分，黄酮类化合物以木犀草苷、牡荆苷等水溶性
成分为主。本研究石油醚洗脱部位、二氯甲烷洗脱
部位和乙酸乙酯洗脱部位主要含芪类等脂溶性成
分，而乙醇部位以水溶性黄酮为主。近年来研究表
明，芪类化合物具有抗骨质疏松、降血脂和改善阿尔
茨海默病( Alzheimer Disease，AD) 模型大、小鼠的学
习记忆能力和对神经细胞的保护作用［5］，黄酮类化
合物还具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗感染、抗抑郁等作
用［9，10］。本研究结果也表明木豆叶的芪类和黄酮类
可能都对皮质酮损伤的 PC12 细胞均有保护作用。
而醇提物中既含有芪类成分，又含有黄酮类成分，可
能由于各有效成分间的协同作用，表现出更好的效
果。
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3721Vol. 24 姜保平等: 木豆叶醇提物对皮质酮诱导的 PC12 细胞损伤的保护作用
表 3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance of orthogonal array design experimental results
方差来源
Source of
variation
离差平方和
Sum of squares
自由度
Degree of
freedom
均方
Mean square
F值
F Value
P值
P Value
A 0． 9969 2 0． 4983 9969． 3333 0． 0001
B 0． 33282 2 0． 1664 3328． 0000 0． 0001
C 0． 0985 2 0． 0493 985． 3333 0． 0001
D 0． 1785 2 0． 0893 1785． 3333 0． 0001
误差( Error) 0． 0005 9 0． 0001
由正交试验结果和方差分析综合分析可知，长
白山刺五加果实总皂甙超声提取最佳工艺参数为料
液比 1∶ 20、乙醇体积分数 70%、超声波功率 450 W、
超声提取时间 50 min。各因素对总皂甙提取效果影
响的权重依次为料液比 ＞超声波功率 ＞乙醇体积分
数 ＞超声提取时间。
3 结论
3． 1 将超声波提取应用于长白山野生刺五加果实
中粗总皂甙含量的提取和测定，测得刺五加总皂甙
含量为 3． 57 mg /g。如采用单纯的溶剂浸提法测得
总皂甙的含量为 2． 12 mg /g，因此超声波辅助提取
应用于此效果良好。
3． 2 正交试验结果显示各因素对总皂甙的提取影
响顺序依次为料液比 ＞超声波功率 ＞乙醇体积分数
＞超声提取时间。因此长白山野生刺五加果实总皂
甙提取的最佳工艺为料液比 1 ∶ 20、乙醇体积分数
70%、超声波功率 450 W、超声提取时间 50 min。该
提取方法简便、快捷，可用于长白山野生刺五加果实
总皂甙提取和测定。
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櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵
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