全 文 ：　文章编号:1001-3717(2004)01-0034-36
利用 RT -PCR由大叶白蜡检出烟草花叶病毒
黄金光1 ,田国忠2 ,范在丰1 ,李怀方1
(1.中国农业大学植物病理系 ,北京 100094;2.中国林业科学院森林生态环境保护研究所)
摘要:从表现花叶 、卷叶症状的大叶白蜡病株上获得一病毒分离物 , 与烟草花叶病毒抗血清呈阳性反应。通过以上
试验结果 ,分别提取花叶 、卷叶症状白蜡病叶总 RNA。根据烟草花叶病毒 RNA 序列设计引物 , 进行 RT-PCR 检
测 ,扩增出大约 800 bp 的预期特异片段。将 PCR产物连接 pMD 18-T 载体 , 转化大肠杆菌 DH5α, 得到了含有目
的片段的重组子 ,序列分析表明 ,与 GenBank 中登录序列号为 AJ011933.1 同源性达 99%, 确定该病毒分离物为烟
草花叶病毒(Tabacco mosaic v irus TMV)。
关键词:大叶白蜡;烟草花叶病毒;RT-PCR
中图分类号:S432.4+1　　　　　　　　　　文献标识码:A
Detection of Tabacco mosaic virus from Fraxinus chinensis by RT-PCR
HUANG Jin-guang1 , T IAN Guo-zhong 2 , FAN Zai-feng1 , LI Huai-fang1
(1.Department of Plant Pathology , China Agricultural University , Bei jing 100094 , China;
2.Research Institute of Forest Ecology , Environment and Protection , Chinese Academy of Forestry)
Abstract:An isolate of Tobacco mosaic virus(TMV)was isolated f rom Fraxinus chinensis(white ash)leaves
w ith typical mosaic and leaf roll symptoms in Beijing.The virus-infected plants reacted wi th an antiserum pre-
pared against TMV using antigen-coated plate enzyme-linked immunoso rbent assay (ACP-ELISA).A pair
of primers were designed based on the sequence of TMV RNA.RT -PCR was applied with total RNA isolated
from 0.1g of infected w hite ash expressing mosaic and leaf roll respectively.A fragment of about 800 bp w as am-
plified f rom the infected samples.The PCR product w as cloned into pMD 18-T Vecto r , and transformed into
Escherichia coli DH5αcells.The recombinant plasmid w as obtained and sequenced.The nucleo tide sequence
covered the entire CP gene and contained 815 nucleotides(including a pair of primers).The sequence shared
99%homology w ith the Vicia faba isolate(GenBank Accession No.AJ011933.1).we concluded that the virus
isolated f rom whi te ash in Beijing is Tabacco mosaic virus(TMV).
Key words:Fraxinus chinensis;Tabacco mosaic virus(TMV);RT -PCR
　　大叶白蜡(Frax inus chinensis)是良好的水土保
持和水源涵养树种 ,是城市绿化的优良树种 ,其木材
坚硬 、纹理通直 、富有弹性 ,是重要的用材树种 ,也是
一种名贵天然药物原料 ,具有较高的药用价值 。
1997年 ,我国新疆和北京市个别种植点白蜡有
发生病毒病的报道 ,病毒种类已知有烟草花叶病毒
(Tobacco mosaic v irus , TMV),烟草脆裂病毒(To-
bacco ratt le v irus , TRV)和苜蓿花叶病毒(Alfal fa
mosaic v irus ,AMV)[ 1] 。国外报道有 3种病毒引起
美国白蜡(Fraxinus americana)病毒病 ,分别是烟
草环斑病毒(Tobacco ringspot virus , TRSV)[ 2] 、烟
草花叶病毒(TMV)[ 3] 、番茄环斑病毒(Tomato
ringspot v irus , TO RSV)[ 4] 。作者于 2003年 6月从
症状表现为花叶和卷叶症状的北京白蜡病株上获得
莱 阳 农 学 院 学 报　21(1):34～ 36 , 2004
Journal of Laiyang Agricultural College
收稿日期:2003-01-02
基金项目:科技基础性工作专项资金项目(2001DEA10004),农业部 948项目(2001-249)
作者简介:黄金光(1973-),男,山东莱阳人 ,在读硕士 ,现主要从事植物病毒检疫检测及分子病毒学研究工作。
通讯作者:李怀方
的病毒分离物进行 RT -PCR检测鉴定 ,分离鉴定
出烟草花叶病毒(Tabacco mosaic v irus TMV),现将
结果报道如下。
1　材料与方法
1.1　毒源的分离纯化
从北京市海淀区中国农业大学西区校园采集到
呈花叶和卷叶症状的白蜡叶片 ,分别接种保存在普
通烟上。
1.2　血清学反应
参考 Barker的间接酶联免疫实验[ 5] ,测定该病
毒分离物与 TMV 抗血清关系。用酶联读数仪在
405 nm 下读数。 TMV 抗血清由本研究室保存提
供。
1.3　植物总 RNA提取
分别取 0.1g 发病表现花叶和卷叶白蜡叶片 ,用
液氮研磨成粉末状 ,移入灭菌的1.5ml离心管 ,加入
1ml T ri-reagent ,剧烈震荡摇匀;12000g(4℃)离心
10min以除去不溶的成份 ,将上清液转入一新的
1.5ml离心管中;室温下保持 5min ,加 0.2ml氯仿 ,
剧烈振荡 15s ,然后在室温下保持 10min ,12000g 离
心 15min;将上层水相转移到新的 1.5ml离心管 ,加
0.5m l 异丙醇 , 颠倒混匀 , 室温下保持 15min;
12000g 离心 10min , RNA就会在管的侧壁和底部形
成沉淀;倒掉上清液 , 加入 75%的乙醇洗涤沉淀 ,
7500g 离心 5min(如沉淀悬浮起来 ,则用 12000g),
弃去乙醇;沉淀于室温下充分干燥后 , 溶于 30μl
dH2O(DEPC处理)中 , -20℃保存备用 。
1.4　RT-PCR试验
1.4.1　引物的设计
根据已报道的烟草花叶病毒 RNA CP 基因序
列设计并于赛百盛公司合成如下两个引物。
TMVmpf引物:5 -AGT , TGT , TGA , TGA ,
GT T ,CAT ,GGA-3 ;
TMV3nr 引物:5 -CAA , CCC , TTC , GAT ,
TTA ,AG T ,GGA-3 。
1.4.2　cDNA合成
以植物总 RNA 为模板 ,用 TMV3nr 引物作为
反转录引物合成 cDNA ,反应体系组分为:植物总
RNA3.0μl , TMV 3 nr引物1 .0μl , 5×MMLV缓冲
液3 .0μl , DEPCH2 O 5 .0μl , dNTP(1 0mM each)
1.5μl , RNase inhibito r (40u/μl)0.5μl , MMLV 逆
转录酶 1.0μl。混合均匀后 ,42℃水浴中 1h 。
1.4.3　PCR扩增
取反转录产物 cDNA 2.0μl ,分别加入 10×PCR
缓冲液 2.5μl , dNTP (2.5 mM each)1.0μl , 引物
TMVmpf 、TMV3nr各 0.5μl , Taq DNA 聚合酶(2.5
u/μl)0.5μl ,加 ddH2O 至 25μl。PCR热循环条件:
94℃4min;94μ30s , 55μ30s , 72℃ 1min , 35 个循
环;72℃10min;4℃保温 。PCR产物用 1%琼脂糖
凝胶电泳检查 ,回收目的片段。
1.5　PCR片断的克隆和序列分析
基因克隆 、筛选 、质粒提取均参照 Sambrook 等
的方法[ 6]进行 。回收的目的片断与克隆载体 pMD
18-T (TaKaRa)连接并转化大肠杆菌 DH5α,经选
择性培养基筛选 ,碱裂解法提取质粒 ,电泳和酶切鉴
定外源片断的插入情况 。克隆送到上海申友公司测
序 ,核苷酸序列用 BLAST 软件分析 ,核苷酸与氨基
酸同源性用 DNAMAN 4.0(Lynnon BioSof t)分析。
2　结果与分析
2.1　血清学反应
间接酶联免疫实验表明 ,表现花叶和卷叶症状
白蜡叶片病毒分离物都与 TMV 抗血清呈阳性反
应 ,汁液摩擦接种的普通烟与 TMV 抗血清也呈阳
性反应 。
2.2　RT-PCR试验结果
1%琼脂糖凝胶电泳检查 PCR扩增产物 ,从表
现花叶和卷叶症状白蜡叶片中均扩增出约 800bp目
的片段 ,与预期片段大小一致 ,没有其它非特异性
DNA条带(图 1)。
图 1　TMV PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
1.分子量标准 Lambda DNA/ Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ ;2.花叶症状
大叶白蜡叶片总 RNA RT -PCR产物;3.卷叶症状大叶白蜡叶片
总 RNA RT-PCR产物
351 期　　　　　　　　　　　　黄金光 ,等:利用 RT-PCR由大叶白蜡检出烟草花叶病毒　　　　　　　　　　　　
2.3　PCR产物的克隆及序列分析
PCR扩增片段与克隆载体 pMD 18-T 连接并
转化大肠杆菌 DH5α,经筛选和用 Hind Ⅲ+EcoR
Ⅰ双酶切(图 2)及质粒 PCR验证(图略),分别获得
了含有插入片段的阳性克隆。
图 2　重组质粒酶切鉴定凝胶电泳图
1.分子量标准 Lambda DNA/ Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ ;2.Hind Ⅲ
+EcoR Ⅰ双酶切质粒 M;3.Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ双酶切质粒 L
序列分析结果表明 ,两个阳性克隆重组质粒插
入片段序列一致 , 全长为 815nt(包含人工合成引
物),其中包括完整的 CP 基因序列。对获得的全长
核苷酸序列与已报道的TMV核苷酸序列同源性
比较表明 , 它们之间的同源性介于 97%～ 99%之
间;与 GenBank中登录序列号为 AJ 011933.1 的同
源性最高 ,达 99%,其中 CP 基因核苷酸同源性达
99.58%,氨基酸同源性为 100%。
3　结论与讨论
通过生物学 、血清学以及分子生物学实验研究 ,
从表现花叶和卷叶症状北京大叶白蜡叶片分离到烟
草花叶病毒。花叶症状是病毒病的典型症状 ,而卷
叶症状尚可由生理因子缺失引起 ,作者发现 ,表现花
叶尤其是卷叶症状的叶片分布在树体下部阴面 ,而
枝干上部阳面叶片外观正常 ,因此 ,导致卷叶症状病
因是生理因子缺失或者几种病毒复合侵染造成的有
待于进一步研究。
参考文献:
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