全 文 ：第 45卷第 4期 中南大学学报(自然科学版) Vol.45 No.4
2014年 4月 Journal of Central South University (Science and Technology) Apr. 2014

细柱五加叶中色素的超声辅助提取工艺及其体外实验研究

刘恒言 1，李芝 1，刘向前 1, 2，戴玲 1，邹亲朋 2

(1. 湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙，410208；
2. 中南大学 制药工程系，湖南 长沙，410083)

摘要：为优化超声波辅助提取细柱五加叶中色素条件，并探索其细胞毒性和抗炎活性，研究考察提取次数、料液
比、提取时间、提取温度及超声波功率 5个因素对细柱五加叶中色素提取率的影响，并运用响应面法对其超声提
取工艺条件进行优化，得到其最佳提取条件为：在超声波频率为 40 kHz、功率为 130 W、液料比为 1:10、提取温
度为 64 ℃的条件下，用 95%乙醇连续提取 3次，每次 27 min，其理论提取率为 0.373 7%，实际提取率为 0.370 8%；
通过体外试验对该法提取的总色素的抗炎活性和细胞毒性进行初步研究，发现其对 LPS诱导 RAW 264.7细胞所
产生的 NO具有较好抑制能力但在一定剂量范围内具有细胞毒性。
关键词：超声辅助提取；体外试验；细柱五加；色素；响应面法；提取率
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1672−7207(2014)04−1034−09

Studies on process of ultrasonic-assisted extraction of pigments from
leaves of Acanthopanax gracilistylus and their bioassays in vitro

LIU Hengyan1, LI Zhi1, LIU Xiangqian1,2, DAI Ling1, ZOU Qinpeng2

(1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;
2. Department of Pharmaceutical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China)

Abstract: To optimize the conditions of the ultrasonic-assisted extraction of pigments from leaves of Acanthopanax
gracilistylus W. W. Smith and to investigate further whether the pigments could have cytotoxicity and anti-inflammatory
activities, an ultrasonic-assisted procedure was investigated using response surface methodology (RSM). The effects of
five factors on the yield of pigments were studied. The optimized conditions were as follows: extraction temperature 64
℃, ultrasonic frequency 40 kHz, ultrasonic power 130 W, ratio of solid to liquid 10:1 and extracted three times with 95%
ethanol, each for 27 min. Under the proposed conditions, the experimental yield of pigments was 0.370 8%, which was
well matched with the predictive yield of 0.373 7%. Anti-inflammatory activities and cytotoxicity experiments of total
pigments extracted by this method are preliminary studied in vitro, which display better NO inhibitory abilities in
LPS-induced RAW 264.7 cells and have cytotoxicity in a certain dose.
Key words: ultrasonic-assisted extraction; in vitro test; A. gracilistylus W. W. Smith; pigments; response surface
methodology (RSM); extraction rate


色素是食品加工生产中必不可少的原料，主要分
为人工合成色素和天然色素两大类。近二十年来由于
合成色素的毒性不断被发现，特别是苏丹红等食品色
素问题的出现，合成色素的使用日趋减少。与人工合
成色素相比，天然色素来源于生物体，着色自然，安
全性相对较高，加之其本身亦具有一定的营养和药用
价值，已广泛应用于食品加工中[1]。然而，食品安全
越来越受到全社会的关注，为了保证食品安全，在天
然色素添加剂的研制开发、加工及与食品的配合应用
过程中必须加强它的活性及毒性研究，保证其使用安

收稿日期：2013−05−07；修回日期：2013−07−10
基金项目：湖南省研究生科研创新项目(CX2011B348)；湖南省自然科学基金重点资助项目(11JJ2042)；湖南中医药大学药物分析学“十二五”校级重
点学科建设项目(2012(2))
通信作者：刘向前(1967−)，男，湖南长沙人，博士，教授，从事中药化学与分析、天然产物活性成分和生药活性成分与质量评价研究；电话：
0731-88458228；E-mail：lxq0001cn@163.com
第 4期 刘恒言，等：细柱五加叶中色素的超声辅助提取工艺及其体外实验研究 1035

全，如具有抗炎作用的姜黄素[2]、茶色素[3]等天然色素
在使用时也存在安全隐患，都必须严格注意。天然色
素的稳定性较差，为保持其生理活性，提取时一般应
使用较为温和的工艺条件。超声波是一种弹性波，能
产生并传递强大的能量，方向性好，穿透能力强，停
留时间长，用于固液提取过程可使细胞周围和细胞内
产生环流，从而提高细胞壁和细胞膜的通透性，有利
于植物中有效成分的转移、扩散及提取[4]。采用传统
的有机溶剂提取法需要耗费大量有机溶剂和时间才能
提取完全，而超声波在溶剂中产生的强烈振动、空化
效应、搅拌作用等可提高提取率，有效缩短提取时间，
具有明显优势[5−7]。响应面分析方法是研究几种因素间
交互作用的回归分析方法，克服了正交设计只能处理
离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组
合和响应值的最优值的缺陷 [8−10]。细柱五加
(Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)是五加科
(Araliaceae)五加属植物，主要分布于我国湖南、安徽、
湖北等地，以根皮入药，历次《中国药典》均以“五加
皮”收载，具有祛风除湿，强壮筋骨，活血去瘀，利水
消肿的功效[11]。近年来国内外正全方位开发该属植
物，包括根、茎、叶和果实等，研究发现该属植物中
含有三萜类、黄酮类、多糖等多种生理活性物质[12−18]，
被广泛的作为香料和医药品开发。然而在提取分离这
些生理活性物质时，通常将石油醚萃取部位的色素丢
弃。若能在提取活性物质的同时将色素提取分离，既
能避免资源浪费，又能带来一定的经济利益。孙海涛
等[19]对安全性高、色调柔合并具有一定营养、保健作
用的刺五加浆果色素的超声提取工艺进行优化，不仅
大幅度提高长白山野生刺五加的附加值，更解决其果
渣浪费的问题；冯颖等[20−21]对无梗五加果色素进行提
取及稳定性研究，旨为找出影响五加果色素稳定性的
因素，采取相应的方法提高其稳定性，为五加果色素
应用提供一定的合理建议和方法，加快五加果天然色
素的市场应用。本文作者采用超声波提取法辅助提取
细柱五加叶色素，以响应面法确定其最佳提取工艺；
并采用MTT法测定色素总提取物对 RAW 264.7细胞
毒性作用以及对LPS诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞
株炎症模型反应中细胞上清液的 NO含量影响。以期为
安全、综合利用五加科植物资源提供科学的实验依据。

1 实验

1.1 试药与仪器
试药有：细柱五加叶，2011年 8月采于湖南长沙，
经湖南中医药大学药学院刘向前鉴定为 A.
gracilistylus W. W. Smith的叶，经干燥，粉碎，过孔径
365 μm筛备用，标本存放于湖南中医药大学中药现代
化实验室(标本号为 110829)；95%乙醇、石油醚(天津
恒兴化学试剂制造有限公司)，丙酮、氯仿(长沙湘科
精细化工厂)，蒸馏水(实验室自制)，所有试剂均为分
析纯；RAW 264.7巨噬细胞株由韩国细胞株银行供应，
DMEM 培养基、新生牛血清(FCS)(美国 Invitrogen 公
司)，青链霉素、胰酶、MTT细胞毒性分析试剂盒(美
国Life Technologies, Grand Island公司)，Griess试剂(美
国 Sigma公司)。
仪器有：KQ−250DE型数控超声波清洗器(昆山市
超声波仪器有限公司)；循环水式真空泵、RE−201D
型旋转蒸发仪 (巩义市予华仪器责任有限公司 )；
FA−2104 电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公
司)；UV−1750 型紫外可见分光光度计(日本岛津公
司)；超净工作台(美国 LABCONCO公司)；Eppendorf
离心机、低温离心机(德国 Beckman公司)；二氧化碳
培养箱、−70 ℃超低温冰箱(美国 Thermo 公司)，
Olympus 显微镜(日本理光)，96 孔板(美国 Corning
公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 提取溶剂的选择
取干燥细柱五加叶约 20 g，精密称定，分别以料
液比 1:10 (g:mL)加入氯仿、丙酮、石油醚、95%乙醇、
80%丙酮溶液，在温度 45 ℃，超声功率 180 W，频率
40 kHz的条件下连续提取 3次，每次 15 min，抽滤、
浓缩至浸膏、95%乙醇溶解定容至 1 000 mL，精密吸
取 20 mL再稀释至 100 mL(避光条件下进行)。
1.2.2 单因素实验
取干燥细柱五加叶约 20 g，精密称定，以 95%乙
醇作为提取溶剂，按照各种不同条件(液料比、超声波
功率、提取次数、温度、提取时间)进行超声波提取，
抽滤，滤渣经 95%乙醇多次洗涤后合并滤液，浓缩得
醇提浸膏，石油醚萃取，浓缩得石油醚浸膏(避光条件
下进行)。
(1) 料液比。料液比分别为 1:6，1:8，1:10，1:12
和 1:14，超声功率为 160 W、频率为 40 kHz、温度为
45 ℃的条件下提取 3次，每次 20 min，比较不同料液
比对色素提取率的影响。
(2) 超声时间。在料液比为 1:10、超声功率为 160
W、频率为 40 kHz、温度为 45 ℃的条件下分别以提
取时间 10，15，20，25和 30 min提取 3次，比较提
取时间对色素提取率的影响。
(3) 提取次数。在料液比为 1:10、超声功率为 160
中南大学学报(自然科学版) 第 45卷 1036
W、频率为 40 kHz、温度为 45 ℃的条件下分别提取 1，
2，3，4和 5次，每次 20 min，比较提取次数对色素
提取率的影响。
(4) 超声功率。在料液比为 1:10、超声功率分别
为 80，100，120，140和 160 W，频率为 40 kHz、温
度为 45 ℃条件下提取 3次，每次 20 min，比较超声
功率对色素提取率的影响。
(5) 超声温度。在料液比为 1:10、超声功率为 160
W，频率为 40 kHz，温度分别为 40，45，50，60 和
70 ℃的条件下提取 3次，每次 20 min，比较提取温度
对色素提取率的影响。
1.2.3 细柱五加叶提取液中的色素浓度测定和提取率
计算
从 1.2.2 中得到的浸膏用 95%乙醇溶解并定容至
1 000 mL，然后从中吸取 20 mL，以 95%乙醇定容至
100 mL，最后以叶绿体色素为标准，95%乙醇溶液为
参比液，运用修正的 Arnon法[22−24]可见分光光度法测
定其在指定波长处(波长 665，649 和 470 nm)的吸收
度，通过计算得出溶液的色素含量及细柱五加叶色素
的提取率。细柱五加叶色素提取液的色素质量浓度和
提取率按下式计算：
ρa=13.95A665−6.88A649
ρb=24.96A649−7.32A665
ρx+c=(1 000A470−2.05ρa−114.8ρb)/245
Y=[(ρa+ρb+ρx+c)×500×10−6/M]×100%
式中：ρa，ρb和 ρx+c分别为叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝
卜素和叶黄素的质量浓度，μg/mL；Y为细柱五加叶色
素提取率，%，；M为细柱五加叶粉末质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素实验
2.1.1 提取溶剂的选择
图 1所示为不同溶剂对细柱五加叶色素的超声提
取的影响。由图 1可知：不同溶剂对细柱五加叶色素
的提取率由高到低依次为：95%乙醇、80%丙酮、丙
酮、氯仿、石油醚。95%乙醇较其他溶剂提取率高，
安全、危害性小，价格便宜且易于生产。综合经济、
环境、安全、效率等多方面考虑，本实验选取 95%乙
醇作为细柱五加叶色素超声提取的提取溶剂。
2.1.2 提取次数对色素提取率的影响
图 2所示为提取次数对细柱五加叶色素的提取率
的影响。由图 2可知：在相同条件下提取 3次的提取
率最高，次数增多且出现提取率下降的趋势，说明随
着提取次数的增多，色素分子可能在提取处理过程中
被氧化破坏，导致产率下降。所以在相同条件下对细
柱五加叶色素的超声提取以提取 3次最合适。


图 1 不同溶剂对细柱五加叶色素的超声提取的
影响
Fig. 1 Effect of solvent on extraction rate of
pigments


图 2 提取次数对细柱五加叶色素的提取率的影响
Fig. 2 Effect of extracting times on extraction rate of
pigments

2.1.3 提取时间对色素提取率的影响
图 3所示为提取时间对细柱五加叶色素的提取率
的影响。由图 3可知：细柱五加叶色素的超声提取率
与提取时间成正比，提取时间越长，色素的提取率就
越高，说明提取时间也是色素提取的一个重要影响因
素。但提取时间在 15 min以下时提取率随时间增加的
幅度大，在 15 min以上时增幅明显减小，25 min以后
提取率基本不变。主要原因是超声波提取时间过短，
不能有效地破坏细柱五加叶的细胞壁和细胞膜使色素
有效的溶出，而在长时间的超声作用下色素有可能会
第 4期 刘恒言，等：细柱五加叶中色素的超声辅助提取工艺及其体外实验研究 1037
因氧化而逐渐分解，造成损失。所以超声提取时间以
20 min为宜。


图 3 提取时间对细柱五加叶色素的提取率的影响
Fig. 3 Effect of extracting time on extraction rate of
pigments

2.1.4 料液比对色素的提取率的影响
图 4所示为料液比对细柱五加叶色素的提取率的
影响。由图 4可知：料液比对细柱五加叶色素提取率
的影响不大，在料液比为 1:10时细柱五加叶色素的提
取率最高，证明此时细柱五加叶色素已被全部提取出
来。理论上此时随着料液比增大，溶解出的色素量应
该不变，细柱五加叶色素的提取率也应为恒值，但在
整个提取过程中料液比越大，色素与光、氧气、热等
致使其变性的因素接触的机会也越大，使得损失也越
大，所以色素提取率在料液比大于1:10时有下降趋势。
因此，以料液比 1:10时超声提取细柱五加叶的色素最
合适。


图 4 料液比对细柱五加叶色素的提取率的影响
Fig. 4 Effect of ratio of solid to liquid on
extraction rate of pigments
2.1.5 超声功率对色素提取率的影响
图 5所示为超声功率对细柱五加叶色素的提取率
的影响。由图 5可知：超声波功率在 120 W时细柱五
加叶色素的超声提取率最高，超声功率在 120 W以下
时色素的提取率随超声功率的增加而增加，在 140 W
以上时则随超声功率的增加而减小。原因可能是当超
声波功率太低时，超声波的空化作用和局部高温太弱，
不能有效破坏细柱五加叶细胞壁和细胞膜使色素提取
不完全：但功率太高时超声波可能会造成色素的降解，
使细柱五加叶色素含量下降，进而使其提取率下降。
说明超声功率也是影响细柱五加叶色素提取率的因素
之一，而相同条件下超声功率 120 W时提取细柱五加
叶色素最适合。
2.1.6 提取温度对色素的提取率的影响
图 6所示为提取温度对细柱五加叶色素的提取率
的影响。由图 6可知：提取温度为 30~60 ℃时，色素
提取率随着温度升高，而逐渐上升；在 60 ℃时其提取


图 5 超声功率对细柱五加叶色素的提取率的影响
Fig. 5 Effect of power on extraction rate of
pigments


图 6 提取温度对细柱五加叶色素的提取率的影响
Fig. 6 Effect of temperature on extraction rate of
pigments
中南大学学报(自然科学版) 第 45卷 1038
率达到最高。其原因可能是细柱五加叶的色素主要存
在于叶绿体和液泡中，随温度升高溶剂的渗透力也不
断升高，溶剂更易透过细胞膜和细胞壁。虽然，一般
情况下物质的溶解度随温度的升高而增加的，但有研
究表明提取温度过高可能使色素结构发生改变，温度
越高，越容易变性，而在 50~70 ℃时较为稳定[25]。这
说明提取温度是色素提取的重要影响因素之一。从图
6可见：提取温度为 60 ℃时超声提取细柱五加叶色素
最适合，提取温度过高则可能引起叶绿素的分解或变
性，从而导致提取率的下降。
2.2 响应面优化细柱五加叶色素超声提取工艺参数
2.2.1 响应面分析水平的选取
根据 Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，
结合单因素试验结果，分别选择提取时间(X1)、超声
功率(X2)和提取温度(X3)作为自变量，以细柱五加叶色
素的提取率(Y)作为响应值，设计三因素三水平响应面
试验，因素和水平取值见表 l。

表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of experiment of RSM
因素水平 实验因素 −1 0 1
提取时间/min 20 25 30
超声功率/W 100 120 140
提取温度/℃ 40 55 70

2.2.2 响应面分析试验设计方案
以提取时间(X1)、超声功率(X2)和提取温度(X3)为
自变量，以细柱五加叶色素的提取率为响应值(Y)，进
行响应面分析实验。实验方案及实验结果见表 2。
2.2.3 多元二次响应面回归模型的建立与分析
对细柱五加叶色素提取时间(X1)，超声功率(X2)，
提取温度(X3)进行了三因素三水平响应面分析试验。
利用 Design Expert 8.0软件对表 2数据进行二次多元
回归拟合，得到细柱五加叶色素提取率预测值(Y)对编
码自变量 X1、X2、X3的二次多项回归方程：
Y=0.36−5.363×10−3X1+5.763×10−4X2+0.022X3+
3.6×10−3X1X2−6.175×10−3X1X3−1.750×10−3X2X3−
0.013X12+8.615×10−3X22−0.023X32
对上述回归模型进行方差分析(见表 3)，结果表明
该回归模型极显著(P=0.000 1＜0.01)。回归模型的决
定系数 R=0.994 6，校正决定系数 RAdj=0.987 7，
RPred=0.960 3，失拟项 P=0.515 9＞0.05不显著，信噪
比为 31.028远大于 4，说明该回归模型与实验数据拟
合程度很高，其响应值的变化有 99.46%来源于所选变
量，即提取温度、提取时间、超声功率。因此，回归
方程能很好地描述各因素与响应值之间的关系，可以
用该模型分析和预测超声波提取细柱五加叶色素的工
艺优化。
在回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由
F检验来判定，概率 P越小，则相应变量的显著程度
越高。回归模型中的一次项和二次项均为极显著，交
互项 X1X3极显著，表明各影响因素对提取率的影响并
不是简单的线性关系，3 个因素中对色素提取率影响
作用大小顺序为：提取温度，超声时间，超声功率。
2.2.4 细柱五加叶色素超声提取条件分析与优化
多元回归方程的三维图及其等高线见图 7~9，通
过动态图即可对任何两因素之间交互影响的效应进行
分析和评价，并从中确定最佳的水平范围。响应面是
响应值对各实验因索所构成的三维空间曲面图，因素
对实验结果影响越大，表现为曲面越陡峭。等高线的
形状则可以反映两两因素之间交互作用的显著程度，
圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之
相反。
由图 7~9的三维图和等高线可以看出：超声时间
与提取温度、超声时间与超声功率对色素提取率有着
显著的交互作用，而提取温度和超声功率对提取率的
交互作用不如前者显著，各因素与细柱五加叶色素提

表 2 响应面分析方案及试验结果
Table 2 Design and results of RSM
因素水平 试验号
X1 X2 X3
样品质量/g 提取率/%
1 −1 −1 0 20.012 9 0.332 9
2 1 −1 0 20.007 1 0.341 2
3 −1 1 0 20.008 2 0.339 3
4 1 1 0 20.014 1 0.355 7
5 −1 0 −1 20.012 9 0.306 2
6 1 0 −1 20.004 9 0.306 1
7 −1 0 1 20.038 1 0.340 2
8 1 0 1 20.017 0 0.364 8
9 0 −1 −1 20.011 0 0.303 8
10 0 1 −1 20.021 0 0.319 2
11 0 −1 1 20.012 1 0.346 9
12 0 1 1 20.016 0 0.363 0
13 0 0 0 20.003 0 0.363 6
14 0 0 0 20.016 1 0.361 4
15 0 0 0 20.028 0 0.365 9
16 0 0 0 20.003 9 0.365 7
17 0 0 0 20.014 0 0.368 3
第 4期 刘恒言，等：细柱五加叶中色素的超声辅助提取工艺及其体外实验研究 1039

表 3 响应面二次回归方差分析
Table 3 Analysis of variance for regression model
变异来源 均方和 自由度 平方和 F P
模型 8.385×10−3 9 9.316×10−4 143.76 ＜0.000 1
X1(时间) 3.026×10−4 1 3.026×10−4 46.69 0.000 2
X2(功率) 3.432×10−4 1 3.432×10−4 52.96 0.000 2
X3(温度) 4.032×10−3 1 4.032×10−3 622.18 ＜0.000 1
X1X2 1.640×10−5 1 1.640×10−5 2.53 0.155 6
X1X3 1.525×10−4 1 1.525×10−4 23.54 0.001 9
X2X3 1.225×10−7 1 1.225×10−7 0.02 0.894 5
X12 7.451×10−4 1 7.451×10−4 114.97 ＜0.000 1
X22 3.722×10−4 1 3.722×10−4 57.44 0.000 1
X32 2.104×10−3 1 2.104×10−3 324.63 ＜0.000 1
残差 4.536×10−5 7 6.480×10−6
失拟检验 1.825×10−5 3 6.085×10−6 0.90 0.515 9
纯误差 2.711×10−5 4 6.777×10−6
总误差 8.430×10−3 16


(a) 响应面；(b) 等高线
图 7 提取时间与超声功率交互作用对色素提取率影响的响应面和等高线
Fig. 7 Response surface and contours of interrelated influence of time and power to extraction rate of pigments


(a) 响应面；(b) 等高线
图 8 提取时间与温度交互作用对色素提取率影响的响应面和等高线
Fig. 8 Response surface and contours of interrelated influence of time and temperature to extraction rate of pigments
中南大学学报(自然科学版) 第 45卷 1040


(a) 响应面；(b) 等高线
图 9 超声功率与温度交互作用对色素提取率影响的响应面和等高线
Fig. 9 Response surface and contours of interrelated influence of power and temperature to extraction rate of pigments

取率的关系均清晰可见。根据 Box-Behnken实验所得
的结果和二次多项回归方程，利用 Design Expert 8.0
软件获得了提取率最高时的最佳超声波辅助提取条
件：超声时间为 26.7 min，提取温度 63.4 ℃，超声功
率为 128 W。在此优化条件下，细柱五加叶色素提取
率理论值为 0.3737%。考虑到实际操作的情况，在超
声时间为 27 min，提取温度 64 ℃，超声功率为 130 W
的条件下，进行了 5 次重复验证实验，5 次实验的提
取率分别为 0.369 7%，0.370 5%，0.371 3%，0.370 8%
和 0.371 6%，验证实验提取率的平均值为 0.370 8%，
与理论预测值误差仅为 0.029%，说明采用响应面法得
到的工艺参数较为可信，利用超声波法提取细柱五加
叶色素具有一定的可行性与应用价值。

3 体外抗炎活性

取上述细柱五加叶色素总提取物，测定其对 RAW
264.7细胞毒性作用和对 LPS诱导的 RAW 264.7小鼠
巨噬细胞中 NO分泌量的影响。
3.1 细胞培养及处理
将冻存的细胞株解冻后，用含 10%新生牛血清和
1%青链霉素的 DMEM 培养基于 5%CO2饱和湿度的
37 ℃条件下恒温培养箱培养，2~3 d换一次液，细胞
铺满培养瓶约 80%面积时，小心吸取培养基，PBS洗
涤，加入胰酶消化，按 1:5 左右的比例加培养液吹散
传代，继续培养。
3.1.1 MTT法初筛色素总提取物的细胞毒性
按 MTT 细胞毒性检测试剂盒操作。取生长状态
良好的 RAW 264.7 细胞用胰酶消化后，加入含 10%
FCS的DMEM培养基配成 1×106个/mL单细胞悬液，
接种于 96 孔板中，每孔约 1×104个细胞，5%CO2饱
和湿度的 37 ℃条件下恒温培养箱培养 4 h，然后换上
新鲜培养基 100 μL，按梯度浓度将色素总提取物分别
加入 96 孔板中(复孔，n=3)，使个目标化合物的最终
浓度分别为 10，20和 40 μg/mL，并设立空白对照。
24 h后，每孔加入 10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在细
胞培养箱内继续孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO
溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育，直至在普通光
学显微镜下观察发现 DMSO全部溶解，终止培养，震
荡反应 10 min。选择 570 nm波长比色，在酶联免疫
检测仪上测定各孔吸光度值[26]。以上实验重复三次，
实验数据以均数±标准差表示。采用 SPSS 17.0统计软
件对实验结果进行单因素方差分析比较，P＜0.05 为
有统计学意义。
3.1.2 抗炎活性试验
取生长状态良好的 RAW 264.7 细胞用胰酶消化
后，加入含 10%FCS 的 DMEM 培养基配成 2.5×105
个/mL单细胞悬液，接种于 96孔板中，每孔约 5×104
个细胞，5%CO2饱和湿度的 37 ℃条件下恒温培养箱
培养 4 h，按梯度浓度将色素总提取物分别加入 96孔
板中(复孔，n=3)，使个目标化合物的最终浓度分别为
10，20和 40 μg/mL，并设立空白对照。1 h后，每孔
加入 10 μL LPS溶液(0.5 μg/mL)，在细胞培养箱内继
续孵育 24 h，然后收集各组细胞培养上清液 100 μL，
加入 Griess试剂，室温避光孵育 10 min，在 540 nm
下测量其吸光度，检测 NO浓度[27−28]。以上实验重复
3次，实验数据以均数±标准差表示。采用 SPSS 17.0
统计软件对实验结果进行单因素方差分析比较，P＜
0.05为有统计学意义。
3.2 活性试验结果分析
3.2.1 对细胞存活率的影响
如图 10(a)所示，0~40 μg/mL 质量浓度的色素总
提取物处理 RAW 264.7细胞 24 h后，与空白对照组和
第 4期 刘恒言，等：细柱五加叶中色素的超声辅助提取工艺及其体外实验研究 1041
LPS模型组相比，细胞存活率具有显著差异(P＜0.05)，
说明在 0~40 μg/mL 质量浓度范围内色素总提取物
RAW 264.7细胞具有一定的细胞毒性作用。
3.2.2 对 NO浓度的影响
如图 10(b)所示，LPS诱导 RAW 264.7产生大量
的 NO，LPS 模型组细胞上清液中 NO 浓度与空白对
照组比较显著提高(P＜0.05)，说明体外炎症模型建立
成功。色素总提取物在 10，20和 40 μg/mL剂量时对
NO 分泌的抑制率分别为−4.00%，6.13%和 38.39%，
从不同程度上抑制了细胞上清液中 NO的分泌，并呈
现出剂量依赖性。


(a) 细胞存活率；(b) NO浓度
图 10 色素质量浓度对细胞存活率和 NO浓度的影响
Fig. 10 Influence of pigments mass concentration on
cell viability and NO concentration

4 结论

(1) 将单因素试验和响应面法结合对超声波提取
细柱五加叶色素工艺条件进行优化，根据实际实验情
况，获得的最佳提取工艺为：在以 95%乙醇为提取溶
剂、料液比 1:10、超声功率 130 W、提取温度 64 ℃、
提取时间 27 min的条件下提取 3次，细柱五加叶色素
的提取率约为 0.370 8%。超声波作为一种辅助提取手
段，可有效地缩短提取时间，减少环境污染，降低能
耗及减少色素损失，从而能有效地节约生产成本，是
中药提取工程上值得采取的一种经济性技术手段。
(2) 采用响应面分析法研究细柱五加叶色素超声
提取工艺参数，求得的回归方程精度高；可以准确找
到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，是
比较理想的优化实验方案的方法之一。
(3) 通过体外炎症模型实验发现细柱五加叶色素
从不同程度上抑制了细胞上清液中 NO的分泌，并呈
现出剂量依赖性；另外，细胞毒性实验发现细柱五加
叶色素总提取物在一定的剂量范围内对细胞具有毒性
作用，该结果也提示天然色素在使用时须考虑其安全
范围。

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(编辑 杨幼平)