全 文 ：蟛蜞菊乙醇提取物促进黑色素生成及其机理
的初步研究
梅寒芳，林密，朱家勇
(广东药学院 基础学院 /广东省生物活性药物研究重点实验室，广东 广州 510006)
摘要:目的 观察中药蟛蜞菊乙醇提取物促进黑色素生成的作用，并初步探讨其作用机理。方法 MTT
法、L-Dopa氧化法、NaOH裂解法探讨不同浓度蟛蜞菊乙醇提取物作用于小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16)
72 h后，对细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响。RT-PCR 检测药物作用前后酪氨酸酶、小眼
相关转录因子(MITF)等基因表达的影响。结果 与对照组比较，蟛蜞菊乙醇提取物能促进 B16 细胞的
增殖，促进酪氨酸酶活性增加和黑色素生成增多;可剂量依赖性上调酪氨酸酶和 MITF 的 mRNA 表达。
结论 蟛蜞菊乙醇提取物可促进 B16 细胞黑色素生成，其机制可能是通过促进 B16 细胞增殖、增强酪氨
酸酶和 MITF的基因表达来实现。
关键词:蟛蜞菊;黑色素;酪氨酸酶;小眼相关转录因子
中图分类号:R392． 1;R285． 5 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 02． 022
文章编号:1006-8783(2012)02-0188-04
The effect and mechanism of ethanol extract from Wedelia chinensis on melanogenesis
of B16 melanoma cells
MEI Han-fang，LIN Mi，ZHU Jia-yong
(School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University /Guangdong Key Laboratory of
Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To study the effect and potential mechanism of ethanol extracts from Wedelia chinensis
(EEW) on melanogenesis of B16 murine melanoma cells． Methods B16 cells were incubated with
different concentrations of EEW for 72 h，and then cell viability was measured by MTT method，tyrosinase
activity by L-dopa oxidative reaction，and melanogenesis by NaOH method，respectively． The mRNA
expression of tyrosinase and microphthalmia associated transcription factor (MITF)were detected by RT-
PCR． Results In the range of experimental dose，EEW slightly increased cell viability． The activity of
tyrosinase and production of melanin were significantly increased in a dose-dependent manner． The
increased gene expression of tyrosinase and MITF were also observed in a dose-dependent manner．
Conclusion EEW can directly stimulate melanogenesis in B16 melanoma cells，which may be mediated by
promoting cell proliferation and increasing expression of tyrosinase and MITF．
Key words:Wedelia chinensis;melanin;tyrosinase;microphthalmia associated transcription factor(MITF)
收稿日期:2012-01-11
基金项目:广东省中医药局建设中医药强省科研课题(20111246)
作者简介:梅寒芳(1977 －) ，女，博士，讲师，主要从事天然生物活性物质作用及机理研究，Email:meihf37@ 163． com;通信作
者:朱家勇(1954 －) ，男，硕士，教授，博士生导师，主要从事药用生物活性物质结构功能与应用研究，Email:zhujy@
gdpu． edu． cn。
网络出版时间:2012-03-28 09:46 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20120328． 0946． 001． html
蟛蜞菊为菊科蟛蜞菊属植物，性甘、微酸、凉，具
清热、解毒、祛瘀、消肿的功效，有保肝、抗炎镇痛、杀
虫抑菌、抗癌等作用［1］。Lin 等［2］研究发现蟛蜞菊
对四氯化碳、对乙酰氨基酚和 D-半乳糖胺等诱导的
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Apr． 2012，28(2)
急性肝炎大鼠模型具有明显的保肝作用。罗晓茹
等［3］从蟛蜞菊中分离得到齐墩果酸衍生物具有抗
人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)
的作用。邝丽霞等［4］研究发现蟛蜞菊水提物显著
提高小鼠热板法痛域，减少小鼠对醋酸刺激的扭体
反应次数，能极显著地降低小鼠耳肿胀程度和腹腔
毛血管通透性，具有明显抗炎效果;Tsai等［5］研究发
现从蟛蜞菊中分离得到的单体化合物对前列腺癌有
一定的抑制作用。但蟛蜞菊乙醇提取物对黑色素生
成是否有调节作用，目前还未见报道。本研究采用
蟛蜞菊乙醇提取物作用于体外培养的恶性黑色素瘤
(B16)细胞，探讨其对 B16 细胞增殖、酪氨酸酶
(tyrosinase，TYR)活性及黑色素含量的影响，并从
TYR、小眼相关转录因子(MITF)等黑色素合成重要
的调控因子的基因表达变化的角度探讨其作用机
制，为蟛蜞菊在调控黑色素形成方面的作用及机制
研究提供初步实验依据。
1 材料与方法
1． 1 试剂与仪器
蟛蜞菊乙醇提取物由本实验室刘漫宇硕士提取
并惠赠。小鼠恶性黑色素瘤 B16 细胞株，由广东药
学院广东省生物活性药物研究重点实验室保存。
RPMI 1640 细胞培养基、胰蛋白酶为美国 GIBCO 公
司产品;胎牛血清为美国 Hyclone公司产品，RNA提
取试剂 Trizol Reagent 为美国 Invitrogen 公司产品;
RNA酶抑制剂 RNasin、M-MLV 逆转录酶、随机引物
Oligod(T)18、DL2000 DNA Marker、DNA Taq酶等均
为 TAKARA 公司产品;MTT 为美国 Sigma 公司产
品;琼脂糖、DMSO 为美国 Amresco 公司产品，其他
试剂为国产分析纯。凝胶成像系统、核酸蛋白检测
仪和酶标仪为美国 BIORAD 公司产品，PCR 仪购自
美国 AB公司。
1． 2 细胞培养及药物处理
B16 细胞用含 10%(φ)胎牛血清的 RPMI 1640
培养基，37 ℃，5%(φ)CO2 条件下常规培养。待细
胞长至融合状态，常规胰酶消化，1∶ 3 传代培养。蟛
蜞菊乙醇提取物先用微量乙醇溶解，再用培养液稀
释至所需要的终浓度。培养液中乙醇终体积浓度≤
0． 3%。
1． 3 MTT法测定细胞增殖率
对数生长期 B16 细胞常规消化，以 7 × 102 个 /
100 μL /孔接种于 96 孔板，37 ℃、5% CO2 培养 24 h
后，各蟛蜞菊组分别加入终质量浓度为 50、25、
12. 5、6． 25、3． 125 μg /mL 的蟛蜞菊乙醇提取物，每
组重复 7 次，并设中药组(培养基 +蟛蜞菊乙醇提
取物)、培养基组(无细胞的培养基)、对照组(培养
基 +细胞) ，培养 68 h，再加入 MTT继续培养 4 h，弃
上清，DMSO 溶解，酶标仪测定 490 /630 nm 吸光度
值，用吸光度值表示细胞增殖活性。
蟛蜞菊组细胞增殖活性 =蟛蜞菊组的吸光度 －
中药组吸光度
对照组细胞增殖活性 =对照组吸光度 －培养基
组吸光度
1． 4 L-Dopa氧化法测定 TYR活性
对数生长期 B16 细胞常规消化，以 7 × 102 /100
μL /孔接种于 96孔板，培养 24 h，分别加入终质量浓
度为 3． 125、6． 25、12． 5 μg /mL的蟛蜞菊乙醇提取物，
继续培养 72 h，设组同前。弃上清，PBS洗涤，每孔加
入 1% TritonX-100 100 μL ，震荡 5 min，－20 ℃ 1 h，
室温融化使细胞完全裂解。每孔加入 0． 1% 左旋多
巴液(PBS配制)100 μL，37 ℃孵育 2 h，酶标仪测定
460 nm波长处吸光度值，每一浓度设立 6 个复孔。
各组吸光值计算同“1． 3”。
1． 5 NaOH裂解法测定黑色素含量
对数生长期 B16 细胞常规消化，以 1． 5 × 104
个 /2 mL /孔接种于 6 板，37 ℃、5%CO2 培养 24 h贴
壁后，加入终质量浓度为 3． 125、6． 25、12． 5 μg /mL
的蟛蜞菊乙醇提取物继续培养 72 h，以 0 μg /mL 为
对照组，每组重复 6 次。胰酶消化收集各组细胞，
PBS洗涤，加入 1 mol /L NaOH 1 mL ，80 ℃水浴 1 h
使细胞裂解。采用分光光度计测定 400 nm 波长处
的吸光度值，表示黑色素含量。
1． 6 RT-PCR 检测各组药物处理后 TYR、MITF 的
基因表达
采用 Trizol 试剂提取终质量浓度为 3． 125、
6. 25、12． 5 μg /mL 的蟛蜞菊乙醇提取物处理 72 h
后的 B16 细胞的总 RNA，以 0 μg /mL 为对照组，反
转录成为 cDNA，进行 RT-PCR 检测相关基因的表
达。采用的引物序列如下:TYR:sense:5-GGCCAG
CTTTCAGGCAGAGGTTCCT-3; anti-sense: 5-TGG
TGCTTCATGGGCAAAATCAATG-3，扩增产物:477
bp。MITF:sense:5-AGAGCATTGGCTAAAG AGAG-
3;anti-sense:5-GTTGTTGGTAAAGGTGATGG -3，
扩增产物:471 bp。β-actin:sense:5-AGAGGGAAA
TCGTGCGTGAC-3;anti-sense:5-CAATAGTGATGA
CCTGGCCGT-3，扩增产物:138 bp。扩增条件如下:
94 ℃，2 min;94 ℃，1 min，59 ℃，1 min，72 ℃，40 s
981第 2 期 梅寒芳，等．蟛蜞菊乙醇提取物促进黑色素生成及其机理的初步研究
循环 30 次;72 ℃延伸 10 min;4 ℃ 保存。扩增产物
在含有 EB的 1． 5%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下
拍照。
1． 6 统计分析
采用 SPSS13． 0 统计软件处理，采用单因素方差
分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 蟛蜞菊乙醇提取物对 B16 细胞增殖的影响
蟛蜞菊乙醇提取物在 3． 125、6． 25、12． 5 μg /mL
时，可剂量依赖性促进 B16 细胞增殖，与对照组比
较差异有统计学意义(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ;在
25、50 μg /mL时促进细胞增殖的作用逐渐下降，但
与对照组比较差异仍有统计学意义(P ＜ 0． 01) ，见
图 1。
与对照组比较:* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01。
图 1 蟛蜞菊乙醇提取物对 B16 细胞增殖的影响
Figure 1 Effect of ethanol extracts from Wedelia chinensis on
cell survival of B16 cells
2． 2 蟛蜞菊乙醇提取物对 TYR 活性及黑色素含量
的影响
蟛蜞菊乙醇提取物在 3． 125、6． 25、12． 5 μg /mL
时对体外培养的 B16 细胞黑色素含量及 TYR 活性
的影响见表 1。结果表明蟛蜞菊乙醇提取物处理细
胞后可提高 TYR活性，并促进黑色素的生成。
表 1 蟛蜞菊乙醇提取物对体外培养 B16 细胞 TYR 活性及
黑色素含量的影响
Table 1 Effect of ethanol extracts from Wedelia chinensis on
activity of tyrosinase and quantity of melanin in B16 cells
cultured in vitro(珋x ± s，n = 6)
组别
ρ /
(μg·mL －1)
黑色素含量
(A400 nm)
TYR活性
(A460 nm)
对照组 － 0． 062 ± 0． 009 0． 056 ± 0． 011
蟛蜞菊组 3． 125 0． 082 ± 0． 011* 0． 073 ± 0． 016＊＊
6． 25 0． 083 ± 0． 018* 0． 092 ± 0． 017＊＊
12． 5 0． 087 ± 0． 013＊＊ 0． 122 ± 0． 021＊＊
与对照组比较:* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01。
2． 3 蟛蜞菊乙醇提取物对黑色素合成相关基因的
影响
检测细胞在不同终质量浓度的蟛蜞菊乙醇提取
物处理后 TYR基因、MITF基因 mRNA的表达量，见
图 2、3。由图可见，蟛蜞菊乙醇提取物处理细胞后，
TYR及 MITF的表达量均剂量依赖性增高。
M:DL2000 Marker;A． 0 μg /mL;B． 3． 125 μg /mL;C． 6． 25
μg /mL;D． 12． 5 μg /mL。
图 2 蟛蜞菊乙醇提取物对 B16 细胞 TYR基因表达的影响
Figure 2 Effect of ethanol extracts from Wedelia chinensis on
TYR mRNA expression of B16 cells
M． DL2000 Marker;A． 0 μg /mL;B． 3． 125 μg /mL;C． 6． 25
μg /mL;D． 12． 5 μg /mL。
图 3 蟛蜞菊乙醇提取物对 B16 细胞 MITF基因表达的影响
Figure 3 Effect of ethanol extracts from Wedelia chinensis on
MITF mRNA expression of B16 cells
3 讨论
蟛蜞菊是一种传统中草药，最初记载于《生草
药性备要》，其来源广泛、生长迅速，民间主要用于
白喉、百日咳、发热咳嗽等疾病的治疗［6 － 7］，但能否
调控黑色素生成，还未见报道。本研究发现，蟛蜞菊
乙醇提取物在 3． 125、6． 25、12． 5 μg /mL 时，可剂量
依赖性促进 B16 细胞增殖，但当药物浓度超过 25
μg /mL时，对细胞虽仍有促进增殖作用，但促进作
用较低浓度时减弱，这可能是药物浓度超过一定范
围后，有抑制细胞生长的趋势，其确切机制还有待进
一步探讨。蟛蜞菊乙醇提取物在 3． 125、6． 25、12． 5
μg /mL浓度时，可剂量依赖性促进黑色素生成。进
一步探讨其作用机制表明，3． 125、6． 25、12． 5 μg /
mL的蟛蜞菊乙醇提取物剂量依赖性提高 TYR的活
091 广东药学院学报 第 28 卷
性及 TYR基因的表达;同时，还可剂量依赖性促进
黑色素合成过程中关键的调控因子 MITF 的表达。
该研究结果初步证明蟛蜞菊乙醇提取物在低浓度时
具有促进 B16 细胞黑色素合成的作用，作用机制可
能是通过促进 B16 细胞增殖、激活 TYR、增强 TYR
及 MITF的表达有关。TYR 和 MITF 的蛋白水平是
否升高，有待进一步验证。
随着中药现代化理论的提出和发展，用现代药
理学解释传统中药的功能主治已成为中药现代化的
前提。本文选取中药材蟛蜞菊作为研究对象，用现
代的药理学方法和分析手段发现蟛蜞菊可能具有促
进黑色素生成的作用，并初步探讨其作用机制，为蟛
蜞菊在调节黑色素生成方面的药理作用提供了初步
实验依据。
参考文献:
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究进展［J］．中药材，2005，28(4) :347 － 350．
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chinensis on three hepatotoxin-induced hepatotoxicity［J］．
Am J Chin Med，1994，22(2) :155 － 168．
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研究［D］． 北京:中国人民解放军军事医学科学院，
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究［J］． 中草药，1997，28(7) :421 － 422．
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［6］中国科学院中国植物志编辑委员会． 中国植物志:75 卷
［M］．北京:科学出版社，1979:305．
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(责任编辑:幸建华
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)
他汀类降血脂药的安全政策作出重大修改
美国 FDA于 2012 年 2 月 28 日宣布对广泛使用的他汀类降血脂药的说明书中有关用药安全的部分作出重大
修改。
他汀类降血脂药通常结合饮食与运动，帮助降低人体中不良胆固醇(即低密度脂蛋白胆固醇)。这类药品主
要包括以下品种:Lipitor(atorvastatin)、Lescol (fluvastatin)、Mevacor (lovastatin)、Altoprev (lovastatin缓释剂)、Livalo
(pitavastatin)、Pravachol (pravastatin)、Crestor (rosuvastatin)、Zocor (simvastatin)。此外还有几种复方制剂:Advicor
(lovastatin /niacin缓释剂)、Simcor (simvastatin /niacin缓释剂)、Vytorin (simvastatin /ezetimibe)等。
FDA相关官员指出，修改部分他汀类药品说明书的目的是让医疗专业人员和患者了解有关他汀类药品安全
风险的最新信息，同时使他们确信这类药品在降血脂方面继续安全有效。
有关说明书的修改主要体现在以下几个方面:
(1)删除了有关服用他汀类药品的患者需定期进行肝酶常规检查的条文。现在 FDA只是建议患者在开始服
用他汀类药品之前进行肝酶检查，以后如果临床上有需要也建议进行肝酶检查。FDA 认为他汀类药品导致肝损
伤的情况是罕见的，也是不可预期的。定期常规肝酶检查并不能有效检测和预防这一副作用。服药患者如果出
现以下肝脏方面的症状应立即向医疗人员报告:异常的疲倦、食欲不振、上腹疼痛、小便颜色加深、皮肤变黄、眼白
变黄等。
(2)有病例报告显示服用他汀类药品会引起认知方面(大脑相关)的异常，因此他汀类药品说明书将注明部
分患者会发生记忆丧失或者意识模糊的情况，但情况并不严重，一旦停止服药即可恢复正常(病情可逆)。但患者
如果出现此类症状仍应及时知会医生。
(3)有病例报告显示服用他汀类药品可能会出现血糖水平升高的情况。FDA表示，患者服用他汀类药品可能
会略微增加血糖水平及患 2 型糖尿病的风险。修改后的药品说明书提醒医疗人员和患者应注意此潜在风险。
(4)洛伐他汀(lovastatin)的说明书有新的补充。某些药品可能与洛伐他汀相互作用从而增加肌肉损伤的风
险。比如治疗 HIV感染的药品(蛋白酶抑制剂类)和治疗细菌和真菌感染的药品禁止与洛伐他汀同时使用。
同时 FDA鼓励医疗从业人员和患者报告有关他汀类药品任何可能出现的副作用。
(来源:美国 FDA政府公告，2012-02-28 夏训明编译)
191第 2 期 梅寒芳，等．蟛蜞菊乙醇提取物促进黑色素生成及其机理的初步研究