全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 1期，第 101-104页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.1, 101-104
实验技术
Experimental Technology
甜叶菊 RNA分离方法研究
郭书巧 倪博 郑卿 倪万潮 *
江苏省农业科学院生物技术所,南京, 210014
*通讯作者, niwc@yahoo.cn
摘 要 甜叶菊组织中酚类、萜类和多糖等代谢产物含量较高，RNA难分离，易降解，使用现有的方法提取甜叶
菊组织 RNA产率低、质量差，无法应用于实验操作。本文针对甜叶菊组织次生代谢物多的特点，以传统的 CTAB
法(cetyl trimethyl ammonium bromide)为基础，分别采用不同的方法进行 RNA抽提和纯化。结果发现采用
CTAB-LiCl法提取的 RNA完整性好，且纯度高；传统的 CTAB法提取的 RNA完整性好，但有 DNA和其它杂
质的污染；高盐溶液法提取的 RNA降解比较严重，同时还有杂质污染。结论说明 CTAB-LiCl法适用于多糖类植
物 RNA的分离。
关键词 甜叶菊, RNA提取方法, CTAB, CTAB-LiCl
Methods of RNA Isolation from Stevia Rebaudian
Guo Shuqiao Ni Bo Zheng Qing Ni Wanchao *
Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, 210014
* Corresponding author, niwc@yahoo.cn
Abstract There are many kinds of secondary metabolites richly such as polyphenol, terpenoid, polysaccharide and
so on, in the Stevia rebaudian, that making separation of RNA to be quite difficult. So conventional RNA extraction
methods have been shown to produce poor qua1ity RNA with low yields from S. rebaudian tissues. In this paper,
based on conventional CTAB for isolation of RNA, several kinds of methods of RNA extraction and purification
were performed. The results showed that RNA isolated by CTAB-LiCl method has the characteristic of good in-
tegrity and high purity, RNA isolated by conventional CTAB method has good integrity and includes genomic
DNA and other pollutants, RNA isolated by high salt solution method was degraded seriously and contains other
impurity. So CTAB-LiCl method of RNA isolation is applicable to the plants with secondary metabolites richly.
Keywords Stevia rebaudian, RNA, extraction, CTAB, CTAB-LiCl
基金项目：本研究由江苏省博士后科研资助计划(0701021B)和江苏省农业科学院博士后科研资助计划(005036510701)资助
甜叶菊(Stevia rebaudian)为富含甜菊苷类物质
的多年生菊科草本植物。随着分子生物学研究的不
断深入，探索快速而有效的 RNA提取方法，从甜叶
菊不同组织中获得高质量的 RNA成了研究的关键，
也可为进一步的研究如构建 cDNA文库、RT-PCR、
Northern杂交、基因芯片等奠定基础。目前提取植物
RNA常用的方法有异硫氰酸胍一步法(Chomezynski
and Sacchi, 2006)、SDS/酚抽提法(夏兰芹和郭三堆,
2000)、皂土法(张容等, 2006)、商品化试剂盒法等，
但是没有哪一种方法能够适用于各种植物或同种植
物不同组织的 RNA提取。由于甜叶菊组织中含有大
量的多糖、多酚、萜类等物质，在组织裂解过程中，酚
类物质会释放出来，氧化后与 RNA稳定的结合；多
糖容易形成难溶的胶状物与 RNA共同沉淀；同时萜
类化合物会造成 RNA的化学降解等(李宏和王新力,
1999)，用上述方法提取的 RNA得率较低，杂质含量
高，难以满足后续实验的需要。因此能否有效地去除
多糖、酚类、萜类化合物、RNase和其它代谢产物的
干扰是提取高质量 RNA的关键。本研究以传统的
CTAB法(Clark, 1998)为基础，采用高盐溶液(Schick
and Eras, 1995)和 LiC1 沉淀(萨姆布鲁克和拉塞尔,
2002)等不同的方法对 RNA抽提和纯化，找到了一
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套适用于甜叶菊高质量 RNA分离和纯化的方法。
1材料与方法
1.1供试材料
试验所用叶片均取自甜叶菊守田 3号植株新鲜
组织。
六烷基三甲烷(cetyltrimethyl ammonium bromide,
CTAB)、焦碳酸乙酯 (diethyl pyrocarbonate, DEPC)、
β- 巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)、溴代十聚乙烯吡
咯烷酮(Polywiny Pyrro-lidoneK30, PVP K30)、三羟基
甲烷(TRIS)、乙二胺四乙酸(ethylenediamine teraacetic
acid, EDTA) 和其它常规试剂等均购自上海生工，为
分析纯试剂。
1.2传统 CTAB法
(1)研磨及裂解：取甜叶菊叶片约 100 mg，放入研
钵中，加入液氮研磨成细粉，转入 1.5 mL的离心管中，
加入 700 μL提取缓冲液：2% CTAB (W/V)，2% PVP
K30 (W/V)，100 mmol/L Tris-HC1 (pH 8.0)，20 mmol/L
Sodium-EDTA (pH 8.0)，1.4 mmol/L NaC1，2% β- 巯
基乙醇，剧烈震荡混匀。50℃水浴 20 min，中途混和
2~3次，使 RNA充分析出。(2) 12 000 ×g离心 10 min，
转移上清液于另一离心管内，加入等体积的酚:氯仿:
异戊醇(25:24:1)，混匀，12 000×g离心 10 min。(3)上
清液转移至新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，
12 000×g离心 10 min。(4)上清液转移到新的离心管
中，加入 2倍体积预冷的无水乙醇，冰浴放置 30 min，
12 000×g离心 10 min。(5)弃上清液，用 75%乙醇洗
涤，自然干燥，用 50μL无 RNase水溶解，-70℃保存。
1.3高盐溶液法
(1)样品的研磨及裂解同传统 CTAB法。(2)加入
等体积氯仿充分混匀，冰浴 10 min，4℃，8 000×g离心
20min，将上清液移至新的离心管。(3)加入 1/4体积的异
丙醇和 1/4体积的高盐溶液(1.2mol/LNaCl, 0.8mol/L
柠檬酸二钠)，室温静置 10min，12 000×g离心 10min，
弃去上清。(4)沉淀用 75%乙醇洗涤，自然干燥，然后用
50 μL无 RNase水溶解，-70℃保存。
1.4 CTAB-LiC1法
该法是在传统的 CTAB法基础上，结合 LiC1沉
淀总 RNA，其操作步骤如下：(1)样品的研磨、裂解同
传统 CTAB法。(2)加入等体积氯仿充分混匀，冰浴
10 min，4℃，8 000×g离心 20 min，将上清液移至新
的离心管。(3)在上清液中加入 LiC1溶液直至终浓度
为 3mol/L，-20℃，静置沉淀 2 h以上。(4) 4℃，12 000×g
离心 20min，弃上清液，加 500μL无 RNase水溶解沉
淀，加入 500μL水饱和酚和氯仿(1:1)，冰浴 5min。(5)
4℃，12 000×g离心 10 min，取上清液，加入 500 μL氯
仿，冰浴 5min。(6) 4℃，12 000×g离心 10 min，取上清
液，加入 LiC1溶液至终浓度约为 0.8mol/L和 3倍体
积的无水乙醇，-20℃静置沉淀 2 h。(7) 4℃，12 000×g离
心 10min，弃上清，自然干燥，用 50μL无 RNase水溶
解，-70℃保存。
1.5 RNA浓度和完整性检测
取 2 μL提取的 RNA溶液于 1.5%的普通琼脂
糖胶上电泳，EB染色后于紫外灯下观测 RNA的纯
度及完整性。取 2 μL的 RNA稀释至 50 μL，用紫外
分光光度计(Backman)分别测波长 230 nm、260 nm、
280 nm的 OD值，估测 RNA浓度和纯度。
样品浓度计算公式：RNA浓度=OD260×40×稀释
倍数(μg/mL)。
2结果分析
2.1 RNA的完整性
用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测所提取 RNA的完
整性，结果见图 1。由图中可以看出，采用传统 CTAB
法提取的 RNA，28S RNA条带比 18S条带亮度强，
表明提取的 RNA完整性较好，但是在点样孔及其下
方都有明显的亮带，说明提取的 RNA中可能存在基
图 1甜叶菊叶片 RNA凝胶电泳图
注: 1~2: CTAB法; 3~4:高盐溶液法; 5~6: CTAB-LiC1法
Figure 1 Agarose gel e1ectrophoresis of total RNA samples from
Stevia rebaudian 1eaves
Note: 1~2: CTAB method; 3~4: High salt solution method; 5~6:
CTAB-LiCl method
102
因组 DNA和其他杂质污染；高盐溶液法提取物电泳
检测可见 28S RNA条带亮度比 18S RNA条带亮度
弱，说明该法提取的 RNA降解比较严重，同时还可
以看到泳道及加样孔处都有明显的杂质污染；
CTAB-LiC1 法提取物电泳检测可见 28S、18S RNA
条带清晰明亮，28S条带荧光亮度约是 18S条带的
1.5~2.0倍，表明提取的总 RNA完整性好，纯度高，
没有明显的多糖、蛋白等杂质污染。
2.2 RNA浓度和纯度
分别取 2 μL的 RNA稀释后，用紫外分光光度
计测其波长 230 nm、260 nm、280 nm的 OD值，计算
RNA的浓度和纯度，结果见表 1，其中所列数据均为
平均值。
230 nm、260 nm和 280 nm下的吸光度值依次代
表了盐类、核酸和蛋白等有机物的含量。高纯度 RNA
溶液的 OD260/OD280应介于 1.8~2.0 之间，D260/D230大
于 2.0 (萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)。由表 1可以看
出，采用高盐溶液、CTAB-LiC1 法提取 RNA 的
OD260/OD280值分别为 1.737 4和 2.0，D260/D230比值依
次为 1.966 2、2.148 4，说明采用 CTAB-LiC1法提取
的 RNA样品中既没有蛋白质、多糖等杂质又不存在
盐类污染，而高盐溶液法提取的 RNA的纯度低于
CTAB-LiC1法；采用传统的 CTAB法提取的 RNA的
OD260/OD280、D260/D230分别为 1.645 4和 2.103 8，说明
可能存在蛋白等杂质污染比较严重。
方法
Methods
CTAB
高盐溶液
High salt solution method
CTAB-LiC1
3讨论
甜叶菊叶片中富含甜菊醇糖苷类物质，是一类
天然甜味剂，甜度为蔗糖的 150~300倍，而热量仅为
蔗糖的 1/300，甜味好，特别适合三高人群(Kovylyae-
va et al., 2007)。不但无副作用，而且能辅助治疗某些
疾病。随着目前基因工程技术研究的不断发展，甜叶
菊组织中总 RNA提取显得尤为重要。由于甜叶菊组
织中萜类、酚类和多糖等次生代谢物含量较高(倪万
潮和郭书巧, 2008; Kovylyaeva et al., 2007)，严重干
扰了 RNA的有效分离，不利于用于进一步的分子生
物学研究。因此，有效去除萜类、酚类、多糖、蛋白质、
RNase 和其他次生代谢产物是提取甜叶菊组织总
RNA成败的关键。
在高强度离子溶液中，CTAB 与蛋白质和部分
多糖可形成复合物(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)，因
此对于富含多糖多酚类的植物材料，以 CTAB为阳
离子表面活性剂，同时在提取缓冲液中加入可以防
止酚类物质氧化的 PVP以及 β- 巯基乙醇，PVP能
与酚类化合物稳定的结合并在以后的抽提步骤中
与 CTAB形成的复合物一起被除去，应用这种方法
可以从柿果、棉花(山蓝等, 2002; 胡根海和喻树迅,
2007)等植物材料中提取高质量的 RNA。但是我们
采用传统 CTAB法提取甜叶菊叶片的总 RNA，结果
显示 RNA完整性较好，但有基因组 DNA和蛋白质
等杂质的污染(图 1)；甜叶菊叶片裂解液用氯仿抽
提以后，采用 Schick和 Eras (1995)报道的高盐溶液
来沉淀水相中的 RNA，发现提取的 RNA中，虽然没
有基因组 DNA的污染，但 RNA 降解严重，且除点
样孔外，还有小分子杂质污染。
LiCl是强脱水剂，可以降低 RNA的溶解性，通
过 LiCl沉淀 RNA可以将多糖及未氧化的酚类留在
上清液中而去除(萨姆布鲁克和拉塞尔, 2002)，实验
中我们在氯仿抽提后采用 3 mol/L LiCl沉淀 RNA以
去除多糖和酚类，之后再用酚和氯仿混合液以及氯
仿抽提以去处残留的多糖、蛋白等杂质，最后经过
0.8 mol/L LiCl 和无水乙醇沉淀 RNA，经过以上步
骤，基本上可以去除 RNA溶液中全部杂质，得到完整
而纯净的 RNA样品。说明 CTAB-LiC1法比较适合多
糖、多酚类植物材料的 RNA分离。本实验室采用
CTAB-LiC1法成功的分离了甜叶菊的总 RNA，并利
用 RT-PCR的方法成功的克隆了贝壳杉烯酸 C-13羟
基化酶(KAH)和 UDP- 糖基转移酶(UGT76G1)基因
的 cDNA序列。
表 1不同方法提取的甜叶菊叶片组织总 RNA纯度及产量的比较
Table 1 Comparison of total RNA purity and quantity in Stevia rebaudian leaves by different methods
OD260
0.160 1
0.168 7
0.156 4
OD280
0.097 3
0.097 1
0.078 2
OD230
0.076 1
0.085 8
0.072 8
OD260/OD280
1.645 4
1.737 4
2.000 0
OD260/OD230
2.103 8
1.966 2
2.148 4
RNA浓度(μg/mL)
RNA concentrations (μg/mL)
160.1
168.7
156.4
甜叶菊 RNA分离方法研究
Methods of RNA Isolation from Stevia Rebaudian 103
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology www.genoapplbiol.org
参考文献
Chomezynski P., and Sacchi N., 2006, The single-step method of
RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlo-
roform extraction: twenty-something years on, Nature Proto-
cols, 1: 581- 585
ClarkM.S., ed, GuH.Y., Zhai L.J., ZhengH.H., Hu P., Zhou B.Y., Li
D.H., Lin J.A., Wu X.M., and Sun S.Q., trans., 1998, Plant
molecular biology, A laboratory manual, Higher Education
Press, Beijing, China, pp.4-7 (克拉克 M.S.,主编,顾红雅,
翟礼嘉,郑宏红,胡苹,周北雁,李东辉,林金安,吴雪梅,
孙素青,主译, 1998,植物分子生物学实验手册,高等教育
出版社,中国,北京, pp.4-7)
Hu G.H., and Yu S.X., 2007, Extraction of high-quality total
RNA in cotton leaf with improved CTAB method, Mianhua
Xubao (Cotton Science), 19(1): 69-70 (胡根海,喻树迅, 2007,
利用改良的 CTAB法提取棉花叶片总 RNA, 棉花学报,
19(1): 69-70)
Kovylyaeva G.I., Bakaleinik G.A., Strobykina I.Y., Gubskaya V.I.,
Sharipova R.R., Alfonsov V.A., Kataev V.E., and Tolstikov
A.G., 2007, Glycosides from Stevia rebaediana, Chemistry
of Natural Compounds, 43(1): 81-85
Li H., and Wang X.L., 1999, The difficulties in the isolation of
RNA from plant tissues and their resolving strategies,
Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), 1: 36-39
(李宏,王新力, 1999,植物组织 RNA提取的难点及对策,
生物技术通报, 1: 36-39)
Ni W.C., and Guo S.Q., 2008, Advances on the steviol glycoside
biosynthesis and its key enzymes, Shengwu Jishu Tongbao
(Biotechnology Bulletin), 2: 48-53 (倪万潮,郭书巧, 2008,
甜菊醇糖苷生物合成及关键酶研究进展,生物技术通报,
2: 48-53)
Sambrook J., and Russell D.W., eds., Huang P.T., Wang J. X., Zhu
H.C., Zhang Z.S., Chen H.P., Fan M., Yu W.Y., and He F.C.,
trans., 2002, Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd,
Science Press, Beijing, China, pp.66-67, 1688 (萨姆布鲁克 J.,
拉塞尔 D.W.,主编,黄培堂,王嘉玺,朱厚础,张兆山,陈
惠鹏,范明,俞炜源,贺福初,主译, 2002,分子克隆实验指
南,第 3版,科学出版社,中国,北京, pp.66-67, 1688)
Schick B.P., and Eras I., 1995, Proteoglycans partially co-purify
with RNA in TRI reagent and can be transferred to filters by
northern blotting, Biotechniques, 18(4): 574-576, 578
Shan L., Wang B.L., and Zhang J.S., 2002, Method for isolating
functional RNA from the ripening persimmon fruit contented
rich polysaccharides and polyphenolics, Zhiwu Shenglixue
Tongxun (Plant Physiology Communications), 38(5): 463-465
(山蓝,王保莉,张继澍, 2002,从富含多糖和多酚的柿果
中提取具转录活性 RNA的方法,植物生理学通讯, 38(5):
463-465)
Xia L.Q., and Guo S.D., 2000, A method of RNA fast extracing
in cotton tissue, Mianhua Xubao (Cotton Science), 12 (4):
205-207 (夏兰芹,郭三堆, 2000,棉花 RNA的快速提取方
法,棉花学报, 12(4): 205-207)
Zhang R., Zheng Y.F., Wu Y., Wang S.H., and Ohen F., 2006, A
simple and efficient method for preparation of plant RNAs,
Yichuan (Heredity), 28(5): 583-586 (张容 , 郑彦峰 , 吴瑶 ,
王胜华, 陈放, 2006, 一种简单有效的植物 RNA 提取方
法,遗传, 28(5): 583-586)
104