全 文 ：农 药
AGROCHEMICALS
第51卷第1期
2012年1月
Vol. 51, No. 1
Jan. 2012
天然化合物丁香酚抗烟草花叶病毒病作用机制初探
王春梅，苏 杭，陈 浩，石志琦，范永坚
(江苏省农业科学院 食品质量安全与检测研究所，国家重点实验室培养基地，
农业部食品质量安全监控重点实验室， 南京 210014)
摘要：[目的]初步研究丁香酚对植物病毒病的作用机制。 [方法]利用盆栽法测定了丁香酚对烟草花叶病毒病的
预防和治疗效果；电镜法观察了丁香酚对病毒粒子的影响；体外混合法测定了丁香酚对烟草花叶病毒外壳蛋白
体外聚合的影响。 [结果]丁香酚对烟草花叶病毒病具有较好的预防和治疗效果；丁香酚与病毒混合处理后，病
毒粒子有断裂现象；丁香酚对TMV外壳蛋白体外聚合有一定的抑制作用。 [结论]丁香酚可以作为新型抗病毒剂
用于防治作物病毒病。
关键词：天然化合物；丁香酚；烟草花叶病毒；防效；外壳蛋白
中图分类号：TQ450.1 文献标志码：A 文章编号：1006-0413(2012)01-0029-03
Mode of Action of Natural Compound Eugenol on
Tobacco Mosaic Virus Disease
WANG Chun-mei, SU Hang, CHEN Hao, SHI Zhi-qi, FAN Yong-jian
(Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Institute of Food Quality and Safety, State Key Laboratory Breeding Base, Key Lab of
Agro-Food Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Nanjing, 210014, China)
Abstract: [Aims] The aim of this research was to study mode of action of eugenol on tobacco mosaic virus disease.
[Methods] The preventive and therapeutic effect of Eugenol on tobacco mosaic virus disease was determined. The
infl uence of eugenol on TMV virions was observed with electron microscope. The effect of ugenol on polymerization of
TMV coat protein was also determined. [Results] The results showed that eugenol had a better preventive and therapeutic
effect. The TMV virions treated with Eugenol showed ruptures and abnormality. Eugenol had an inhibition effect on
polymerization of TMV coat protein. [Conclusions] Eugenol as a newly reported antiviral compound could be used to
control plant virus diseases.
Key words: natural compound; eugenol; TMV; control effect; coat protein
引起植物病毒病的病毒种类繁多，由于植物病毒在寄
主细胞中进行核酸和蛋白质外壳的复制，普通药剂难以直
接对其作用，故病毒病又被称为“植物癌症”。 植物感染病
毒后，植物细胞的正常代谢活动被打乱，植物的生长和发
育遭到破坏，从而降低农作物的产量和品质。 目前植物病
毒病的防治主要依赖抗病品种[1-2]，但抗病品种的利用也有
局限性，如选育周期相对较长或抗病品种在品质及其他农
业性状欠缺等，针对某些植物病毒病难以找到合适的抗病
品种。 抗病毒剂防治是辅助措施，目前主要应用的抗病毒
剂品种有盐酸吗啉胍、宁南霉素、病毒A等及植物诱抗剂
如壳寡糖、香菇多糖、葡聚烯糖等。 这些药剂一般在发病
初期喷药防治，具有预防效果，但治疗效果不显著。 随着
公众对农产品品质要求的不断提高，利用安全、高效的生
物农药防治植物病毒病害已成为病毒病安全防控的主要
努力目标。 从植物资源中寻找对植物病毒病具有良好防
效的天然化合物已成为国内外研究热点[3-6]。
陈浩等[7]前期从中草药中分离筛选得到天然化合物丁
香酚，首次研究发现该化合物对西葫芦病毒病具有较好的
防治效果，并开发具有自主知识产权的产品—20%丁香
酚水乳剂，该制剂对大白鼠急性经口毒性LD50>5 000 mg/kg、
急性经皮毒性LD50>5 000 mg/kg，属于微毒类生物农药。 为
探讨丁香酚对植物病毒病的防治作用机制，本文以烟草花
叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)为研究对象，初步研究
丁香酚对TMV粒子形态及外壳蛋白的抑制作用，旨在为深
入探讨丁香酚的作用机制及产品合理应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试病毒
烟草花叶病毒(TMV)在普通烟NC89上繁殖，保存在
无虫温室中。
1.2 供试药剂
试验药剂20%丁香酚水乳剂，江苏省农科院食品质量
收稿日期：2011-09-06，修返日期：2011-10-25
基金项目：江苏省自然科学基金(BK2011671)；江苏省农业科技自主创新资金(CX(11)244)
作者简介：王春梅(1979—)，女，江苏盐城人，助理研究员，博士研究生，从事植物源抗病毒剂研发和作用机制研究。 E-mail：wangchunmei_1979@163.com。
通讯作者：范永坚(1956—)，男，研究员，博士生导师，从事植物病毒学研究。 Tel：025-84391863，E-mail：fanyj_jaas@yahoo.com.cn。
·科研与开发·
30 第51卷农 药 AGROCHEMICALS
安全研究所农业投入品安全研究室提供；对照药剂20%吗
啉胍·乙铜可湿性粉剂，山东神星药业有限公司，市售。
丁香酚纯品，含量98%，购于Sigma公司，用70%乙醇
配制成10 g/L母药，4 ℃冰箱保存备用。
1.3 供试植物
普通烟NC89，中国农业科学院烟草研究所(青岛)。
1.4 丁香酚对烟草花叶病毒病的防效
分别取长势一致、5~6叶期的普通烟、辣椒、番茄进行
以下处理：20%丁香酚水乳剂200、400、600 mg/L，分别于
接种前24 h、后24 h喷20%丁香酚水乳剂，以喷20%吗啉
胍·乙铜可湿性粉剂600 g/hm2为对照药剂处理，以喷清水
为空白对照，采用病汁液摩擦法接种，每处理l0株，重复
3次，发病后(接种后15 d)调查各处理病情指数，计算防治
效果。 TMV在烟草上的病情分级标准：按照中华人民共和
国烟草行业标准(YC/T 39—1996)烟草病害分级标准的烟
草花叶病分级标准。
1.5 丁香酚对TMV粒子形态的影响
TMV提纯参考田波等[8]的方法，略有改动。 将提纯的
TMV与丁香酚400、600 mg/L等体积混合2 h后，采用负染法
在电镜下观察病毒粒子的形态变化，以清水混合作对照。
1.6 TMV外壳蛋白的制备
取发病约1个月新鲜普通烟NC89叶片，按常规方
法，采用PEG和20%蔗糖密度梯度离心法制备病毒精提
纯液 [9]。 采用Fraenkel-Conrat等[10]的醋酸法提取烟草花叶
病毒(TMV)外壳蛋白，略加修改，具体步骤如下：向冷的
TMV溶液中加人等体积冷的冰醋酸溶液(体积分数67%)，
4 ℃静置60 min(每隔10 min振荡1次)，于3 500 r/min离心
20 min；取上清液，用等体积冷水稀释后，在4 ℃条件下用
重蒸水透析96 h(首次间隔4 h换水，以后每隔8 h换1次水)，
至提取溶液白色浑浊后停止透析；于透析后的提取溶液
中加入3 mol/L醋酸钠缓冲液(pH值4.7)数滴，使其完全沉
淀，4 ℃、10 000 r/min离心30 min，将离心所得沉淀溶于
0.033 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)中，4 000 r/min离心取上
清液即得TMV外壳蛋白溶液。 于280 nm处用紫外分光光
度计进行光谱分析，并对提纯的TMV外壳蛋白进行SDS-
PAGE电泳，以确定其相对分子质量。
1.7 丁香酚对TMV外壳蛋白体外聚合的影响
分别将丁香酚和等体积的0.033 mol/L磷酸缓冲液
(pH值7.0)加入TMV外壳蛋白溶液中，使溶液中丁香酚的
最终质量浓度为400 mg/L。 分别设置10~42 ℃之间12个温度
梯度处理，各处理组溶液在水浴锅中充分预热，参照Lauffer
的方法[11]，以等质量浓度的TMV外壳蛋白溶液为参照，用紫
外分光光度计在320 nm处进行不同温度下的光谱分析。
2 结果与分析
2.1 丁香酚对烟草花叶病毒病的防效
TMV侵染烟草室内盆栽试验结果(见表1)表明20%丁
香酚水乳剂对烟草花叶病毒病具有较好的预防和治疗效
果，20%丁香酚水乳剂200、400、600 mg/L对烟草花叶病毒
病的预防效果分别为51.15%、65.28%和68.45%，治疗效果
分别为56.78%、62.14%、63.55%，高于对照药剂20%吗啉
胍·乙铜可湿性粉剂600 g/hm2处理，其预防和治疗效果分
别为55.03%、39.20%。
表1 丁香酚对烟草花叶病毒病的防效试验
处理/(mg·L-1) 预防效果 治疗效果
病情指数 防效/% 病情指数 防效/%
20%丁香酚EW 200 21.51 51.15b 19.03 56.78a
400 15.05 65.82a 16.67 62.14a
600 13.89 68.45a 16.05 63.55a
20%吗啉胍•乙铜WP 600 g/hm2 19.80 55.03b 26.77 39.20b
清水对照 44.03 44.03
2.2 丁香酚对TMV粒子形态的影响
不同质量浓度丁香酚和提纯TMV钝化2 h后，于电子
显微镜下观察，结果表明正常TMV粒子形态刚直、杆状
(见图1)，而丁香酚400、600 mg/L处理的病毒粒子有不同
程度断裂现象，说明丁香酚可能通过破坏病毒粒子减少对
植物的侵染。
空白对照 丁香酚 400 mg/L 丁香酚 600 mg/L
图1 不同质量浓度丁香酚对TMV粒子形态的影响(Scale bar=200 nm)
第1期 31
图2 TMV外壳蛋白的SDS-PAGE
2.4 丁香酚对TMV外壳蛋白体外聚合的影响
在4 ℃的0.033 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)中TMV外
壳蛋白多以单体或寡聚体的形式存在 [12-13]。 随着温度的
升高，TMV病毒外壳蛋白首先聚合成20 S聚合体，然后
进一步聚合形成螺旋形管状堆砌体[12]。 由图3可以看出：
在试验温度范围内10~42 ℃，随着温度的升高，对照组
TMV外壳蛋白在320 nm处吸光值呈逐渐增加的趋势，但
丁香酚处理组吸光值变化平缓。 已有研究结果表明：TMV
外壳蛋白在320 nm处的吸光值与自身的聚合程度呈正比，
而体外聚合程度与温度变化也呈正比关系[11]。 该实验说
明丁香酚可能抑制TMV外壳蛋白的体外聚合，不利于病
毒粒子的进一步装配。 TMV在植物体内的移动必须以外
壳蛋白聚集体的形成为前提，即不能被成功装配的病毒核
酸是不能有效的在寄主体内进行长距离传播[13]，本试验表
明丁香酚抑制TMV外壳蛋白的体外聚合，有可能影响病
毒核酸的成功装配，进而影响病毒的进一步侵染。
用于防治植物病毒病进行了大量研究[14-16]，但是商品化的
产品甚少。 前期研究结果表明：本研究室筛选分离的植物
源化合物丁香酚在田间对西葫芦病毒病、番茄黄化曲叶病
毒病等病毒病均表现良好的防治效果。
利用电子显微镜观察不同质量浓度丁香酚对TMV
病毒粒子形态有不同程度的破坏作用，即发现断裂现象。
推测其原因，可能是丁香酚破坏了TMV粒子衣壳蛋白亚
基之间的结合力，从而影响亚基的组装，致使结构断裂，
这与江山等[13]的研究结果一致。
病毒外壳蛋白是烟草花叶病毒基因结构的重要组成
部分，其主要功能除保护核酸物质不被降解外，还与TMV
的远距离移动及寄主症状有关。 病毒核酸和外壳蛋白相
互识别，装配成完整的病毒颗粒。 作为病毒装配的第一步，
外壳蛋白必须先形成一定程度的多聚体，然后再与病毒核
酸进一步进行组装，从而形成完整的病毒颗粒。 本研究表
明：丁香酚可以明显抑制TMV外壳蛋白的体外聚合，说明
丁香酚对TMV的外壳蛋白的聚合过程具有较强的干扰作
用，不利于病毒粒子的装配，从而影响病毒对寄主植物的
入侵，可能减少病毒在植物体内的繁殖。 但有关丁香酚是
否作用于TMV外壳蛋白的合成过程或如何影响病毒粒子
的组装过程有待进一步的深入研究。
参考文献：
[1] 陈丽静, 李君明, 宋燕 , 等. 番茄抗番茄花叶病毒和斑点萎凋病
毒病基因PCR标记的同时鉴定[J]. 中国农业科学, 2004, 37(7):
982-986.
[2] 国艳梅, 杜永臣, 王孝宣, 等. 番茄黄化卷叶病毒病(TYLCV)的
研究进展[J]. 中国农业科技导报, 2009, 11(5): 30-35.
[3] LI Yan-mei, WANG Li-hua, LI Shun-lin, et al . Seco-pregnane
Steroids Target the Subgenomic RNA of Alphavirus-like RNA
Viruses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,
2007, 104(19): 8083-8088.
[4] 朱琳, 林秀敏, 钟鸣. 平菇蛋白提取物对烟草花叶病毒的抑制活
性初探[J]. 现代农业科技, 2009(12): 12-14.
[5] 林绍武, 何跃兴. 植物提取物抗烟草花叶病毒活性的筛选[J]. 安
徽农学通报, 2009, 15(9): 146-148.
[6] 翟梅枝, 李鹏影, 黄海玲. 核桃青皮活性物质P4-2对烟草体内生
理生化指标的影响[J]. 西北林学院学报, 2009, 24(4): 143-146.
[7] 陈浩, 胡梁斌, 王春梅, 等. 植物源抗病毒剂20%丁香酚AS防治西
葫芦病毒病药效试验[J]. 江西农业学报, 2009, 21(12): 112-113.
[8] 田波, 裴美云. 植物病毒研究方法[M]. 北京: 科学出版社, 1987.
[9] 吴俊杰. 烟草花叶病毒和番茄花叶病毒在烟草上致病性差异的
分子机理研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2001.
[10] FRAENKEL-CONRAT H, WILLIAMS R C. Roconstitution of
Active Tobacco Mosaic Virus from Its Inactive Protein and Nucleic
Acid Components[J]. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 1995, 41: 690-698.
[11] LAUFFER T T, SMITH C E. Polymerization-depolymerization of
Tobacco Mosaic Virus Protein[J]. Biochemistry, 1967, 6: 2457-2464.
[12] RICGARDS K E, WILLANS R C. Assembly of Tobacco Mosaic
Virus in vitro[J]. Compr Viol, 1976, 6: l-37.
[13] 江山, 郭喜柳, 韩熙莱. 一些抗植物病毒剂对烟草花叶病毒农壳
蛋白体外聚合过程的影响[J]. 中国病毒学, 1996, 2(1): 77-80.
2.3 供试TMV外壳蛋白纯度检测
对经醋酸法提纯的TMV外壳蛋白进行紫外可见光谱
分析，在280 nm处有1个特征性吸收峰，是蛋白质的特征
吸收峰，且只有1个主要吸收峰，说明所提取的TMV外
壳蛋白纯度较好。 经SDS-PAGE电泳检测(见图2)，确定
TMV外壳蛋白只在14.4~18.8 DKa之间，且纯度较高，可
进行下一步试验。
图3 丁香酚对TMV外壳蛋白体外聚合的影响
3 讨论
近年来随着公众对食品安全要求的不断提高，减少化
学抗病毒剂的使用量从源头保障蔬菜品质安全已成为病
毒病防治的关键举措。 利用生物源抗病毒剂部分替代化
学抗病毒剂从而减少其使用量，一方面可以减少化学药剂
的残留，另一方面也可减少化学药剂的大量使用有效维护
生态环境安全。 研究者对于从植物中寻找有活性化合物
王春梅，等：天然化合物丁香酚抗烟草花叶病毒病作用机制初探
(下转第36页)
36 第51卷农 药 AGROCHEMICALS
的试样(精确至0.000 2 g)，置于50 mL容量瓶中，滴加3滴
AR级磷酸，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤。
1.5.3 测定
在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数
针标样溶液，直至相邻2针标样相对响应值变化小于1.0%
后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序
进行测定。
1.5.4 计算
将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中
2甲4氯峰面积、2,4-滴酸峰面积分别进行平均；2甲4氯二
甲胺(或2,4-滴二甲胺)的质量分数X1(%)按下式计算：

X1 =
A2·m1·P×1.224(1.203)
A1·m2
式中：A1为标样溶液中2甲4氯酸峰面积(或2,4-滴酸)平
均值，A2为试样溶液中2甲4氯酸峰面积(或2,4-滴酸)平均值，
m1为2甲4氯酸标样(或2,4-滴酸)的质量(g)，m2为2甲4氯酸试
样(或2,4-滴酸)的质量(g)，p为标样中的2甲4氯酸(或2,4-滴
酸)质量分数(%)，1.224为2甲4氯二甲胺与2甲4氯酸的换算
系数，1.203为2,4-滴二甲胺与2,4-滴酸的换算系数。
1.5.5 允许差
2次平行测定结果之差，应不大于1.0%。
2 结果与讨论
2.1 检测波长的选择
参照13% 2甲4氯钠水剂GB 20697—2006[1]与2,4-滴原
药HG 3624—1999[2]，检测波长选择227 nm。
2.2 方法的线性相关性
分别称取2甲4氯酸与2,4-滴酸标准品0.055 27、0.039 03 g，
置于50 mL容量瓶中，用甲醇-水(体积比75∶25)的流动相定
容，摇匀。 分别移取1、2、3、4、5、6 mL，分别置于50 mL容量瓶
中，亦用流动相定容，摇匀。 在上述色谱条件下进行分析，测
定质量浓度(mg/L)与峰面积(mV)的相关性(见表1)。
表1 分析方法的线性相关性试验结果
编号 2甲4氯酸质量 2甲4氯酸 2,4-滴酸质量 2,4-滴酸
浓度/(mg•L-1) 峰面积/mV 浓度/(mg•L-1) 峰面积/mV
1 22.108 723.557 15.612 1164.233
2 44.216 1488.211 31.224 2385.063
3 66.324 2156.734 46.836 3431.275
4 88.432 2881.551 62.448 4539.015
5 110.540 3581.150 78.060 5578.046
6 132.648 4275.870 93.672 6571.874
2甲4氯酸的线性方程为y1=32.00x1+41.32，其线性相关
系数r=0.999。 2,4-滴酸的线性方程为y2=69.04x2+172.4，其
线性相关系数r =0.999。
2.3 方法的精密度
采用上述方法对50% 2甲4氯二甲胺·2,4-滴二甲胺水
剂样品平行测定5次，结果见表2。
表2 方法精密度试验
　 名称 含量/% 标准 变异系
1# 2# 3# 4# 5# 平均值 偏差 数/%
2甲4氯二甲胺 26.89 26.87 26.82 26.63 26.85 26.81 0.105 0.39
2,4-滴二甲胺 25.17 25.01 25.17 24.95 25.19 25.09 0.11 0.44
2.4 方法的准确度
采取标样添加法：在已知含量的水剂试样中添加一定
量的2甲4氯酸与2,4-滴酸标准品，在上述条件下进行
4次平行测定，测得2甲4氯酸和2,4-滴酸的回收率，结
果见表3。
表3 方法准确度试验
名称 样品 标准品 检测量/ 回收率/ 平均回
序号 添加/g g % 收率/%
2甲4氯酸 1 0.0532 0.0527 99.1 99.3
2 0.0405 0.0404 99.8
3 0.066 0.0654 99.1
4 0.06 0.0595 99.2
2,4-滴酸 1 0.0424 0.0421 99.3 100.1
2 0.0343 0.035 102
3 0.0385 0.0382 99.2
4 0.037 0.037 100
3 结论
采用本方法分析测定50% 2甲4氯二甲胺·2,4-滴二甲
胺50%水剂的含量，具有简便、快速、准确的优点，且结
果重现性，稳定性均能满足复配制剂产品的检验要求，
是一种可行的理想的分析方法。
参考文献：
[1] 姜敏怡, 李秀杰, 董霞. GB 20697—2006. 13% 2甲4氯钠水剂[S].
北京: 中国标准出版社, 2006.
[2] 梅宝贵, 袁春凤, 李秀杰, 等. HG 3624—1999. 2,4-滴原药[S]. 北
京: 中国标准出版社, 1999.
责任编辑：李新
[14] DAWON W O, BUBRIEK P, GRANTHAM G L. Modifications
of the Tobacco Mosaic Virus Coat Protein Gene Affecting
Replication, Movement and Symptomatology[J]. Phytopatholoy,
1988, 78: 783-789.
[15] MARJORIE M C. Plant Products as Antimicrobial Agents[J].
Clinical Microbiology Reviews, 1999, 564-582.
[16] CHIANG L C, CHIANG W, LIU M C, et al . In vitro Antiviral
Activities of Caesalpinia pulcherrima and Its Related Flavonoids[J].
Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 52: 194-198.
责任编辑：赵平
(上接第31页)