全 文 ：收稿日期:2012-07-04 接受日期:2012-11-21
* 通讯作者 E-mail:shigaofeng@ lut． cn
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2013，25:104-109
文章编号:1001-6880(2013)1-0104-06
甜叶菊渣中总黄酮的纯化工艺研究
史高峰* ，王红玉，陈学福，王国英，宫建辉
兰州理工大学石油化工学院，兰州 730050
摘 要:以甜叶菊渣为原料，采用大孔树脂吸附和溶剂萃取法相结合的方法，得到 90%以上纯度的总黄酮。通
过对大孔树脂及溶剂萃取法的各影响因素进行研究，确定纯化甜叶菊渣中总黄酮的最佳工艺条件:AB-8 型大孔
树脂吸附流速为 2 mL /min、上样液质量浓度 1． 5 mg /mL、上样液 pH值为 3． 5、上样量 4 BV，解吸液为 50%乙醇
溶液、解吸量 5 BV、解吸流速为 1． 5 mL /min。优化后的甜叶菊总黄酮平均纯度为 50． 11%。后经乙酸乙酯在常
温条件下萃取 5 次，得到甜叶菊渣中总黄酮纯度为 91． 8%。结果表明:通过 AB-8 型大孔吸附树脂和乙酸乙酯
萃取相结合的方法，可以很好地纯化甜叶菊总黄酮。
关键词:甜叶菊;AB-8 大孔树脂;溶剂萃取;总黄酮;纯化
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Purification of Total Flavonoids from Stevia rebaudiana Waste
SHI Gao-feng * ，WANG Hong-yu，CHEN Xue-fu，WANG Guo-ying，GONG Jian-hui
Institute of Petro-Chemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China
Abstract:Total flavonoids with purity higher than 90% were purified from Stevia rebaudiana by using the method of
macroporous resin adsorption and solvent extraction． The optimum conditions of macroporous resin adsorption were as fol-
lows:2 mL /min of sample adsorption velocity，1． 5 mg /mL of sample concentration，pH 3． 5，4 BV of sample loading a-
mount，5 BV of 50% ethanol as the eluent at a flow rate of 1． 5 mL /min． The average purity of total flavonoids collected
was 50． 11% using the conditions above． The purity was increased to 91． 8% after further extraction with ethyl acetate
for five times in room temperature． The results showed that，AB-8 and ethyl acetate was suitable for the purification of to-
tal flavonoids from S． rebaudiana．
Key words:Stevia rebaudiana;AB-8 macroporous resin;solvent extraction;total flavonoids;purification
甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)属菊科多年
生草本植物，原产于南美巴拉圭和巴西［1］，是目前
已知甜度较高的糖料植物之一。甜叶菊性味甘、平，
不仅富含甜菊糖苷，还含有甾醇类和黄酮类成
分［2］。黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肌瘤、抗
氧化、抗自由基、抗炎、镇痛和保肝等活性［3］。甜叶
菊中的黄酮类化合物具有良好的降糖降压降脂的生
物活性［4］。目前关于甜叶菊黄酮类化合物的研究
尚不充分，尤其是在甜叶菊黄酮的分离纯化方面，报
道很少，而大孔吸附树脂是近十几年发展起来的一
类有机高分子聚合物吸附剂，近年来已广泛用于植
物有效成分的分离纯化，如分离纯化皂苷、黄酮、生
物碱等［5-7］。因此，本研究对大孔吸附树脂及溶剂萃
取法分离纯化甜叶菊总黄酮进行初步的研究，探索
适宜的纯化条件，为甜叶菊叶活性成分的研究提供
新的实验依据，为合理开发甜叶菊资源提供必要的
科学依据。
1 材料与仪器
1． 1 材料与试剂
甜叶菊(甘肃酒泉)经兰州大学药学系马志忠
教授鉴定;芦丁标准品(纯度≥92． 5%) ，中国药品
生物制品检定所;D101、NKA-9、AB-8 型大孔吸附树
脂(安徽三星树脂科技有限公司) ;实验室自制蒸馏
水、甲醇(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)。
1． 2 仪器与设备
U-2001 紫外可见分光光度计(Hitachi，Ltd．，日
本东京) ;AL204 电子分析天平［梅特勒-托利多仪
器(上海)有限公司］;SHZ-D (III)型循环水真空泵
(天津华鑫仪器厂) ;RE-3000 旋转蒸发器(上海亚
荣生化仪器厂) ;DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥
箱(扬州鸿都电子有限公司) ;EQ5200DE 型数控超
声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ;HH-2 数
显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。
2 实验方法
2． 1 芦丁标准曲线的绘制
准确称取 5 mg 芦丁标准品，甲醇超声溶解于
25 mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得到浓度为
0． 2 mg /mL芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液
0． 2、0． 6、1． 0、1． 4、2． 2、3． 0 mL 分别置于 10 mL 的
容量瓶中，依次加入 5% NaNO2 溶液 0． 3 mL，摇匀，
放置 6 min，再加入 10% Al(NO3)3 溶液 0． 3 mL，摇
匀，放置 6 min，最后加入 4% NaOH溶液 4． 0 mL，用
无水甲醇定容，摇匀，此时溶液颜色变为橙红色，放
置 15 min，以甲醇作空白，在 510 nm 波长处测定吸
光度，以吸光度为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度
(mg /mL)为横坐标绘制标准曲线。其线性回归方
程为:A = 8． 8051C-0． 0042，R2 = 0． 9997［A 为吸光
度，C为总黄酮质量浓度 / (mg /mL) ］。结果表明，
在芦丁质量浓度为 0． 004 ～ 0． 060 mg /mL 范围内
线性关系良好。
2． 2 甜叶菊总黄酮粗提物的制备
称取甜叶菊渣 100 g，在乙醇体积浓度 80%、提
取时间 2． 5 h、料液比 1∶ 20 (g /mL)、温度 80 ℃的条
件下回流提取 3 次，合并提取液真空浓缩至无醇味，
干燥得粗黄酮浸膏，纯度为 20． 56%，蒸馏水超声溶
解配制 1． 2 mg /mL的总黄酮样液，4 ℃冷藏备用。
2． 3 大孔树脂的预处理
分别称取适量的 AB-8、D101、NKA-9 三种树脂，
用体积分数为 95%的乙醇浸泡 24 h，使其充分溶胀
和初步除杂，用湿法装柱，继续用 95%的乙醇以适
当流速通过柱子，用乙醇洗涤至流出液加适量蒸馏
水无白色浑浊现象后，再用蒸馏水洗净乙醇。然后
用 5% HCl 溶液浸泡 3 h 后蒸馏水洗至中性，再用
4% NaOH溶液浸泡 3 h后蒸馏水洗至中性，用蒸馏
水浸泡备用［8］。
2． 4 大孔吸附树脂类型的筛选
2． 4． 1 大孔树脂吸附率和解吸率的测定
本实验选取 AB-8、D101、NKA-9 三种不同型号
的大孔吸附树脂对甜叶菊黄酮粗提液进行处理，探
讨适合甜叶菊黄酮的最优树脂。分别取预处理好三
种大孔吸附树脂各 5． 0 g，分别置于 250 mL 锥形瓶
中，各加入总黄酮溶液(浓度 1． 2 mg /mL)50 mL，塞
上塞子，120 rpm、30 ℃恒温振荡 24 h，充分吸附后
抽滤，测定滤液中黄酮质量浓度，计算各树脂吸附
率。将吸附饱和的大孔树脂加蒸馏水洗至糖的
Molish反应为阴性，再用 70%乙醇 50 mL，120 rpm、
30 ℃恒温振荡 24 h，抽滤，收集滤液测定滤液中的
黄酮质量浓度，计算各树脂的解吸率。
吸附率( % ) =
C0V0 － C1V1
C0V0
× 100
解吸率( % ) =
C2V2
C0V0 － C1V1
× 100
纯度( % ) =
M1
M × 100
C0:吸附前样品液中总黄酮质量浓度 mg /mL;
V0:吸附前样液体积 mL;
C1:吸附后残液中总黄酮质量浓度 mg /mL;V1:
吸附后残液体积 mL;
C2:解吸液中总黄酮质量浓度 mg /mL;V2:解吸
液体积 mL ;
M1:黄酮质量;M:浸膏质量;
2． 4． 2 大孔吸附树脂的静态吸附动力学特性测定
进行静态吸附动力学测定，进一步筛选最佳树
脂。准确称取处理好的树脂 5． 0 g，用滤纸吸干表面
水分，装入 250 mL 锥形瓶中，加入质量浓度为 1． 2
mg /mL黄酮提取液 50 mL，120 rpm、30 ℃恒温振荡
吸附，每隔 1 h取样 1 mL，测定其黄酮质量浓度，绘
制静态吸附动力学曲线［9］。
2． 4． 3 大孔树脂的动态吸附实验
由筛选实验筛选出一种理想大孔吸附树脂，称
取 15 g已经预处理的最佳树脂，湿法装入 1． 5 × 25
cm层析柱中，考察上样流速、上样液质量浓度、上样
液 pH值、上样量、解吸液体积浓度、用量以及流速
等进行动态吸附及解吸实验，确定最佳工艺条件。
2． 5 溶剂萃取法纯化总黄酮
通过研究溶剂种类、萃取温度、萃取次数 3 个单
因素对大孔树脂纯化后总黄酮纯度的影响，筛选出
溶剂萃取法的最佳工艺条件。
3 结果与分析
3． 1 大孔树脂的筛选
3． 1． 1 3 种大孔树脂吸附量与解吸率
如表 1 所示，虽然 AB-8 和 D101 大孔树脂的解
吸率差不多，却明显高于 NKA-9，而且 AB-8 的吸附
率高于 D101 和 NKA-9，实验中选择 AB-8 和 D101
501Vol. 25 史高峰等:甜叶菊渣中总黄酮的纯化工艺研究
这 2 种树脂通过静态吸附动力学曲线进行进一步筛
选。
表 1 3 种大孔树脂的静态吸附和解吸
Table 1 Static adsorption rates and desorption rates of three
types of macroporous resins
大孔树脂种类
Types of
macroporous
resins
吸附量
Adsorption amount
(mg /g)
吸附率
Adsorption rates
(%)
解吸率
Desorption rates
(%)
AB-8 7． 18 59． 83 97． 77
D101 6． 92 57． 67 97． 69
NKA-9 6． 79 56． 58 90． 45
3． 1． 2 大孔树脂静态吸附动力学曲线
在树脂静态吸附过程中，吸附动力学曲线反映
了吸附量与吸附时间之间的关系。流出液中黄酮的
浓度越大就说明吸附量越小，从图 1 看出，大孔吸附
树脂 AB-8、D101 在 4 h以内流出液黄酮浓度波动较
大，呈下降趋势，即吸附量波动较大，呈上升趋势;5
h后趋势变缓，2 种树脂对甜叶菊总黄酮的吸附饱和
时间都在 5 h左右，但从总体上来看 AB-8 吸附量始
终优于 D101，故选取 AB-8 进行产品纯化。
3． 2 大孔树脂对黄酮的动态吸附与解吸
3． 2． 1 上样流速对 AB-8 吸附的影响
取甜叶菊黄酮提取液 50 mL(1． 2 mg /mL) ，以
不同的流速上样，测定吸附后溶液中总黄酮浓度，计
算吸附率。结果如图 2 所示，吸附率随上样流速增
大而降低，流速在 1 mL /min ～ 2 mL /min 时，下降
趋势小;在 2 mL /min ～ 4 mL /min 时下降趋势明显
较大。其原因可能是流速较慢时提取液与树脂接触
的时间较长，有利于黄酮类物质从液相扩散到树脂
内部，从而提高了吸附率［10］。因此，为了节省时间，
选择上样流速为 2 mL /min。
3． 2． 2 上样液质量浓度对 AB-8 吸附的影响
将甜叶菊黄酮溶液稀释成 0． 38、0． 75、1． 20、
1. 50、1． 93、2． 50 mg /mL 等不同浓度的上样液，各
50 mL，以 2 mL /min的流速上样，测定吸附后溶液中
总黄酮浓度，计算吸附率。结果如图 3 所示，当样液
浓度小于 1． 5 mg /mL 时，随着样液浓度的增大，吸
附率增大;当样液浓度为 1． 5 mg /mL 时，吸附率达
到最大值;随后，随着样液浓度的增大，吸附率减小。
所以，并不是浓度越大吸附效果越好，药液的澄清度也
会影响树脂的吸附效果，且如果样品溶液浓度超过了
树脂吸附极限，黄酮类物质就会过早流出，导致吸附率
降低。因此，选择上样液质量浓度为 1． 5 mg /mL。
601 天然产物研究与开发 Vol. 25
3． 2． 3 上样液 pH值对 AB-8 吸附的影响
将浓度为 1． 5 mg /mL 的甜叶菊总黄酮提取液
分别调成 pH 2． 5、3． 5、4． 5、5． 5，以 2 mL /min 流速
上样，测定吸附后溶液中总黄酮浓度，计算吸附率。
由图 4 可知，样液的 pH 值对吸附率的影响较大。
在 pH 3． 5 时吸附率达到最大值，之后，随着 pH 的
增大，吸附率反而减小。这是由于黄酮类化合物具
有多羟基酚结构，呈弱酸性，在酸性条件下呈分子状
态，以氢键方式被吸附，因而树脂吸附量大，但若酸
性过强，黄酮类化合物易生成烊盐，使吸附效果变
差。碱性增大则 H质子易于被强碱俘获，使酚羟基
上的氢解离形成酸根离子，与树脂的结合减弱从而
使吸附量降低［11］。因而 AB-8 在弱酸性或酸性条件
下对甜叶菊总黄酮吸附的效果较好。因此，上样液
pH值控制在 3． 5 左右。
3． 2． 4 上样量对 AB-8 吸附的影响
取甜叶菊黄酮提取液，浓度为 1． 5 mg /mL，pH
为 3． 5，以 2 mL /min的流速上样，收集每 1 BV的流
出液，测定流出液中总黄酮浓度。结果如图 5 所示，
随着上样量的增大，流出液中总黄酮的浓度呈上趋
势。当上样量达到 4 BV 时，黄酮浓度达到 0． 17
mg /mL，超过上样浓度的 10%，已达到泄漏点，因
此，选择上样量为 4 BV。
3． 2． 5 解吸液体积浓度对 AB-8 吸附及黄酮纯度
的影响
取甜叶菊黄酮提取液，浓度为 1． 5 mg /mL，pH
为 3． 5，以 2 mL /min 的流速上样 4 BV，分别用水、
10%、30%、50%、70%、90%等不同体积分数的乙醇
进行洗脱，解吸液为 4 BV。测定解吸液中总黄酮浓
度，计算解吸率及纯度。结果如图 6 所示，当乙醇浓
度小于 50%时，解吸率和黄酮纯度都随乙醇体积分
数的增加而增大，50%乙醇解吸率最大，当乙醇体积
分数大于 50%时，解吸率及纯度都呈下降趋势。可
能是由于乙醇体积分数增大，醇溶性的杂质增多，降
低了解吸率和总黄酮纯度。因此，选择乙醇体积分
数为 50%。
3． 2． 6 解吸流速对 AB-8 吸附的影响
取甜叶菊黄酮提取液，浓度为 1． 5 mg /mL，pH
3． 5，以 2 mL /min 的流速上样 4 BV，分别用 50%的
乙醇溶液以 1、1． 5、2、2． 5 mL /min 的流速解吸。测
定解吸液中总黄酮浓度，计算解吸率。结果如图 7
所示，当解吸流速小于 1． 5 mL /min 时，解吸率随着
解吸流速的增大而增大;解吸流速为 1． 5 mL /min
时，解吸率达到最大值;解吸流速大于 1． 5 mL /min
时，解吸率反而随着解吸流速的增大而减小。这是
由于解吸流速太慢时，解吸时间长、解吸的杂质多;
701Vol. 25 史高峰等:甜叶菊渣中总黄酮的纯化工艺研究
流速太快时，解吸液与大孔树脂接触时间太短，导致
解吸不完全。因此，选择解吸流速为 1． 5 mL /min。
3． 2． 7 解吸液量对 AB-8 吸附的影响
取甜叶菊黄酮提取液，浓度为 1． 5 mg /mL，pH
为 3． 5，以 2 mL /min的流速上样 4 BV，用 50%的乙
醇溶液以 1． 5 mL /min的流速解吸。收集每 1 BV的
解吸液，测定解吸液中黄酮浓度，计算解吸率。结果
如图 8 所示，在解吸量小于 5 BV 时，随着解吸量的
增大，解吸率急剧上升;解吸量大于 5 BV时，解吸率
变化不大，说明总黄酮已基本洗脱完全。考虑到溶
剂的消耗，因此，选择解吸液量为 5 BV。
3． 2． 8 动态吸附解吸验证
准确称取 120 g 经预处理好的 AB-8 型大孔树
脂 2 份，装入 3 cm × 50 cm 层析柱，在最佳工艺条
件下初步分离纯化甜叶菊渣中总黄酮。最佳工艺条
件:上样液质量浓度为 1． 5 mg /mL，上样液 pH 3． 5，
吸附流速为 2 mL /min，上样量为 4 BV 进行动态吸
附。树脂经饱和吸附后，以蒸馏水洗脱至无色，除去
水溶性的杂质。然后用 50%的乙醇进行解吸，解吸
流速为 1． 5 mL /min，收集 5 BV 的解吸液，真空浓
缩，干燥得棕黄色的总黄酮粉末。用紫外分光光度
法测得纯化后的总黄酮纯度为 50． 11%，约为纯化
前的 2． 5 倍。
3． 3 溶剂萃取法纯化总黄酮
3． 3． 1 溶剂种类对甜叶菊总黄酮的影响
取 AB-8 大孔树脂纯化后的总黄酮 0． 1 g 三份，
蒸馏水超声溶解于 20 mL烧杯中，常温下，分别用等
体积的乙醚、乙酸乙酯、氯仿萃取总黄酮，萃取 3 次，
合并有机相，回收溶剂，干燥得淡黄色的总黄酮粉
末，测黄酮的得率及纯度。结果如图 9 所示，乙酸乙
酯萃取总黄酮得率和纯度均最高，乙醚萃取效果次
之，氯仿萃取效果最差。原因可能是由于乙醚萃取
的脂溶性成分较多，使活性物质黄酮溶出减少，降低
了得率和纯度，而氯仿由于极性太小，萃取出的黄酮
少。故选择乙酸乙酯为萃取溶剂。
图 9 溶剂种类的影响
Fig. 9 Effect of types of solvent
图 10 萃取温度的影响
Fig. 10 Effect of extraction temperature
3． 3． 2 萃取温度对甜叶菊总黄酮的影响
如 3． 3． 1 方法制备总黄酮样液，用等体积的乙
酸乙酯分别在 30、40、50、60 ℃下萃取总黄酮，萃取
3 次，测黄酮的得率及纯度。结果如图 10 所示，随
着萃取温度的升高，总黄酮得率升高，而纯度却降低
了。原因是由于随着温度的升高，黄酮的溶解度增
大，得率就高，但杂质的溶解度也增大了，所以就导
致纯度下降了。考虑到升高温度会增大溶剂的蒸
发，浪费溶剂，还增加热能的消耗，故选择 30 ℃，也
就是常温下萃取。
3． 3． 3 萃取次数对甜叶菊总黄酮的影响
如 3． 3． 1 方法制备总黄酮样液，在常温下，用等
体积的乙酸乙酯萃取总黄酮，测每次萃取的总黄酮
的得率及纯度。结果如图 11 所示，随着萃取次数的
增加，总黄酮得率呈上升趋势，但当萃取次数达到 5
次时，总黄酮得率趋势平缓，考虑到溶剂的浪费，故
选择萃取 5 次。
图 11 萃取次数的影响
Fig. 11 Effect of extraction times
3． 3． 4 溶剂萃取验证
取三份初步纯化的总黄酮，用乙酸乙酯在常温
条件下萃取 5 次，纯度由 50． 11%上升到 91． 8%。
4 结论
AB-8 型树脂对甜叶菊总黄酮的吸附量大、吸附
率高、易解吸，产品纯度较高，是一种良好的黄酮吸
801 天然产物研究与开发 Vol. 25
附剂，适用于甜叶菊总黄酮的纯化。最佳纯化条件
为:吸附流速 2 mL /min、上样液质量浓度 1． 5 mg /
mL、上样液 pH 3． 5、上样量 4 BV、解吸液为体积分
数 50%乙醇溶液，解吸流速 1． 5 mL /min、解吸量 5
BV，经处理后总黄酮纯度为 50． 11%，约为纯化前的
2． 5 倍。后用乙酸乙酯在常温条件下萃取 5 次，得
到甜叶菊渣中总黄酮纯度为 91． 8%。结果表明:通
过 AB-8 大孔树脂吸附和乙酸乙酯萃取相结合的方
法，能很好的纯化甜叶菊渣中总黄酮。
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